开的pM0N107341中。亲本pM0N107341是具有通过P-rrn启动子驱动的增强 的壮观霉素抗性表达盒的基于oriRi的载体。与包含OriRi的载体相同，当载体的拷贝数 低时，来自土壤杆菌的增强的16SRNA启动子（SEQIDN0 :3)尤其有用。P-rrn启动子通过 PCR从土壤杆菌菌株C58 16SrDNA分离，并与virE操纵子核糖体结合位点（RBS)融合，以 使其能够在大肠杆菌和土壤杆菌中有效翻译。PM0N107379也包含编码赋予壮观霉素抗性的 氨基糖苷-3' -腺苷酰转移酶（SEQIDN0:1)的aadA基因，该编码氨基糖苷-3' -腺苷酰 转移酶的基因也与叶绿体转运肽（SEQIDN0 :2)融合，用于将核编码的氨基糖苷-3' -腺 苷酰转移酶转运到质体中。
[0210] 实施例9
[0211] 大豆和棉花中的优良ROUNDUPREADY?种质的直接再转化
[0212] 利用本文所述的方法，优良的转基因Round-UpReady?种质可以用2个T-DNA转 化，该T-DNA编码用于壮观霉素选择的aadA基因，同时在第二T-DNA(或质粒，如果使用两 种质粒）上使用新的基因（通常称为"目标基因"），以允许与所述的aadA分离。
[0213] 比较棉花RRHex哲种子品种（07W610F)和种质对照的非转基因品种（00S04)。 种子在24°C吸胀~18小时，机器切除并机器筛分（两步）接着浮选富集外植体。在0D6M0. 3 的INO中，用土壤杆菌悬浮液接种外植体，超声处理2分钟，并温育10分钟。然后除去土壤 杆菌悬浮液，并以大约2g/容器将外植体分散于共培养容器中。将外植体置于用5ml的共 培养基（添加有50ppm的制霉菌素、lOppm的TBZ和lOOppm的壮观霉素的IN0)湿润的滤纸 上，并在大约23-25°C下、在光照的（16小时光照/8小时黑暗，光强度彡5yE)Percival培 养器中共培养3天。接着将外植体转移到具有150ppm的壮观霉素的WPM培养基上，在35°C 的光照室（16小时光照/8小时黑暗）中培养3天，然后移到28°C的光照室中（16小时光 照/8小时黑暗）。接种后6周，收获表型阳性的绿色小植物，置于用0.5g/LWPM盐（任选 包含 0? 25mg/L的IBA，以改善生根）湿润的OasisQ^塞（Smithers-OasisUSA;Kent，0H) 中，并移到温室条件下。一旦植物适应并开始生长，分析它们的CP4、GUS和脉管GUS表达 (种系转化的预测指标）。预期再转化的转基因植物是CP4+GUS+，而转化的对照植物预计为 CP4-GUS+。在下面的表22中列出转化植物的产量的分析。由于此时分析不是完全的，预期 总转化率增加。所述程序可用于再转化转基因棉花植物，其效率类似于常规的非转基因棉 花品种的转化。
[0214] 表22 :再转化的种质的转化率。
[0215]
[0216] 实施例10
[0217] 种子和/或外植体材料的灭菌
[0218] 测试了许多在切除前对种子灭菌以及在从种子切下后对外植体灭菌的技术。以15 分钟至16小时的时间间隔，检测了在真空干燥室中使用氯气对干燥外植体的切除后灭菌。 尽管真菌污染在对氯气的暴露已经超过了外植体的生存极限的处理中生长，但是污染控制 随着对氯气的更长时间的暴露而提高。
[0219] 也测试了臭氧气体处理。在PLEXIGLAS室（0SR-8臭氧发生器；OzoneSolutions， SiouxCenter，IA)中，以1-24小时的各种时间间隔将完整的种子（切除前）和干燥的外 植体（切除后）暴露于〇 3气体。使用467ppm的浓度的03。在将种子暴露于臭氧后，切下 胚材料，并测量外植体的生命力。大豆种子臭氧处理12小时或更短时间不会影响随后分离 的外植体的生命力，但在外植体中发现急剧降低的生物负荷（bioburden)。对干切的外植体 的短至1-4小时的臭氧处理降低了外植体的健康（即，活胚的数量）。
[0220] 使用200ppm活性氯的漂白溶液对完整种子的切除前灭菌进行另外的测试，接着 是在50ppm活性氯溶液中的过夜水化期（~9小时）。然后在机械切除之前，将这些种子在 层流柜中干燥（典型地为12-48小时）。也测试了对50%漂白液浸泡方案的改进，其中，首 先用70%的乙醇溶液清洗种子。立即排干乙醇（对乙醇的总暴露时间少于5秒），然后通 过在50%漂白液中处理种子3-15分钟进行50%漂白液浸泡，接着用水清洗3遍并过夜干 燥种子，使得含水量低于8%。也采用紫外线来对植物材料灭菌。
[0221] 实施例11
[0222] 种子和外植体材料的水化
[0223]测试了采用新的预培养水化/发芽策略的研究。用于此步骤的培养基的类型包括 "豆类发芽培养基"(BGM;表16)、大豆接种培养基（IN0 ;表1)和制备好的土壤杆菌对数期生 长培养物（AGR0)。土壤杆菌生长培养物在LysogenyBroth(LB，通常也称为Luria-Bertani Broth)中过夜生长至对数期，然后离心并再悬浮至660nm处的最终光密度为0.25-0. 6。用 于稀释的培养基与大豆接种培养基相同。在4°C下，将外植体浸泡在该溶液中过夜。在与相 应的水化培养基接触过程中，进行其它改变：此接触期间的各种温度和相应的培养基中的 饱和程度。测试的接触时间为0-24小时。较长的接触时间（超过4小时）中的温度为室 温（~26°C)、23°C或4°C。4小时或更短的接触时间全都在室温下测试。作为在水化过程 中用液体培养基完全浸没或基本上饱和外植体的替代方案，一些处理使用湿润的滤纸（有 足够的液体湿润，但没有饱和）。这使用以BGM或者土壤杆菌培养基润湿的滤纸来完成。再 水化在多种容器中进行，包括但不限于圆锥形离心管、刻度玻璃瓶或者PLANTC0N组织培养 容器（MPBiomedicals，Irvine，CA) 〇
[0224] 本实施例也证明了水化可以在包含如葡萄糖（IN0)和蔗糖（BGM)等各种类型的碳 水化合物的多种培养基中进行。其它碳水化合物如半乳糖也可以用于水化培养基中。
[0225] 实施例12
[0226] 延长时间存储的干切大豆外植体的转化
[0227] 干切的外植体在-20°C至4°C下存储最长达20个月，然后测试其存活力、可转化性 和活力。无论相比对照处理（处理1)的存储条件或者温度如何，外植体的存活力和总活力 似乎在所有处理组中均相似。这证明能够存储干切外植体几乎2年而没有损害。在接种4 天后测试每种处理的外植体的瞬时⑶S表达。表23显示各种处理之间分生组织特异性gus 表达的比较，以0-9级评分，0表示没有可见的表达，9表示在胚的所有3个分生组织中都大 量表达。这证明了干切的外植体不仅可以在各种条件的长期存储后存活而没有明显的活力 丧失，而且保持了对于转化的适应力。因此现在可以在非高峰时间切下大量的外植体以备 后用，这代表了在计划和实施转化研究中显著的、可能的费用节约和灵活性。
[0228] 表23 :存储时间和温度对外植体转化的影响。
[0229]
[0230] 实施例13
[0231] 合适的预接种培养（"预培养"）组合物和条件的确定
[0232] 当用土壤杆菌接种用于转化时，干切的外植体可能仍处于半休眠状态。因此，开发 了一种在土壤杆菌接种前刺激干切外植体的代谢活性的方法，用于增强它们的转化能力。 即，通过操纵干外植体的生物学，可以使每个外植体中的种系阳性事件的百分比增加2-10 倍。
[0233] 在23°C和/或28°C温度下，以及在1-5天的不同光照/黑暗条件下，测试几种培 养基组合物-BGM(表16)、IN0 (表1)或0R(表24)增强转化能力的能力。预培养步骤后， 将外植体集中在一起，然后根据实施例1中所述的方法用土壤杆菌培养物接种。在外植体 上进行的瞬时GUS表达试验表明在共培养2天和4天后预培养处理中的GUS活性增强。
[0234] 在某些预培养实验中，由于真菌感染导致植物损失，但是与未预培养的干切的外 植体相比，在BGM润湿的滤纸上、23°C、黑暗中预培养5天的干切的外植体的总转化率似乎 是最高的。由于真菌污染导致的损失可以通过在预培养和/或共培养步骤中使用诸如各为 大约1%的BRAVO75和克菌丹50的抗真菌剂来减轻。用CP4探针对本实施例中产生的植 物进行的Southern印迹和INVADER分析证实了这些植物的转基因性质。
[0235] 表24 :大豆器官生成（0R)培养基
[0236]
[0237] 高压灭菌后添加：
[0238] 脯氨酸（2. 5m储备液）19. 2ml
[0239]TSG/0R激素储备液 40. 0ml
[0240] 表25:干外植体预培养的影响；使用pM0N10343的转化率
[0241]
[0243] 重复研究来比较两个构建体：pM0N101343,其包含1个含有提供草甘膦抗性的CP4 基因和OriV复制起点的T-DNA;和pM0N107350,其包含1个在载体骨架上含有提供草甘膦 抗性的CP4基因和OriR复制起点（US20070074314)的T-DNA。如表26所示，与未预培养的 干外植体的转化率相比，干外植体的预培养再次提高了转化率。
[0244] 表26 :对干切外植体的预培养的另外的研究。
[0245]
[0246] 如表27所示，当在使用机器人系统自动除去和添加的液体再生培养基（除琼脂凝 胶外，表12的培养基）中培养外植体时，预培养的干切外植体也产生了较高的转化率。具 有预培养步骤使用液体再生培养基的TF似乎甚至更高。液体培养基中的湿切的外植体似 乎由于污染而具有低TF。
[0247] 预培养令人惊奇地增加了转化能力并且提高了转化一致性。这样的提高对于减少 工业规模生产转基因大豆植株的生产过程中的变异性是关键的。
[0248] 表27 :干切的外植体的预培养；固体和液体培养基的比较。
[0249]
[0250] 实施例14
[0251] 使用干大豆外植体和壮观霉素选择产生转基因大豆植物
[0252] 干的活种子（适当存储的高质量大豆种子具有大约10-12%的内部含水量）用无 菌水或次氯酸钠溶液（Oppm至~30,OOOppm的活性氯，包括50ppm-200ppm的活性氯）冲洗 3-20分钟。然后排出液体。这个过程提高内部含水量到大约16%。在此简短的表面清洗 步骤后，在商业种子干燥器中用除湿空气流（温度控制到大约60-90°F)降低种子的内部 含水量到低于8%。
[0253] 在需要的存储后，将外植体再水化用于转化。这一步骤中所用的培养基类型可以 不同，包括"豆类发芽培养基"（BGM;表16)、大豆接种培养基（IN0 ;表1)和制备的对数期 土壤杆菌生长培养物（AGRO)。土壤杆菌生长培养物在LysogenyBroth(LB，通常也称为Luria-BertaniBroth)中生长过夜达到对数期，然后离心并再悬浮至在660nm处的最终光 密度为0. 25-0. 6。用于稀释的培养基与大豆接种培养基一样。再水化温度和持续时间也可 以不同，某些实验中将外植体在4°C浸泡于这些溶液中的一种中过夜。在接触相应水化培养 基的持续时间、接触过程中的各种温度和相应培养基的饱和程度方面进行其它变化。测试 的接触时间为0-24小时。较长接触时间（超过4小时）的温度是室温（~26°C)、23°C或 4°C。4小时或少于4小时的接触时间都在室温下测试。作为在水化过程中用液体培养基 完全浸没或基本上饱和外植体的替代，一些处理使用湿润的滤纸（有足够的液体湿润，但 没有饱和）。这用以BGM或者土壤杆菌培养基润湿的滤纸来完成。再水化在多种容器中进 行，包括但不限于锥形离心管、刻度玻璃瓶或者PLANTC0N组织培养容器（MPBiomedicals， Irvine,CA) 〇
[0254] 再水化后，在适合的土壤杆菌培养物的存在下，对外植体进行简短的超声处理。共 培养和后续步骤在大约23-25°C的温度下、在光照Percival培养箱中进行2-5天（16小时 光照，8小时黑暗，光强度为大约5yE-200yE)，且可以在最高大约35°C下进行。已知光促 进基因从土壤杆菌转移到植物细胞。在再水化、共培养步骤过程中和/或共培养后，以15 毫克/升-1000毫克/升的浓度应用作为选择剂的壮观霉素。
[0255] 如表28所示，使用以下构建体常规回收表型阳性的苗（植物）：pM0N96999,其包 含1个含有addA基因和OriV复制起点的T-DNA;或构建体pM0N101343,其包含1个含有 CP4基因和OriV复制起点的T-DNA。在存在壮观霉素的情况下，"表型阳性"的意思是苗为 绿色且坚实，而表型阴性的苗如果伸长，则较弱且变白（白色）。壮观霉素或草甘膦以表28 所示的浓度在再生培养基（固体或者液体）中使用。
[0256] 表28 :使用草甘膦或壮观霉素作为选择剂的干大豆外植体的转化率。
[0257]
[0258] 壮观霉素也作为用于干切大豆胚转化的选择剂，使用以下条件：在IN0培养基中 水化1小时，在IN0、150ppm壮观霉素中共培养4天，在固体或液体WPM(表2,加入或不加琼 脂）上培养。可以使用23-25或28°C、最高大约35°C的温度。在土壤杆菌接种8-10周后， 收获表型阳性的苗，并在含有150ppm壮观霉素的固体BRM(参见实施例2)上诱导生根。在 两个不同的研究中，获得25. 05 %和19. 27 %的非常高的转化率。
[0259] 实施例15
[0260] 用干大豆胚、壮观霉素和液体培养基产生转基因大豆植物
[0261] 在这些研究中，外植体在开始时水化并最终在上述具有液体覆盖层的WPM固体培 养基或WPM液体培养基上再生。在接种6周后将所有外植体转移到含有〇aslsK)Wedge System(Smithers-〇asisUSA;Kent，0H)和简化液体培养基（含有 0? 25 毫克 / 升IBA的 0? 5 克/升WPM)的浅盘上。2-4周后，获得生根和发芽的R。植物。在所有的研究和处理中，在 如表29所示的相应培养基中进行外植体的初始水化1小时。除了草甘膦被150ppm的壮观 霉素代替外，液体培养基与表2中相同。在液体覆盖处理中，使用固体和液体培养基；当它 们在组织培养过程中在如表30所示的特定时间置于固体培养基上时，将液体培养基分配 在外植体的顶部。这作为一种类型的培养基更新来进行，并且不需要将外植体从旧培养基 转移到新培养基。在对照处理中，将外植体表面接种于固体WPM培养基上（表2)。除了草 甘膦被150ppm的壮观霉素代替外，苗在如上所述的固体BRM培养基上收获并生根。
[0262] 表29 :给定水化条件下的转化率。
[0263]
[0264] 表30:液体覆盖时间安排
[0265]
[0266] 实施例16
[0267] 使用干大豆胚、壮观霉素、通过预培养步骤和转移整个再生外植体来产生转基因 大豆植物
[0268] 在这些研究中，如实施例13,使用预培养步骤（5天，23°C，黑暗，在BGM中）。在预 培养步骤前，干切的外植体也在IN0培养基上进行水化1小时。在共培养期之后，将大约12 毫升包含150ppm壮观霉素的液体WPM直接分配到共培养PLANTCON中，4天后将外植体表 面接种于包含150ppm壮观霉素的固体WPM上。在本实施例中，在再生的大约第4周鉴别表 型阳性的绿苗，并从WPM再生培养基转移到包含（)as丨S_vWedgeSystem(Smithers_Oasis USA;Kent，OH)和简化液体培养基（含有0. 25毫克/升IBA的0. 5毫克/升WPM)的浅盘 中。2-4周后，获得生根和发芽的R。植物。总之，这些研究中的预培养也提高了TF% (表 31)。下面（表31)显示的质量事件百分比是指通过Invader?试验证明存在1-2个拷贝的 目标基因（⑶S)和标记基因（aadA)的转基因事件的比例。评估的无标记TF(mTF)是指没 有标记基因的事件的百分比。
[0269] 表31 :从整个再生的外植体观察到的转化率和质量。
[0270]
[0271]
[0272] 实施例17
[0273] 使用存储的干大豆胚、壮观霉素、通过预培养步骤和整个再生外植体的转移产生 转基因大豆植物
[0274] 在本实施例中，使用存储3个月的干外植体，且对干切的外植体在IN0中进行1 小时的水化步骤。预培养在23°C黑暗条件下、在含有50ppm的制霉菌素和lOppm的TBZ杀 真菌剂的BGM中进行5天。将TDZ和硫辛酸都加到接种物和共培养基（IN0)中。构建体 PM0N107379是包含oriRi和aadA基因的传统2T载体，并进行共培养5天。在共培养后，将 外植体表面接种于固体WPM上，然后转移到具有简化液体培养基（含有0. 25毫克/升IBA 的0.5克 / 升WPM)的 WedgeSystem(Smithers_OasisUSA;Kent，0H)中。如表 32所示，预培养干外植体提高了TF。因此，存储3个月的干外植体的表现类似于新切下的 干外植体。进一步，将溶解在DMS0中的制霉菌素（50ppm)和噻菌灵（lOppm)加入到IN0共 培养基中（1.0mlDMS0/升IN0)改善了外植体的健康，这可能是通过控制通常在种子之中 和之上发现的酵母和真菌而实现的，因此在进行大量和/或自动化组织培养时是有用的手 段。
[0275] 表32 :预培养对存储的干外植体的TF(% )的影响。
[0276]
[0277]
[0278] 氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺
[0279] 根据本发明的公开内容，可以在不进行过多实验的情况下，制备和实施本文公开 的和要求保护的全部组合物和方法。尽管本发明的组合物和方法已经在上面示例性的实施 方案中详述，但是本领域的技术人员应当明白，在不背离本发明的真正概念、精神和范围的 情况下，可以对本文所述的组合物、方法和方法的步骤或步骤的次序进行变化、改变、修改 和改造。更加特别的是，应当明白，在化学和生理学上相关的某些试剂可以代替本文所述的 试剂，而仍可获得相同或相似的结果。对于本领域的技术人员来说显而易见的所有这些类 似的替代物和修改都被认为落入由所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念之 内。
[0280]参考f献
[0281] 本文特别引入以下文献作为参考，其提供补充本文所述信息的示例性的程序上的 或其它方面的细节。
[0282] 美国专利4, 761，373 ;美国专利4, 810, 648 ;美国专利5, 013, 659 ;美国专利 5, 015, 580 ;美国专利5, 073, 675 ;美国专利5, 094, 945 ;美国专利5, 141，870 ;美国专 利5, 164,310 ;美国专利5, 217, 902 ;美国专利5, 229, 114 ;美国专利5, 273, 894 ;美国专 利5, 276, 268 ;美国专利5, 322, 938 ;美国专利5, 352, 605 ;美国专利5, 359, 142 ;美国专 利5, 362, 865 ;美国专利5, 378, 824 ;美国专利5, 463, 175 ;美国专利5, 512, 466 ;美国专 利5, 512, 466 ;美国专利5, 538, 880 ;美国专利5, 543, 576 ;美国专利5, 550, 318 ;美国专 利5, 561，236 ;美国专利5, 563, 055 ;美国专利5, 591，616 ;美国专利5, 605, 011 ;美国专 利5, 608, 149 ;美国专利5, 627, 061 ;美国专利5, 633, 435 ;美国专利5, 633, 437 ;美国专 利5, 637, 489 ;美国专利5, 646, 024 ;美国专利5, 689, 041 ;美国专利5, 693, 512 ;美国专 利5, 731，179 ;美国专利5, 750, 876 ;美国专利5, 767, 366 ;美国专利5, 824, 877 ;美国专 利5, 850, 019 ;美国专利5, 869, 720 ;美国专利5, 914, 451 ;美国专利5, 958, 745 ;美国专 利5, 981，834 ;美国专利5, 981，840 ;美国专利5, 985, 605 ;美国专利5, 998, 700 ;美国专 利6, 011，199 ;美国专利6, 040, 497 ;美国专利6, 072, 103 ;美国专利6, 080, 560 ;美国专 利6, 140,075 ;美国专利6, 166,292 ;美国专利6, 171,640 ;美国专利6, 225, 105 ;美国专 利6, 228, 623 ;美国专利6, 265, 638 ;美国专利6, 271，443 ;美国专利6, 380, 462 ;美国专 利6, 380, 466 ;美国专利6, 384, 301 ;美国专利6, 414, 222 ;美国专利6, 426, 447 ;美国专 利6, 444, 876 ;美国专利6, 459, 018 ;美国专利6, 476, 295 ;美国专利6, 483, 008 ;美国专 利6, 489,