溶栓酶qk基因及含有该基因的重组表达载体、重组菌及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种溶栓酶QK基因及含有该基因的重组表达载体、重组菌及应用，属 于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 溶栓酶QK是一种来源于枯草杆菌的丝氨酸蛋白酶，类似于日本传统发酵食品一一 纳豆激酶。研究表明，溶栓酶QK具有较强的纤溶活性，是一种潜在的溶栓药物。与其他溶栓 药物相比，溶栓酶QK在肠道中活性相当稳定，能够专一溶解血栓，对纤维蛋白原没有降解 活性，大量使用不会引起出血，可以预防和辅助治疗一下病症：脑血栓、脑梗塞、心肌梗塞、 血栓后遗症、血栓静脉炎、脉管炎等，具有体内作用时间长、无毒副作用等优点。
[0003] 目前，溶栓酶QK主要来源于野生枯草芽孢杆菌发酵的纳豆、豆豉等，但是纳豆、豆 豉的风味还不能被广泛接受，此外，从发酵液中分离纯化出的溶栓酶QK通常活性较低、生 产成本高，进一步限定了溶栓酶的开发和利用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了克服现有溶栓酶活性低、生产成本高的缺陷，提供一种能够 高效表达活性较高的溶栓酶QK的溶栓酶QK基因及含有该基因的重组表达载体、重组菌及 应用。
[0005] 为实现上述目的，首先，本发明提供一种溶栓酶QK基因，其核苷酸序列或核苷酸 序列的互补链如SEQ ID NO: 1所示。
[0006] 本发明所提供的溶栓酶QK基因是将原始溶栓酶QK核酸序列通过套叠 PCR扩增优 化得到，其中套叠 PCR所用引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、Q ID NO:28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31所示。通过套叠 PCR优化后的溶栓酶QK基因序列 可以更好地被毕赤酵母GS115识别，有助于目的蛋白的表达。
[0007] 本发明还提供了上述溶栓酶QK基因在制备溶栓酶QK及相关药物中的应用。
[0008] 第二，本发明提供了一种含有溶栓酶QK基因的重组载体，由pHBM905A载体和核苷 酸序列如SEQ ID NO: 1所示的溶栓酶QK基因经过Cpo I和Not I酶切后重组而成。
[0009] 本发明还提供了上述含有溶栓酶QK基因的重组载体在制备溶栓酶QK及相关药物 中的应用。
[0010] 第三，本发明提供了一种表达溶栓酶QK的重组菌，是上述含有溶栓酶QK基因的重 组载体通过化学转化的方法导入毕赤酵母GS115中所得到的重组菌。含有重组载体的毕赤 酵母重组菌具有强有力的乙醇氧化酶基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达。
[0011] 本发明还提供了上述表达溶栓酶QK的重组菌在制备溶栓酶QK及相关药物中的应 用。
[0012] 第四，本发明提供了一种溶栓酶QK的制备方法，挑取表达溶栓酶QK重组菌的单菌 落接种至含BMGY的摇瓶中，置于摇床中培养，生长至0D_为20~30,离心后将菌体转接至 含BMMY的培养基中，再置于摇床中进行诱导培养，每隔24h加入甲醇，诱导培养后离心发酵 液，上清即为含有溶栓酶QK的粗酶液，经纯化得到溶栓酶QK。
[0013] 本发明还提供了上述溶栓酶QK的制备方法在制备溶栓酶QK及相关药物中的应 用。
[0014] 针对本发明的设计原理作出如下说明
[0015] 因为毕赤酵母GS115对基因序列具有一定的密码子偏爱性，因此常规方法得到的 基因序列表达蛋白质的量并不高。而套叠 PCR技术可以将序列进行优化，从而解决这个问 题。套叠 PCR技术，又称重叠区扩增基因拼接法（gene splicing by overlap extension， gene SOEing)，是利用PCR技术在体外进行有效的基因重组和定点突变，而且不需要内切酶 消化和连接酶处理。该技术使用简易，可利用这一技术很快获得其他依靠内切酶消化方法 根本难以做到的产物。SOEing法的基本原理是向PCR产物内掺入一段新的、在原模板内不 存在的序列。引物只需与其模板有效结合而不必完全匹配，特别是5'端序列。任何与原模 板不匹配的碱基都将掺入到PCR产物中，这为创造定点突变提供了简便易行的方法。
[0016] 本发明的有益效果，提供了一种溶栓酶QK基因、及由其构建的重组表达载体、重 组菌以及应用，本发明通过套叠 PCR技术优化得到的溶栓酶QK基因序列可以更好地被毕赤 酵母GS115识别，同时选用pHBM905A载体与优化后的溶栓酶QK基因构建形成新的重组表 达载体和制备表达蛋白的重组菌，最终获得酶活性高的溶栓酶QK。该方法操作简便，降低了 生产成本，具有更好的实用性。
【附图说明】
[0017] 图1为套叠 PCR合成优化后的溶栓酶QK基因的原理图。
[0018] 图2为套叠 PCR合成优化后溶栓酶QK基因琼脂糖凝胶电泳照片。
[0019] 图3为溶栓酶QK表达载体重组质粒琼脂糖凝胶电泳照片。
[0020] 图4为琼脂糖一纤维素平板法筛选高表达溶栓酶QK重组菌照片。
[0021] 图5为表达溶栓酶QK重组菌诱导不同时间梯度后的溶栓酶QK SDS-PAGE电泳图 照片。
【具体实施方式】
[0022] 以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。下述实施例中所用方法如无特 别说明均为常规方法，所有引物合成及测序工作均由上海生工完成。
[0023] 实施例1溶栓酶QK基因的优化
[0024] 在GenBank中原始溶栓酶QK的氨基酸序列的编号为AEV91244. 1，在不改变溶栓酶 QK溶栓活性的前提下，按照毕赤酵母密码子偏爱性利用DNAW0RKERS工具对原始溶栓酶QK 基因序列进行优化。优化后的核酸序列与原始核酸序列相比，261个核酸发生了改变，核苷 酸的同源性为75. 42%，同时为了使溶栓酶QK在毕赤酵母中高效稳定地分泌表达，优化后 的溶栓酶QK基因少了编码5'端信号肽序列的28氨基酸。
[0025] 实施例2优化后溶栓酶QK基因的合成
[0026] 根据优化的序列设计基因合成的引物，设计的引物序列见表1，其中每条引物的长 度在39~60nt之间，相邻引物之间有17~20nt重叠序列，Tm值为55~