11. 0%，是紫松果菊、白色紫锥菊和狭叶紫锥菊 3种不定根共培养组合的1. 8倍；此共培养不定根中6种咖啡酸衍生物都具有，总含量达 25. 05mg/g干重，是紫松果菊单独培养时的1. 28倍，是白色紫锥菊单独培养时的1. 89倍； 还刺激产生单一培养时未检测到的活性物质咖啡酸0. 12mg/g干重；同时获得大量的黄酮、 多酚、多糖等生理活性物质。利用本发明方法生产抗氧化抗肿瘤生理活性物质紫锥菊苷和 菊苣酸等方面，具有生产周期短、效率高、可工厂化生产等特点，也为应用发酵技术开发紫 锥菊生物药物及系列保健品奠定理论和实践基础。
[0027] 材料与方法
[0028] 供试材料为大连市农业科学研宄院生物技术所保存的紫松果菊、白色紫锥菊和狭 叶紫锥菊3种紫锥菊不定根。3种不定根均在含有3% (w/v)鹿糖，lmg/L IBA的1/2MS固 体培养基上按照常规方式进行继代培养，培养基初始pH在灭菌前调至5. 7~5. 8,灭菌条件 为 121°C，I. 2kg/cm2,20min，不定根每 30d 继代一次。
[0029] 注：为便于介绍，Pu简写代替紫松果菊，以Pa代白色紫锥菊，以Ea代狭叶紫锥菊， 下文相同。
[0030] 实施例
[0031] 1.共培养不定根最佳组合确定
[0032] 在5L气升式生物反应器中，注入4L培养基，不定根接种量为7g/L，进行共培养不 定根最佳组合筛选。不定根培养组合为，Ea、Pa、Pu三种单独培养和Ea+Pa、Pa+Pu、Pu+Ea、 Pu+Pa+Ea的4种共培养，共有7种培养组合，3次重复，21个生物反应器同时培养。生物反 应器培养空气流量为0. lvvm，培养室温度23±1°C，暗培养30天。收获后调查不定根鲜重、 干重、生长率、黄酮含量、多酚和菊苣酸、紫锥菊苷等活性物质含量及抗氧化活性，筛选出共 培养的最佳组合。
[0033] 2.共培养不定根最佳接种比例确定
[0034] 将通过以上试验选择出的最优共培养组合为Pa+Pu，其总接种量为7g/L，接种质 量比Pa:Pu分别以6:1、5 :2、4:3、1:1、3:4、2:5、1:6等7种比例进行组合，在51^气升式生物 反应器中进行接种比例筛选试验。培养条件和调查项目与上述步骤1相同。
[0035] 3.共培养不定根培养基中最适无机盐浓度确定
[0036] 共培养不定根接种在MS无机盐浓度分别调至1MS、3/4MS、1/2MS、1/4MS的培养基 中，在5L气升式生物反应器中进行最适无机盐浓度筛选试验。培养条件和调查项目上述 步骤1相同。
[0037] 4.共培养不定根培养基中最适鹿糖浓度确定
[0038] 共培养不定根接种在上述最适的3/4MS无机盐培养基中，其添加的蔗糖浓度分别 调为0、30、50、70、100 8/1，在51^气升式生物反应器中进行最适蔗糖浓度筛选试验。培养条 件和调查项目上述步骤1相同。
[0039] 测定参数及方法
[0040] 不定根生物量测定
[0041] 将不定根通过不锈钢金属筛使之与培养基分离，用清水冲洗干净后，吸干表面水 分，称量其鲜重。然后将不定根置于烘箱中，60°C下烘干2d至恒重，称量并记录。其生长率 表述为：收获干重-接种干重/接种干重。
[0042] 不定根萃取液的制备
[0043] 准确称取干燥至恒重的不定根0. 2g，加入IOmL 80%乙醇，常温下用磁力搅拌器 提取2h。离心分离后，将上清液过滤至容量瓶中，残渣以相同方式重复提取两次，最终将溶 液定容至25mL。
[0044] 总多酚与总黄酮含量测定
[0045] 总多酚含量参照Folin等[1°4]的测定方法，紫外分光光度计760nm处测定其吸光 度，所采用标准品为Gallic acid。总黄酮含量参照0冊&拉〇等[1°5]的测定方法，用紫外分 光光度计在510nm处测定其吸光度，所采用标准品为Catechin。
[0046] 咖啡酸衍生物含量测定
[0047] 咖啡酸衍生物是采用HPLC法进行测定的，具体操作方法如下[1°6]:使用的是 XTerra RP 18柱（颗粒直径为3. 0 μ m，150mmX 3mm)。流动相为水（A)和乙腈（B)。按如下 步骤进行梯度洗脱：首先以10% B洗脱40min，然后25% B洗脱llmin，50% B洗脱lmin， 再以0. 3mL/min流速重复10% B洗脱8min，于波长330nm处检测。
[0048] 不定根中水溶性多糖含量测定
[0049] 利用苯酷-浓硫酸法测定多糖含量，波长为490nm处测定其吸光度，制定葡萄糖标 准曲线，按以下公式可计算出多糖含量：多糖含量=X · D/WX 100%
[0050] 其中，X-样品液相当于葡萄糖浓度，D-稀释因素，W-样品取样量。
[0051] 共培养不定根抗氧化活性测定
[0052] 羟基自由基清除能力的测定，参照Kong等[1°7]的方法；还原能力的测定，参照Zhu 等[1°8]的方法；DPPH自由基清除活性的测定，参照Chen等[1° 9]的方法；Fe 2+螯合能力的测 定，参照Hsu等[11°]的方法。
[0053] 统计分析
[0054] 本试验每个处理均进行3组平行重复培养，多酚、黄酮、水溶性多糖及咖啡酸衍生 物含量测定均为3次重复。数据通过ANOVA和Duncans multiple range testes (DMRT)正 反交实验，采用spssl7.0软件（IBM institute，USA)进行处理分析。
[0055] 结果与分析
[0056] 1.紫锥菊不定根共培养最佳组合确定
[0057] 在5L气升式生物反应器中共培养Pa+Pu组合不定根长势最佳，收获的不定根鲜 重、干重可分别为50. 39g/L、6. 78g/L，不定根增长率9. 9,多酚及黄酮类含量达37. 08mg/g 干重和34. 42mg/g干重，显著高于单独培养与3种共培养组合。最重要的成果是Pa+Pu组 合不定根的干重比单独培养时的Pu、Pa、Ea干重分别提高11. 3%、11. 0%和60. 7%。一般 不同品种间共培养时，因相互抑制生长，最终导致收获的细胞产量降低，但该共培养组合， 收获的不定根生物量显著高于单独培养的组合（参见表1)。
[0058] 表1 5L气升式牛物反应器中共培养不定枏的牛长及多酚、昔酮积累情况
【主权项】
1. 一种药用紫锥菊不定根共培养的方法，其特征在于：将不同品种药用紫锥菊中两种 或两种以上组合的不定根悬浮培养在含有蔗糖的MS培养基中培养，即可实现紫锥菊不定 根共培养，同时获得大量的生理活性物质。
2. 按权利要求1所述的药用紫锥菊不定根共培养的方法，其特征在于：将紫松果菊 (Echinaceapurpurea)、狭叶紫维菊（Echinaceaangustifolia)和白色紫维菊（Echinacea pallida)中两种或两种以上组合的不定根悬浮培养在含30~100g/L鹿糖的1/4~3/4MS 培养基中，即可实现紫锥菊不定根共培养，同时获得大量的生理活性物质。
3. 按权利要求2所述的药用紫锥菊不定根共培养的方法，其特征在于：将紫松果菊和 白色紫锥菊的不定根按质量比为3:4悬浮培养在含30~100g/L蔗糖的1/4~3/4MS培养 基中，即可实现紫锥菊不定根共培养，同时获得大量的生理活性物质。
4. 按权利要求3所述的药用紫锥菊不定根共培养的方法，其特征在于：将紫松果菊和 白色紫锥菊的不定根按质量比为3:4悬浮培养在承装含50g/L蔗糖的3/4MS培养基的气升 式生物反应器培养30天，即可实现紫锥菊不定根共培养，同时获得大量的生理活性物质。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及一种药用紫锥菊不定根共培养的方法。将不同品种药用紫锥菊中两种或两种以上组合的不定根悬浮培养在含有蔗糖的MS培养基中培养，即可实现紫锥菊不定根共培养，同时获得大量的生理活性物质。利用本发明方法生产抗氧化抗肿瘤生理活性物质紫锥菊苷和菊苣酸等方面，具有生产周期短、效率高、可工厂化生产等特点，也为应用发酵技术开发紫锥菊生物药物及系列保健品奠定理论和实践基础。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104839026
【申请号】CN201510287967
【发明人】吴春华, 田启云, 安冬, 孙丽娜, 王淼
【申请人】大连市农业科学研究院
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月29日