药用紫锥菊不定根共培养的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种药用紫锥菊不定根共培养的方法。
【背景技术】
[0002] 紫锥菊Echinacen spp为菊科紫锥菊属多年生草本植物，原产地北美。该属共有 8个种及数个变种，目前作为药物开发的主要有3个品种，紫松果菊Echinacea purpurea， 狭叶紫维菊Echinacea angustifolia和白色紫维菊Echinacea pallida。早在北美印第安 人时期，紫锥菊就作为治疗外伤感染、蛇咬伤、牙痛的最佳药物，被当地人称作"万灵丹"，进 来又发现紫锥菊具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌、抗炎等功效，目前其药物是国际公认的 天然免疫调节剂及免疫增强剂。
[0003] 紫锥菊的根、茎、叶、花、果实均可入药，其地上部分及根的乙醇提取物中含有咖啡 酸衍生物、多糖、糖蛋白、烷基酰胺类化合物、生物碱、植物留醇、挥发油、多炔类化合物等生 物活性物质。咖啡酸衍生物是紫锥菊主要活性成分之一，3种药用紫锥菊各含有不同的咖啡 酸衍生物，狭叶紫锥菊及白色紫锥菊根部含0. 3~1. 7%的紫锥菊苷；紫松果菊根部不含有 紫锥菊苷，但菊苣酸是其主要成分，菊苣酸在紫松果菊的花和根中含量丰富，分别为1. 2~ 3. 1 %和0. 6~2. 1% ;狭叶紫锥菊中菊苣酸含量甚少。近来的研宄表明菊苣酸具有抑制艾 滋病病毒HIV-I和HIV-I整合酶的作用；紫锥菊苷具有抗肿瘤作用，对肝癌、肺癌、胃腺癌有 明显抑制效果，还具有壮阳、抗衰老和治疗糖尿病等作用。
[0004] 随着紫锥菊制剂在全球范围内日益普及，野生紫锥菊的产量很难满足国际市场需 求，美国和加拿大等地每年都增加其栽培面积。我国的北京、南京、沈阳等15个省市也引种 成功，但由于引种紫锥菊没有经过严格系统地种质筛选，随着栽培时间的增长和地区范围 的扩大，很容易出现种内变异，且临床药效不稳定。因此，通过细胞工程手段获取大量紫锥 菊原材料势在必行。
[0005] 利用紫锥菊不定根培养技术，高效生产次生代谢产物是合理利用和保护野生紫锥 菊资源的重要保障，同时为紫锥菊中药现代化发展提供重要机遇。
[0006] 最初紫锥菊生物技术的研宄多侧重于优良种苗的快速繁殖，近来重点研宄利用愈 伤组织和不定根培养生产其次生代谢产物。中国科学院过程工程研宄所在多年实践的基础 上，通过植物生物技术建立了紫松果菊快速育苗技术，并成功建立生长速度快且药用成分 含量高的紫锥菊离体根培养物，生产的紫锥菊根的有效成分含量和生物学功效明显优于野 生根，显示出巨大的商业化价值。但国内对紫锥菊的生理活性物质培养研宄，存在仅利用紫 松果菊单一品种，主要生产菊苣酸一种活性物质等局限性。发明人对紫锥菊不定根的研宄 从2004年开始，诱导出3种药用紫锥菊不定根，并在生物反应器内培养。白色紫锥不定根 在5L气升式生物反应器中培养30d后，不定根中紫锥菊苷含量是栽培根的2. 4倍；氯原酸， 菊苣酸，总咖啡酸衍生物含量是栽培根的4. 0~25. 6倍。狭叶紫锥菊不定根悬浮培养最适 培养基组合是〇. 5MS+IBA2mg · L_ 1 +5 %蔗糖+5:25 (mM)氨态氮/硝态氮，可获得高生物量、 总酚和总黄酮含量。紫松果菊不定根在反应器培养中可获得菊苣酸，绿原酸，咖啡酰酒石酸 等咖啡酸衍生物，在500, 1000 L气升式反应器中培养的紫松果菊不定根中，咖啡酸衍生物 含量比栽培植物高。以上结果表明，3种药用紫锥菊不定根系，可作为通过大规模生产提取 其药用生理活性物质的重要材料。
[0007] 但3种药用紫锥菊各自含有特定咖啡酸衍生物，因此单一培养不定根中不能同时 含有多种咖啡酸衍生物，利用2个或3个品种紫锥菊不定根共培养技术，可获得抗氧化活性 高且共含有多种生理活性物质的医学药材。到目前为止，尚未见到紫锥菊不定根共培养的 研宄报告。
【发明内容】
[0008] 本发明目的在于提供一种药用紫锥菊不定根共培养的方法。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0010] 一种药用紫锥菊不定根共培养的方法，将不同品种药用紫锥菊中两种或两种以上 组合的不定根悬浮培养在含有蔗糖的MS培养基中培养，即可实现紫锥菊不定根共培养，同 时获得大量的生理活性物质。
[0011] 优选是：将紫松果菊、狭叶紫锥菊和白色紫锥菊中，两种或两种以上组合的不定 根悬浮培养在含30~70g/L鹿糖的1/4~3/4MS培养基中培养，即可实现紫锥菊不定根共 培养，同时获得大量的生理活性物质。
[0012] 进一步的优选是：将紫松果菊和白色紫锥菊的不定根按质量比为3:4时悬浮培养 在含30~100g/L蔗糖的1/4~3/4MS培养基中培养，即可实现紫锥菊不定根共培养，同时 获得大量的生理活性物质。
[0013] 最优选是：将紫松果菊和白色紫锥菊的不定根按质量比为3:4时悬浮培养在承装 含50g/L蔗糖的3/4MS培养基的气升式生物反应器中，于0.1 vvm的空气流量下、23± 1°C的 温度下，暗培养30天，即可实现紫锥菊不定根共培养，同时共培养不定根干重比单独培养 的提高产量；共培养不定根中6种咖啡酸衍生物都具有；还刺激产生单一培养时未检测到 咖啡酸0. 12mg/g干重；同时获得大量的黄酮、多酚、多糖等生理活性物质。
[0014] 本发明所具有的优点：
[0015] 1.本发明采用生物反应器培养紫锥菊不定根最佳共培养组合为紫松果菊和白色 紫锥菊，收获的共培养不定根干重达6. 78g/L，是3种紫锥菊不定根共培养组合的1. 8倍，比 单独培养紫松果菊和白色紫锥菊的干重分别提高11. 3%和11.0%。此结果是本发明的最 重要成果之一，因为不同品种共培养时，品种间相互抑制生长，最终导致收获的细胞产量降 低，但本发明通过筛选最佳组合，收获的2种共培养不定根生物量显著高于单一培养和3种 共培养组合。
[0016] 2.本发明共培养紫松果菊和白色紫锥菊不定根时中，获得6种咖啡酸衍生物，其 绿原酸含量达6. 41mg/g干重，松果菊苷含量为3. 82mg/g干重，菊苣酸含量为13. 48mg/g干 重，总含量达25. 05mg/g干重，其总含量是单独培养紫松果菊时的1. 27倍，单独培养白色紫 锥菊时的1. 81倍，同时还刺激产生单一培养时未检测到的活性物质咖啡酸0. 12mg/g干重。
[0017] 3.本发明的白色紫锥菊和紫松果菊共培养不定根羟基自由基清除率最高，达 68. 12%，显著高于白色紫锥菊与紫松果菊单独培养时的清除率；该共培养的DPPH清除率 达74. 06%，还原能力达1. 03,均显著高于其他组合。
[0018] 4.本发明紫松果菊和白色紫锥菊共培养不定根最佳接种比例是3:4,此时收获的 不定根干重比接种比例为1:1的对照组提高8. 4%，菊苣酸和总咖啡酸含量各增加21. 1 % 和 23. 5%。
[0019] 5.采用本发明共培养不定根的方法，可获得具有显著的抗氧化抗肿瘤作用的紫 锥菊苷、菊苣酸等咖啡酸衍生物。采用本发明方法获得咖啡酸衍生物方面，具有生产周期 短、效率高、可工厂化生产，也为应用发酵技术开发紫锥菊生物药物及系列保健品奠定理论 和实践基础。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明实施例提供的采用本发明方法在5L气升式生物反应器中进行紫锥 菊共培养不定根的水溶性多糖含量图。
[0021] 图2为本发明实施例提供的采用本发明方法在5L气升式生物反应器中紫锥菊共 培养不定根的羟基自由基清除率图。
[0022] 图3为本发明实施例提供的采用本发明方法在5L气升式生物反应器中紫锥菊共 培养不定根DPPH清除率图。
[0023] 图4为本发明实施例提供的采用本发明方法在5L气升式生物反应器中紫锥菊共 培养不定根的还原能力图。
[0024] 图5为本发明实施例提供的采用本发明方法在不同无机盐浓度对共培养不定根 生长及根形态的影响图。
【具体实施方式】
[0025] 本发明是以紫松果菊、狭叶紫锥菊及白色紫锥菊等3种药用紫锥菊不定根为研宄 对象，拟利用气升式生物反应器内不定根共培养技术，通过不定根悬浮培养诸多理化参数 的调控，获得菊苣酸、紫锥菊苷、绿原酸和咖啡酸等单一培养时不能同时具有的咖啡酸衍生 物，还有丰富的黄酮、多酚和多糖等生理活性物质，同时探明共培养不定根抗氧化特性，最 终建立紫锥菊不定根共培养最佳生产体系，为应用发酵技术开发紫锥菊生物药物及其产业 化生产提供一种新方法。
[0026] 采用本发明方法得到的共培养紫松果菊和白色紫锥菊不定根干重比单独培养的 紫松果菊和白色紫锥菊分别提高11. 3%和