直接采用dgge割胶条带浸出液的pcr产物进行测序的方法

直接采用dgge割胶条带浸出液的pcr产物进行测序的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物生态学领域，涉及一种DGGE割胶条带所含rDNA片段的测序方 法，尤其是指直接采用DGGE割胶条带浸出液的PCR产物进行测序的方法。
【背景技术】
[0002] DGGE(变性梯度凝胶电泳)是一项DNA指纹技术，它可以分离长度相同但序列不同 的DNA片段，目前已经成为微生物菌群多样性研究的重要手段。与微生物学传统研究手段 相比，DGGE最大的特点在于它是以样品的总DNA(或RNA)出发进行研究的，因此能检测到 生态体系中大量不可培养的微生物菌群。同时这项技术还具有可靠性强、重现性高、方便快 捷等优点，因此被广泛应用于土壤、动物肠道、水体等各种环境体系的微生物生态解析中。 DGGE技术通常和rDNA分子鉴定技术相结合用于将微生物菌群多样性信息转化为微生物菌 群结构信息。DGGE技术用于研究微生物菌群结构一般包含以下五个主要步骤：一是样品总 DNA或者总RNA提取；二是rDNA片段扩增；三是扩增片段的DGGE分离；四是DGGE图谱分析 和条带的割胶回收、再扩增及测序；五是将测得的rDNA序列在数据库中进行相似性搜索来 判定对应微生物的种属信息。
[0003] 通过DGGE技术获取所研究生态体系中微生物的种属信息，其关键在于DGGE割胶 条带所含rDNA片段的序列测定。然而大量研究和实践表明，以DGGE割胶条带的浸出液为 模板重扩增的rDNA片段（即使采用的是高保真的DNA聚合酶)，理论上应该是单一的产物， 结果再次进行DGGE时发现除了割胶条带外还会出现多条原DGGE中的条带和\或背景条 带(非特异性条带、片段拖尾和上样孔条带等)。由此可知，DGGE割胶条带浸出液的PCR产 物往往并不是单一的而是混杂的。究其原因在于，DGGE用于微生物生态学研究时本身分析 的就是混杂的rDNA片段，这些扩增产物实际上是非常复杂的，会有少量非特异性扩增产物 和异源杂交双链等PCR人工产物以及其它扩增产生的背景产物，这些非目标产物将会遍及 DGGE胶的各个位置。因此，即使是在DGGE胶的空白处割胶，其浸出液也可以扩增出微弱的 产物。主条带是核酸片段集中的区域，更加会面临所述样品扩增过程形成的非目标产物的 影响。除了DGGE方法自身的原因外，电泳和割胶操作等过程也会引入污染，因为这些过程 本身就处于一个污染的环境中。比如实际过程中，电泳缓冲液无法做到每次一换(需要多达 7L的1XTAE缓冲液)，缓冲液本身就含有一定量的核酸背景；割胶时无法做到每个条带一 把割胶刀，如果没有彻底清除，上一个割胶条带可能会残留在割胶刀上污染后续的条带。综 上所述，割胶得到的DGGE条带难免会混杂其它序列的片段尤其是其它DGGE主条带，因此其 浸出液的PCR产物中往往含有较复杂的背景产物甚至是多种扩增产物，导致二次DGGE出现 多条条带和背景杂带。如果将这样的PCR产物直接送去测序的话，虽然很简便，然而将导致 得到的序列是不准确的(测序图谱极易出现双峰和套峰等异常现象）甚至测序失败，从而影 响到所割DGGE条带对应的微生物种属的分子鉴定结果。
[0004] 对于DGGE割胶条带所含片段序列的测定，目前通常采取克隆测序的策略(详见图 1)。往装有DGGE割胶条带的无菌离心管中加入100ul无菌水，以浸出液为模板扩增目标片 段，将纯化的扩增产物克隆到工程菌(如A cWi DH5a )中，然后对克隆片段进行扩增，挑 选和原始样品条带一致的克隆子，将该克隆子的扩增片段送去测序，测定的序列在NCBI上 利用数据库和软件比对进行种属的分子鉴定。由于大量复制增殖后每个大肠杆菌细胞内 只含有单一的克隆片段，因此利用克隆的方式可以将混合多种序列的片段分离，最终再利 用DGGE通过条带位置进行筛选。克隆测序策略(通常采用TA克隆方式）虽然解决了 DGGE 割胶条带的测序问题，然而该策略需要进行目标片段扩增和纯化、目标片段和T载体连接、 大肠杆菌感受态细胞制备、重组载体转化菌培养和蓝白筛选、同一 DGGE条带位置克隆子筛 选、以克隆子为模板扩增目标片段并测序等诸多繁琐和复杂的操作和步骤。以20条DGGE 条带的分析为例，一整个克隆测序在测序前至少需要花费一周的时间。成本方面，单看T载 体和感受态细胞，其商业化产品价格分别约为20元/次和30元/次，因此总成本不会少于 2000元。此外，对实验技能和操作要求很高，实验强度大。
[0005]通过上述分析可知对于DGGE割胶条带的序列测定，采用克隆测序的策略其成本、 时间和操作代价很大。考虑到DGGE割胶割的是单一的条带，浸出液中含有的主要是该条带 对应的片段，而混杂的其它片段是少量的；因此可以直接对DGGE割胶条带的浸出液进行处 理，消除混杂的少量其它片段，之后再进行PCR扩增则将只得到一种扩增产物，从而寻求一 种快速、简便和经济的方法以使DGGE割胶条带的PCR产物可以直接进行测序分析。

【发明内容】

[0006] 为了克服DGGE割胶条带浸出液的PCR产物往往含有目标片段外的背景产物，导致 直接测序不准确甚至失败的不足；本发明提供了一种DGGE割胶条带浸出液的处理方法，它 可以消除目标片段中混杂的其它片段，使得处理后浸出液的PCR产物可以直接进行测序。
[0007]本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下： 本发明方法直接对DGGE割胶条带的浸出液进行处理：先利用变性退火过程使得少量 的污染片段中的大部分和大量的目标片段形成异源杂交双链，然后采用错配酶切除形成的 异源杂交双链，这样就可以有效消除混杂的其它片段，同时目标片段含量并未受大的损失。 由于模板得到净化其扩增将得到单一的PCR产物，就可以直接进行测序。
[0008]本发明包括以下步骤： (1) DGGE胶经EB染色后用灭菌刀片切下所需的条带，挑到1.5ml无菌的离心管中，用 灭菌去离子水清洗数次，最终加入l〇〇ul灭菌去离子水后于-20°C冰箱中冷冻过夜； (2) 室温融化（1)中的DGGE条带浸出液，接着8000 rpm离心2min ;之后取10ul上清 液到无菌PCR管中，放到PCR仪中进行变性退火操作，程序为：先95°C保温5min，再65°C保 温 15min，最后 25°C保温 30min ; (3) 取（2)中样品8.9ul到新的无菌PCR管中，加入0. lul错配酶和lul 10*酶 buffer ;将PCR管放入PCR仪中进行酶切保温，程序为：37°C保温30min ;其中使用的错配酶 具有识别错配杂交双链并在错配位点进行酶切使之变成两条短双链的功能，如T7核酸内 切酶I (T7 Exonuclease I，T7EI)和芹菜Cel I酶，酶活单位不低于500单位/ml;对于错 配酶酶活，1单位定义为在50 y 1反应体系中37 °C下保温1小时可将1 y g含有错配的DNA 片段(长度为l〇〇bp)中的90%以上酶切成两个短片段所需要的酶量。
[0009] (4)待（3)结束后，PCR管继续留在PCR仪中，进行变性退火操作，程序为：先95°C 保温5min，再65°C保温15min，最后25°C保温30min ; (5) 待（4)结束后，往PCR管中加入0. lul同种错配酶，之后将其继续放入PCR仪中进 行酶切保温，程序为：37°C保温30min，80°C保温lOmin ; (6) 保温结束后，取lul (5)中酶切处理产物作为模板采用不带GC夹子的引物扩增目 标片段，琼脂糖电泳验证扩增成功后，琼脂糖电泳验证成功后，送测序公司进行Sanger测 序分析。
[0010] 本发明的有益效果是：直接对DGGE割胶条带的浸出液进行处理：先利用变性退火 过程使得少量的污染片段中的大部分和大量的目标片段形成异源杂交双链，然后采用错配 酶切除形成的异源杂交双链，这样就可以有效消除混杂的其它片段同时目标片段含量并未 受大的损失。由于模板得到净化则其扩增将得到单一的PCR产物，就可以直接进行测序，从 而避免了繁琐的克隆环节，因此可以在较低的成本下快速简便地得到目的条带所含片段的 准确序列信息。
【附图说明】
[0011] 图1是DGGE技术联合克隆测序策略进行微生物菌群结