一组用于筛选和/检测种公牛射精量和鲜精活力高低的snp分子标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及家畜分子遗传生物技术领域，具体涉及一组用于筛选和/检测种公牛 射精量和鲜精活力高低的SNP分子标记，尤其是涉及通过分子标记技术检测与种公牛射精 量和鲜精活力高低相关的INCENP基因的SNPs位点，提供检测种公牛射精量和鲜精活力高 低的方法及试剂盒，应用于优良家畜繁殖性状的早期选育。
【背景技术】
[0002] 牛奶营养价值极高，是我们日常生活中不可或缺的食品。中国荷斯坦奶牛是国内 饲养范围最广，产奶量最多的一个品种。中国荷斯坦公牛作为奶牛繁育中重要的一环，其精 液品质不仅决定着公牛站的经济效益，更显著影响母牛的繁殖效率。近年来，随着分子遗传 技术的不断发展，候选基因法（Candidate Gene Approach)在遗传育种中得到了广泛应用。 通过筛选候选基因上的多态位点，分析多态位点与精液品质的相关性，从而鉴定出与精子 质量相关的分子标记，进而为标记辅助选择（marker assisted selected，MAS)提供理论指 导。目前，多个研究通过全基因组关联分析鉴定了与精液品质密切相关的单核苷酸多态性 (Single nucleotide polymorphisms，SNPs)位点，发现这些SNPs位点可影响精子活力、密 度、畸形率以及受精后的胚胎发育。
[0003] 基因任何构件的改变都会影响基因表达及其功能活性，单核苷酸多态性（SNP)是 最普遍的基因突变方式，主要是指DNA序列上单个碱基突变，包括单个碱基的转换、颠换、 插入及缺失等。编码区SNP(coding SNP，cSNP)可能对蛋白质的结构和功能产生有害的影 响，在遗传性疾病的研究中具有重要意义。启动子区SNP，尤其是有转录因子结合的SNP位 点，影响启动子活性，进而调控基因的表达水平。近年来研究发现，某些基因启动子区SNPs 可能改变影响公牛精液品质和繁殖力的主效基因启动子区调控元件的结合位点，改变了基 因的表达模式，从而影响了公牛精液性状和繁殖力。例如，本课题组Zhang等（2014)在前 期研究中也发现KATNAL1基因的一个启动子SNP(c. 163-210T>C)与中国荷斯坦公牛精子畸 形率密切相关。Pan(2013)等研究发现PLCz基因启动子区的SNP(g. 2456G>A)影响中国荷 斯坦公牛的射精量。再如，Dai等（2009)分析了 3个品种公牛的FSHP基因上游调控区，发 现5'端侧翼区的突变改变了转录因子的结合位点，该突变可导致精液中FSH浓度的改变， 解释了 FSHP突变基因型个体精子密度较低和顶体完整性较差的可能机理。相比于探究某 个基因单个位点核苷酸多态性与生物性状的相关性，研究多个多态位点之间的单倍型组合 更有意义，因为这可以同时考虑到多态位点之间的相互作用。
[0004] INCENP作为一种着丝粒特异性蛋白质，通过与微管、肌动蛋白等相互作用在细胞 有丝分裂和减数分裂以及胞质分裂过程中发挥重要的作用。研究表明INCENP能够保证染 色体乘客复合体功能的正常发挥，并与细胞分裂、癌症的发生、自然流产密切相关，而且在 生物的生殖过程中也发挥着重要的作用。Hering等（2014)对高低精子活力的荷斯坦奶 牛进行了全基因组关联分析，筛查了距离显著标记1MB区域的所有基因，发现了多个与精 子品质相关的候选基因，其中INCENP作为其中一个候选基因，其可能与精子的功能密切相 关，在调控精子质量方面可能具有重要的作用。然而Bos Taurus中INCENP基因已知的SNP 位点有3376个，不同SNP位点其关联的性状也往往不同，如何筛选出可用于检测种公牛射 精量和鲜精活力高低的SNP分子标记，是本领域技术面临的主要难题。现有技术中影响种 公牛射精量和鲜精活力高低的INCENP基因的SNPs及其基因型组合的鉴定检测试剂盒，目 前仍未有报道。
【发明内容】
[0005] 为解决现有技术中存在的上述问题，本发明针对现有种公牛射精量和鲜精活力检 测技术的不足，开发相应的检测试剂盒，筛选射精量和鲜精活力高的种公牛，为种公牛繁殖 育种提供技术指导。
[0006] 本发明的目的是提供一组用于筛选和检测种公牛射精量和鲜精活力高低的SNP 位点，并提供一种通过INCENP基因SNPs检测种公牛射精量和鲜精活力高低的方法，以及研 发相应的检测试剂盒应用于种公牛繁殖。首先检测INCENP基因的SNPs位点，确定个体中 SNPs位点间的基因型组合，并进行基因型组合与种公牛精液品质的关联分析，从而鉴定出 射精量和鲜精活力高的基因型组合。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[0008]1、一组用于筛选和/检测种公牛射精量和鲜精活力高低的SNP位点：g.19970A>G 和g. 34378T>G，两个SNPs分别位于INCENP基因第19970位和34378位碱基（以INCENP基 因转录起始位点的第一个碱基C为+1)。
[0009] 2、上述所述SNP位点用于筛选和/检测种公牛射精量和鲜精活力高低的应用。本 领域技术人员应当明了，本申请所述SNP位点用于筛选和/检测种公牛射精量和鲜精活力 高低的应用，其是筛选和/检测得到射精量和鲜精活力相对高的基因型的种公牛，其目的 是指导种公牛的早期筛选，其不属于疾病的诊断和/治疗方法。
[0010] 所述SNP位点在牛的标记辅助育种中的应用。
[0011] 3、一种用于筛选和/检测种公牛射精量和鲜精活力高低的方法，以种公牛精液 DNA为模板，设计引物分别扩增包含两个SNPs位点的DNA序列，根据扩增序列SNP位点的情 况进行基因型组合，来筛选和/检测种公牛射精量和鲜精活力高低。
[0012] 优选的，具体方法为：基因组DNA PCR扩增引物序列如序列表SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示，可以分别特异性地扩增包含INCENP基因第19970 位（如SEQ ID NO. 1所示）和34378位核苷酸（如SEQ ID NO. 4所示）序列；
[0013] 优选的，PCR产物分别用FastDigest限制性核酸内切酶Ndel和Alul进行酶切。 酶切产物用2. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳的结果区分基因型。对于INCENP基因 的第19970位SNP位点：若酶切后产物片段为606bp和110bp是AA基因型；片段为716bp、 606bp和110bp是AG基因型；片段为716bp是GG基因型。对于INCENP基因的第34378位 SNP位点：若酶切后产物片段为205bp是TT基因型；片段为205bp、126bp和79bp是TG基 因型；片段为126bp和79bp是GG基因型。根据两个SNP的基因型构建出8种基因型组合， 其中H3H4(GGTG)基因型组合种公牛个体的射精量和鲜精活力最高。
[0014] 上述所需的基因组DNA均是通过高盐法从种公牛的冻精中提取，并且利用核酸蛋 白分析仪检测基因组DNA的浓度和纯度，最终将DNA稀释到50ng/ y L，4°C保存备用。
[0015] 上述所用的FastDigest限制性核酸内切酶Ndel可以识别INCENP基因的第19970 位SNP位点，FastDigest限制性核酸内切酶Alul用于识别INCENP基因的第34378位SNP 位点。
[0016] 上述基因型组合构建方法如下：根据检测到的中国荷斯坦种公牛INCENP基因的 第19970位和34378位SNP位点，首先在公牛群体中确定出三种基因型，分别是HI (AT)、 H2 (AG)、H3 (GT)、H4 (GG)。三种基因型组合后在群体中检测到8种基因型组合：H1H1 (AATT)， H1H2(AATG)，H1H3(AGIT)，H1H4(AGTG)，H2H2(AAGG)，H2H4(AGGG)，H3H3(GGIT)，H3H4(GGTG)。
[0017] 其中H3H4基因型公牛个体的射精量显著高于H1H4基因型个体公牛，极其显著高 于H1H3、H2H4、H3H3基因型个体公牛；H3H4基因型组合公牛个体的鲜精活力显著高于H1H3 基因型个体公牛。因此，可以将GGTG基因型作为判断种公牛射精量和鲜精精子活力高低的 分子标记。
[0018] 优选的，上述利用PCR产物进行区分基因型的过程亦可采用其他常规方法，如对 PCR产物直接测序法，获得所述SNP位点对应的基因型。
[0019] 4、一种筛选和/检测种公牛射精量和鲜精活力高低的试剂盒，包括：扩增位于 INCENP基因第19970位和34378位碱基的两个SNPs :g. 19970A>G和g. 34378T>G的引物； PCR扩增试剂。