一种筛选橡胶树增产刺激剂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种筛选橡胶树增产刺激剂的方法。
【背景技术】
[0002] 橡胶树（Hevea brasiliensis Muell-Arg)属大戟科橡胶属，是重要的热带经济作 物。橡胶树树皮被定期开割，胶乳（细胞质）从割断处排出，经加工成为天然橡胶。目前橡 胶树所产的天然橡胶占全世界天然橡胶总产量的99%以上，与石油、煤炭、铁矿石并列为四 大工业原料，是重要的战略物资。
[0003] 应用化学药剂调控技术促进橡胶树的产胶和排胶技术，是提高橡胶树生产力重要 技术，也是橡胶生产和理论研宄的重要内容。传统的橡胶树增产刺激剂筛选方法是将药剂 涂抹于成龄树皮，再对胶树进行割胶测产，以确定该药剂的增产效果。橡胶树属高大乔木， 每亩种植约30株，其经济寿命长达40年。该方法存在如下显著缺点：①占地面积大，试验 成本高。在验证化学药剂对橡胶树的增产效果试验时，需要大面积的成龄树林段，需耗费大 量人力物力，导致试验成本过高。②一些药剂可能对胶树有伤害作用，会导致胶树损失经济 价值；③环境因素难控制。试验在大田中进行，易受到季节、气候、植株间差异等环境因素的 影响，往往造成试验重复性不好。④试验周期长。橡胶树从种植至能够开割，至少需7年时 间。这些缺点限制了橡胶树化学药剂规模化筛选。迄今为止仅对茉莉酸、乙烯利等少数几 种化学试剂进行了割胶增产效果试验，而对于大量其它化学药剂的增产效果由于试验条件 所限尚未能得到验证，制约了橡胶树增产刺激剂筛选的效率。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种筛选橡胶树增产刺激剂的方法，使得所述 方法能够缩短筛选时间、简化筛选条件，并使得筛选结果重复性好。
[0005] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] -种筛选橡胶树增产刺激剂的方法，包括：
[0007] 以橡胶树古铜期芽条的茎段或叶柄为外植体，消毒后将外植体切段分别接种于对 照培养基和添加有待检测化学试剂的筛选培养基，24-28°C暗条件下培养60-100d，然后统 计对照培养基和筛选培养基愈伤组织中乳管细胞分化频率，以筛选培养基愈伤组织中乳管 细胞分化频率显著高于对照培养基愈伤组织中乳管细胞分化频率为判断标准，筛选出可以 作为橡胶树增产刺激剂的待检测化学试剂；
[0008] 其中，所述对照培养基为MS培养基附加2, 4-0、6-84、嫩4、蔗糖、植物凝胶，？!1值为 5. 8-6. 2 ;所述筛选培养基为对照培养基附加待检测化学试剂。
[0009] 本发明针对现有橡胶增产刺激剂筛选方法存在耗时长、成本高、重复性差等缺陷， 通过细胞工程技术，以特定的培养基进行定向乳管细胞的诱导培养，然后加入待检测的化 学试剂来影响这种诱导培养效果，以其分化频率作为判断标准来快速筛选橡胶增产刺激 剂。
[0010] 作为优选，所述对照培养基中2, 4-D、6-BA、NAA、蔗糖、植物凝胶浓度为：2, 4-D l-5mg/L，6-BA 0· 5-2mg/L，NAA 0· 5-4mg/L，蔗糖 30-50g/L，植物凝胶 2. 2-2. 5g/L。在本发 明的一些实施方式中，所述2, 4-D的浓度可以为lmg/L、2mg/L、3mg/L或5mg/L ;所述6-BA 的浓度可以为〇· 5mg/L、lmg/L、l. 5mg/L或2mg/L ;所述NAA的浓度可以为0· 5mg/L、lmg/L、 3mg/L或4mg/L ;所述鹿糖的浓度可以为30g/L、40g/L或50g/L ;所述植物凝胶的浓度可以 为 2. 2g/L、2. 3g/L、2. 4g/L 或 2. 5g/L。
[0011] 作为优选，所述筛选培养基中待测化学试剂的浓度为〇.5-20mg/L，更优选为 0. 5-2mg/L〇
[0012] 作为优选，所述统计乳管细胞分化频率通过石蜡制片镜检统计。
[0013] 进一步优选，所述石蜡制片具体步骤为：
[0014] 愈伤组织固定于FAA溶液，酒精系列脱水，溴-碘染色液染色，石蜡包埋制片。
[0015] 更优选地，所述石蜡制片具体步骤为：
[0016] 愈伤组织固定于FAA溶液，室温下固定48-72h，然后依次于50%、60%、70%、 80%、90%、95%、100%、100%酒精中脱水111，60°0条件下溴-碘染色液染色36-4211，染色 后愈伤组织用石蜡包埋，切片机切成8-12um薄片，将薄片粘贴于干净的载玻片上，二甲苯 去蜡，固绿复染，二甲苯透明，中性树胶封片。
[0017] 作为优选，所述橡胶树品种为热研7-33-97或RRM600。
[0018] 以现有的橡胶增产刺激剂茉莉酸、乙烯利和非橡胶增产刺激剂赤霉素为检测对 象，按照本发明的方法进行检测，结果显示，添加有茉莉酸、乙烯利的筛选培养基的愈伤组 织，其乳管细胞分化频率显著高于对照培养基，而添加有赤霉素的筛选培养基的愈伤组织 其乳管细胞分化频率与对照培养基无显著差异，且筛选结果的重复性较好。上述结果表明， 本发明方法具有较高的重复性、准确性。
[0019] 利用本发明方法筛选橡胶树增产刺激剂具有明显优势：1、愈伤组织的生长条件 是可控的，其培养温度、光照强度、温度、营养成分等在室内条件下得到控制，因此不受环境 因素的影响，筛选试验重复性好。2、筛选试验在室内进行，操作方便，不需占用大面积田间 材料，试验成本低，节省大量人力物力。3、愈伤组织一般生长周期为2-3个月，在该周期内 检测所筛选的化学药剂对愈伤组织中乳管细胞分化的影响，从而快速知道该药剂的刺激效 果，大大缩短试验周期。与现有方法相比，本发明能大大提高橡胶树增产刺激剂的筛选效 率，可用于橡胶树增产刺激剂的规模化筛选。
【具体实施方式】
[0020] 本发明实施例公开了一种筛选橡胶树增产刺激剂的方法。本领域技术人员可以借 鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域 技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实 施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的产品 及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0021] 依照本发明的
【发明内容】
，本发明所述对照培养基和筛