专利名称：一种γ-聚谷氨酸的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种T"聚谷氨酸的制备方法，具体地说，涉及一种利用枯草芽孢杆菌PGA-7 CCTCC M 206102进行摇瓶发酵制备y-聚谷氨酸的方法。
技术背景Y-聚谷氨酸(Poly"glutamic acid， y-PGA)是一种可由微生物大量生物合成的氨基酸聚 合物，它由D-型或Z-型谷氨酸通过);-酰胺键连接而成。微生物合成的y-PGA是一种水溶性的可 生物降解的生物高分子，通常它由5，000个左右谷氨酸单体组成，相对分子质量一般在10万 IOO万。y-PGA可以制成不同的分子量应用于各种不同领域。如(1) Y-PGA具食品安全性， 可作为膳食纤维、保健食品、食品增稠剂、安定剂或作为化妆品用的保湿剂；(2) Y-PGA 可作成水胶,具有极高吸水能力，可吸水达3， 500倍，极适合于农业土壤和环保产品之应用；(3) Y-PGA可以转化成各种不同的金属盐类，具不同pH值，并有特殊多阴离子表面特性，适用于 组织培养和许多其它食品、化妆品、生物医学和工业应用等。随着从廉价资源生产可生物降 解的多聚物用量的增加，以及Y-PGA许多新的领域的拓展，对Y-PGA生物合成的兴趣又重新 振兴起来，目前，世界上有很多研究小组在从事Y-PGA生物合成的研究。Y-PGA生物合成的研究主要集中在芽孢杆菌属细菌的5. a"f/jrac^禾n及//c/2ew/onm、 ATCC 9945a、及//c/zem/w7m\y ATCC 9945 (以前叫5. ^Zm7^ ATCC9945)等菌株上。根据细 胞生长的营养要求是否需要L-谷氨酸，可以把Y-PGA产生菌分为两大类， 一类是培养时需要 L-谷氨酸才能积累y-PGA，这类菌种主要有及a"Arac&、及MR-141、及//c/zem/ora^ ATCC 9945、及//c/zem/ora yATCC 9945a、 5. IF03335和及犯6rife F-2-01等，此类菌种的？PGA产量较高， 一般为15 35g/L，但是原料的相对成本较高； 一类是培养时不需要 L-谷氨酸也能积累？PGA,如及ra6"7^ 5E、及w6"fc var. polyglutamicum、丑 //c/ em/orm^ A35、5. TAN^ 4等，不需谷氨酸的，PGA产生菌，y- PGA产率较低， 一般为5 10g/L，但由于可用廉价原料代替谷氨酸，因此在工业生产中有其实际应用意义。CN1932007公开了一种利用枯草芽孢杆菌(5a"7/w w&"fo) PGA-7 CCTCC M 206102 作为发酵菌株进行摇瓶发酵制备Y-聚谷氨酸的工艺，采用该工艺的发酵培养基配方，Y-PGA 产率达18g/L。申请人在对上述发明的进一步研究中，发现采用同一 Y-PGA产生菌，通过改 良发酵配方，可以提高"PGA的产率，使其接近需要谷氨酸类产生菌的？PGA产量，同时又 降低生产成本，在工业化生产中发挥巨大优势，由此产生本发明。 发明内容本发明的目的是提出一种经改进的利用枯草芽孢杆菌(5a"7/^wto'fc)PGA-7 CCTCC M206102作为发酵菌株进行摇瓶发酵制备Y -聚谷氨酸的新方法。本发明所采用的微生物菌株是经选育的Y-聚谷氨酸(Y-PGA)产生菌--枯草芽孢杆菌 (5ad〃附PGA-7，该菌株于2006年9月30日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC),编号为CCTCC M 206102 。该菌株以下简称3flc///w to7& CCTCC M 206102。 中国典型培养物保藏中心的联系资料如下电话027-8768 2319 传真(027)8788 3833 E-mail:cctcc@whu.edu.cn 地址武汉武 汉大学邮编430072。该菌株的菌学特性和保藏情况均已记载于CN1932007之中。本发明所提供的Y -聚谷氨酸的制备方法，用枯草芽孢杆菌(^/"7/w PGA-7 CCTCCM206102做发酵菌株进行摇瓶发酵，其具体工艺过程如下(1) 斜面菌种活化将培养好的保藏斜面种(5ac!7/ws sw/)"fc PGA-7 CCTCC M 206102) 划线于新配制的LB斜面上，LB斜面组成如下蛋白胨8 12g，酵母膏3 8g， NaCl 9 llg，琼脂15 20g，自来水溶解后定容至1L，调pH值至6.8 7.2, 33 38。C培养12 24小时，再冷藏于4'C 1~5天；(2) 菌种的液体活化将上述活化斜面上约lcm2面积的菌种刮下，接种于液体活化培养基中，液体活化培养基组成如下柠檬酸15 20g， NH4Cl或(NH4)2SO4 6 10g，蛋白胨5 7g，酵母粉15 20g，玉米浆10 15g，NaC13 5g，自来水溶解后定容至1L，调pH值至6.0-7.0， 液体活化培养基装于250mL三角瓶中，三角瓶装量为25mL，于32 37。C往复式摇床振荡培 养18 24小时，摇床转速为80 110r/m，冲程为65 75mm;(3) 摇瓶发酵按5%接种量，取2mL培养好的液体活化种，接入发酵培养基中，发酵 培养基成份如下葡萄糖或甘油或柠檬酸30 40g，果糖0 4g， NH4C112 20g，蛋白胨10 14g，酵母粉30 45g，玉米浆20 30g, NaCl 5 8g，自来水溶解后定容至1L，所述的发酵 培养基于灭菌前调pH值至6.2~6.5，可用NaOH及HC1调节，用500mL三角瓶装，装量40mL; 于32 37。C，冲程65 80mm，转速90 130r/m的往复式摇床振荡培养60 84小时，停止 发酵；(4) 发酵完毕的摇瓶发酵醪液经提取工艺即得含Y-聚谷氨酸的制品。 提取含Y-聚谷氨酸的制品的工艺为常规工艺， 一般包括对发酵液离心去除菌体，取其上清液用乙醇沉淀提取等步骤。发酵完毕的摇瓶发酵醪液可通过以下方法分析测试发酵醪液中的Y-PGA含量 对发酵液离心去除菌体，取上清液测谷氨酸单体的含量；将上清液与6mol/L的盐酸按l :1 (体积比)加入玻璃水解管中，真空封口后于110'C水解24h，然后测定水解液中谷氨酸总 量；两次测得的谷氨酸之差为Y-PGA的含量。上述对谷氨酸的分析方法可以采用氨基酸自动分析仪，或高效液相色谱仪(HPLC),或纸 层析方法进行测定。纸层析方法如下取10uL离心发酵上清液或它的水解液点样，层析过夜， 用O. 5%茚三酮丙酮溶液显色，65。C显色10min，剪下斑点用l. 0g/L硫酸铜洗脱液(CuS04 *5H20:75。/0 乙醇=2:38) 5mL浸泡20min以上至纸条无色，Amax二570nm测其OD值，与谷氨酸标准曲线比较 算出相应含量，再计算发酵醪液含Y -PGA量。本发明利用枯草芽孢杆菌(3aa'〃w^W"fo) PGA-7CCTCCM 206102作为发酵菌株，采 用本方法中提出的优选的发酵培养基配方，进行摇瓶发酵，在最佳摇瓶发酵工艺条件下，产 Y-PGA最高可达27.3g/L。本发明的发酵原料成本低，Y-PGA的产率高，与现有技术比较具有 成本上优势，因而更具有工业化应用前景。
具体实施方式
下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。下面的实施例中用到的斜面种采用如下方法培养Sac"/w ra6rifo PGA-7 CCTCC M 206102划线于新配制的保藏斜面上，保藏斜面组成见各实施案例，33'C培养17小时，再冷藏于4'C冰箱备用。实施例一取4r冰箱内保藏1天的斜面种保藏斜面培养基的组成(g/L):蛋白胨8， NaCl 11， 酵母膏3，琼脂20， pH7.0，用接种针将上述斜面上约lcm2面积的菌种刮下，转接到新配置的种子液体活化培养基中液体活化培养基组成(g/L):符檬酸15、 NH4C18、蛋白胨7、酵 母粉15、玉米浆15、NaC13，自来水溶解后定容至1L，调pH值至6.5，液体活化培养基装 于250mL三角瓶中，三角瓶装量为25mL，于32。C往复式摇床振荡培养18小时，摇床转速 为110r/m，冲程为75mm。再按5%接种量转接入发酵培养基中，发酵培养基的组成如下葡 萄糖40g、 NH4C1 12g、蛋白胨14g、酵母粉38g、玉米浆30g、 NaCl 5g，自来水溶解后定容 至1L，并以NaOH及HCl调节培养基的pH值(灭菌前)为6.2， 120。C灭菌20分钟。发酵 培养基装于500mL三角瓶中，装量40mL，于76mm冲程、转速130r/m往复式摇床振荡培养， 经32'C恒温培养84小时后，摇瓶发酵完毕后，发酵液采用20， 000转/分钟离心10分钟，用纸 层析法测定Y -PGA含量。采用该方法摇瓶发酵产Y -PGA可达到21.0g/L，无多糖等副产物。 实施例二取4'C冰箱内保藏3天的斜面种保藏斜面培养基的组成(g/L):蛋白胨12， NaC19， 酵母膏8，琼脂16， pH6.8，用接种针将上述斜面上约lcm2面积的菌种刮下，转接到新配置的种子液体活化培养基中液体活化培养基组成(g/L):柠檬酸18、 NH4C18、蛋白胨5、酵 母粉20、玉米浆IO、 NaC14.5，自来水溶解后定容至1L，调pH值至6.0，液体活化培养基 装于250mL三角瓶中，三角瓶装量为25mL，于34。C往复式摇床振荡培养22小时，摇床转 速为80r/m，冲程为65mm。再按5%接种量转接入发酵培养基中，发酵培养基的组成如下 甘油35g、果糖2g、 NH4C120g、蛋白胨10g、酵母粉45g、玉米浆28g、 NaCl 7g，自来水溶 解后定容至1L，并以NaOH及HCl调节培养基的pH值(灭菌前)为6.3， 120'C灭菌20分 钟。发酵培养基装于500mL三角瓶中，装量40mL，于65mm冲程、转速90r/m往复式摇床振荡 培养，经35'C恒温培养72小时后，摇瓶发酵完毕后，发酵液采用20, 000转/分钟离心10分钟， 用纸层析法测定Y-PGA含量。采用该方法摇瓶发酵产y-PGA可达到24.6g/L，不产生多糖等 副产物。实施例三取(C冰箱内保藏3天的斜面种保藏斜面培养基的组成(g/L):蛋白胨IO， NaCllO, 酵母膏5，琼脂18， pH7.2，用接种针将上述斜面上约1 cm2面积的菌种刮下，转接到新配置的种子液体活化培养基中液体活化培养基组成(g/L):柠檬酸20、 (NH4)2S048、蛋白胨6、 酵母粉17、玉米浆13、NaC15，自来水溶解后定容至1L，调pH值至7.0，液体活化培养基 装于250mL三角瓶中，三角瓶装量为25mL，于37。C往复式摇床振荡培养24小时，摇床转 速为95r/m，冲程为70mm。再按5%接种量转接入发酵培养基中，发酵培养基的组成如下 柠檬酸30g、果糖4g、 NH4C116g、蛋白胨12g、酵母粉30g、玉米浆20g、 NaCl 8g，自来水 溶解后定容至1L，并以NaOH及HC1调节培养基的pH值(灭菌前)为6.5, 12(TC灭菌20 分钟。发酵培养基装于500mL三角瓶中，装量40mL，于80mm冲程、转速110r/ra往复式摇床 振荡培养，经37'C恒温培养60小时后，摇瓶发酵完毕后，发酵液釆用20， 000转/分钟离心10 分钟，用纸层析法测定Y-PGA含量。采用该方法摇瓶发酵产Y-PGA可达到27.3g/L,且不产 生多糖等副产物。
权利要求
1.一种γ-聚谷氨酸的制备方法，用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7CCTCC M206102做发酵菌株进行摇瓶发酵，其工艺过程如下(1)斜面菌种活化将培养好的保藏斜面种(Bacillus subtilis PGA-7CCTCC M206102)划线于新配制的LB斜面上，LB斜面培养基组成如下蛋白胨8～12g，酵母膏3～8g，NaCl9～11g，琼脂15～20g，自来水溶解后定容至1L，调pH值至6.8～7.2，33～38℃培养12～24小时，再冷藏于4℃1～5天；(2)菌种的液体活化将上述活化斜面上约1cm2面积的菌种刮下，接种于液体活化培养基中，液体活化培养基组成如下柠檬酸15～20g，NH4Cl或(NH4)2SO46～10g，蛋白胨5～7g，酵母粉15～20g，玉米浆10～15g，NaCl 3～5g，自来水溶解后定容至1L，调pH值至6.0～7.0，液体活化培养基装于250ml三角瓶中，三角瓶装量为25ml，于32～37℃往复式摇床振荡培养18～24小时，摇床转速为80～110r/m，冲程为65～75mm；(3)摇瓶发酵按5％接种量，取2ml培养好的液体活化种，接入发酵培养基中，发酵培养基成份如下葡萄糖或甘油或柠檬酸30～40g，果糖0～4g，NH4Cl 12～20g，蛋白胨10～14g，酵母粉30～45g，玉米浆20～30g，NaCl 5～8g，自来水溶解后定容至1L，所述的发酵培养基于灭菌前调pH值至6.2～6.5，用500ml三角瓶装，装量40ml；于32～37℃，冲程65～80mm，转速90～130r/m的往复式摇床振荡培养60～84小时，停止发酵；(4)发酵完毕的摇瓶发酵醪液经提取工艺即得含γ-聚谷氨酸的制品。
全文摘要
本发明提供一种γ-聚谷氨酸的制备方法，该方法用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7 CCTCC M 206102做发酵菌株对发酵培养基进行摇瓶发酵以制备γ-聚谷氨酸，其工艺过程包括斜面菌种活化、菌种的液体活化、摇瓶发酵和摇瓶发酵醪液提取。本发明采用由多种有机氮源和无机氮源相组合的优选的发酵原料，在最佳摇瓶发酵工艺条件下，产γ-PGA最高可达27.3g/l，具有良好的工业化应用前景。
文档编号C12P13/00GK101402977SQ20081002718
公开日2009年4月8日 申请日期2008年4月2日 优先权日2008年4月2日
发明者静 冯, 施庆珊, 李诚斌, 欧阳友生, 疏秀林, 谢小保, 陈仪本 申请人:广东省微生物研究所