analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl.Environ. Microbiol, 1993, 59: 695-700.)进行。DGGE条件为：胶浓度为8%，变性剂梯度为20%-40%， 控温为60°C，电流为90mA，时间为12h。DGGE结束后，胶浸泡在0. 5 ug/ml EB (溴化乙啶） 溶液中lh，清水浸泡脱色两次后照胶。DGGE结果如图3中泳道1所示，共有5条明显可见 条带，从上到下分别标识为1-5。
[0026] 2.割胶回收并进行二次DGGE (1)割胶回收和浸出液处理 a.用灭菌刀片切下图3中的5条标识的DGGE条带进行割胶，挑到1. 5ml做好标记的无 菌离心管中，用灭菌去离子水清洗数次，最终加入l〇〇ul灭菌去离子水后于-20°C冰箱中冷 冻过夜； b. 室温融化a中冷冻的DGGE条带浸出液，接着8000rpm离心2min ;之后取10ul上清 液到无菌PCR管中，放到PCR仪中进行变性退火操作，程序为：先95°C保温5min，再65°C保 温 15min，最后 25°C保温 30min ; c.取b中样品8.9ul到新的无菌PCR管中，加入0. lul T7核酸内切酶I (T7 Exonuclease I，T7EI)和lul 10* I7EI buffer;将PCR管放入PCR仪中进行酶切保温，程 序为：37°C保温30min ; d. 待c结束后，PCR管继续留在PCR仪中，进行变性退火操作，程序为：先95°C保温 5min，再 65°C 保温 15min，最后 25°C 保温 30min ; e.待d结束后，往PCR管中加入0. lul T7EI，之后将其继续放入PCR仪中进行酶切保 温，程序为：37°C保温30min，80°C保温lOmin ;最终得到DGGE割胶条带浸出液样品的酶切 产物10ul。
[0027] (2)重扩增和二次DGGE 取lul 2. (l)e中酶切处理产物作为模板采用NSl-GCfung重扩增目标片段，扩增条件 同1. (2冲的条件，琼脂糖电泳图谱如图6所示；为了对比本发明方法的效果，同时取未经 处理的DGGE割胶浸出液即2. (l)b中的上清液作为模板进行同样扩增，琼脂糖电泳图谱 如图5所示。由图5和图6可知，经过处理和未经处理的DGGE割胶浸出液为模板均能成功 重扩增出目标片段，然而经过处理组扩增条带更单一和纯净（图6)，无处理组扩增条带出现 非特异性条带和拖尾带型表明有非目标产物（图5)。两组重扩增片段的琼脂糖凝胶电泳结 果初步表明，经过本发明方法处理可以消除原始模板中混杂的其它片段，使得重扩增产物 更加单一和纯净。接着通过重扩增产物的DGGE分析进一步说明本发明方法的实际效果。
[0028] 对于两组重扩增产物，按照1. (3)的条件再次进行DGGE，图谱如图3和图4所示 (泳道2-6)。处理组的DGGE条带（图4中gl-5,位于泳道2-6)与原始割胶条带位置完全一 致，条带非常单一和纯净，没有非目标条带出现，也没有背景(包括上样孔处）；而无处理组 的DGGE条带（图3中gl。％，位于泳道2-6)目标条带后有模糊的背景拖尾，此外均出现非 特异性条带，而且上样孔处有明显复杂构造(无法跑下去）形成的条带。可见无处理组得到 的重扩增产物是混杂产物，不适合直接测序；而经过本发明方法处理得到的重扩增产物很 单一纯净，达到了直接进行测序分析的标准了。最后通过重扩增产物的测序分析进一步说 明本发明方法的实际效果。
[0029] 3.进行序列测定和分子鉴定 分别取lul无处理和lul经本发明方法处理的DGGE割胶条带浸出液，采用不含GC夹 子的引物NSl-fung (fung的序列为：5'-ATTCCCCGTTACCCGTTG-3'）扩增目标片段。琼脂糖 电泳和图5和图6基本一致，均能成功重扩增出目标条带。两组共10个重扩增样品外送生 工生物工程(上海）股份有限公司进行Sanger测序分析。结果无处理组的5个样品测序均 失败，而处理组的5个样品的测序效果很好，其测序结果详见序列表1-5。测定的序列提交 到NCBI上利用Blast在GeneBank数据库中进行相似性搜索，结果详见表2。
[0030] 表2种属鉴定结果
核算本实施例在测序前的代价发现，采用本发明方法处理的时间不足半天、成本不足5 元/样而且无需特殊设备操作非常简便，就可以使得DGGE割胶条带浸出液的PCR产物达到 测序的标准和要求。相比于克隆测序策略高昂的代价，本发明方法取得的改善效果非常明 显，具有快速、简便和成本低的优势。
[0031] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 直接采用DGGE割胶条带浸出液的PCR产物进行测序的方法，其特征在于利用变性 退火过程使得DGGE割胶条带浸出液中的目标片段和混杂的少量污染片段形成异源杂交双 链，再用错配酶切除异源杂交双链从而消除污染片段，则用于PCR再扩增的模板得到了纯 化，因此其扩增产物可以直接用于测序分析。2. 根据权利要求1所述的直接采用DGGE割胶条带浸出液的PCR产物进行测序的方法， 其特征在于：所述方法的步骤为： (1) DGGE胶经EB染色后用灭菌刀片切下所需的条带，挑到1.5ml无菌的离心管中，用 灭菌去离子水清洗数次，最终加入IOOul灭菌去离子水后于-20°C冰箱中冷冻过夜； (2) 室温融化（1)得到的DGGE条带浸出液，接着8000 rpm离心2min ;之后取IOul上 清液到无菌PCR管中，放到PCR仪中进行变性退火操作，程序为：先95°C保温5min，再65°C 保温15min，最后25°C保温30min ; (3) 取（2)中样品8. 9ul到新的无菌PCR管中，加入0.1 ul错配酶和Iul 10*酶buffer; 将PCR管放入PCR仪中进行酶切保温，程序为：37 °C保温30min ; (4 )待（3 )结束后，PCR管继续留在PCR仪中，进行变性退火操作，程序为：先95 °C保温 5min，再 65°C 保温 15min，最后 25°C 保温 30min ; (5) 待（4)结束后，往PCR管中加入0.1 ul同种错配酶，之后将其继续放入PCR仪中进 行酶切保温，程序为：37°C保温30min，80°C保温IOmin ; (6) 保温结束后，取Iul (5)中酶切处理产物作为模板采用不带GC夹子的引物扩增目 标片段，琼脂糖电泳验证扩增成功后，琼脂糖电泳验证后外送测序公司进行Sanger测序分 析。3. 根据权利要求1或2所述的直接采用DGGE割胶条带浸出液的PCR产物进行测序的 方法，其特征在于：使用的错配酶具有识别错配杂交双链并在错配位点进行酶切使之变成 两条短双链的功能，包括T7核酸内切酶I和芹菜Cel I酶，酶活单位不低于500单位/ml ; 对于错配酶酶活，1单位定义为在50 y 1反应体系中37°C下保温1小时可将I y g含有错配 的长度为IOObp的DNA片段中的90%以上酶切成两个短片段所需要的酶量。
【专利摘要】本发明属于微生物生态学领域。为了克服DGGE割胶条带浸出液的PCR产物往往含有目标片段外的背景产物，导致直接测序不准确甚至失败的不足；本发明提供了一种DGGE割胶条带浸出液的处理方法：首先利用变性退火步骤使得浸出液中的目标片段和混杂的少量污染片段中的大部分形成异源杂交双链，再用错配酶切除异源杂交双链从而大大消除污染片段，同时目标片段含量并未受大的损失。由于模板得到净化其扩增将得到单一的PCR产物，就可以直接进行测序，从而避免了繁琐的克隆环节，因此可以在很低的成本下快速简便地得到准确的条带所含片段的序列信息。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105039570
【申请号】CN201510531035
【发明人】黄志清, 陈强, 王智耀, 翁芳霞
【申请人】福建医科大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月27日