miRNA检测芯片及其制作方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生化检测领域，尤其是涉及一种miRNA检测芯片及其制作方法和应 用。
【背景技术】
[0002] microRNA(微小RNA，又称miRNA)是一种长度为18~22nt的内生性非编码小 RNA分子，普遍存在于动植物体内。microRNA是生物体内重要的基因表达调控子，参与调 节胚胎早期发育、细胞增殖分化凋亡及新陈代谢等各个过程，其差异性表达与多种人类疾 病的发生发展密切相关。不同疾病的不同阶段都有其相应的miRNA表达谱，且血清/血浆 内源性miRNA相对比较稳定。近年来，miRNA在临床上被视作新型的生物标志物，可以为疾 病的诊断、治疗提供全新的重要依据和研究思路。目前miRNA的主要检测方法有Northern Blotting、微阵列技术以及RT-PCR等，这些技术都各自存在一定的检测缺陷，如Northern Blotting方法复杂、耗时、成本高且灵敏度低；RT-PCR具有较好的准确性、较高的灵敏度， 可以检测低丰度miRNA，但是由于miRNA的长度比引物更短造成扩增技术困难且不能高通 量检测；微阵列技术虽然能够实现高通量检测miRNA，但其实验用试剂、仪器设备昂贵，成 本高。
[0003] 基因芯片技术可以一次性对样品中大量序列进行检测和分析，广泛应用于基因表 达分析、病毒和细菌的鉴定、医疗诊断等领域。然而传统的基因芯片技术往往需要PCR实现 信号的扩增，操作过于繁琐，灵敏度不高，难以适应高通量的基因的分析。
【发明内容】
[0004] 基于此，有必要提供一种操作简便且可实现高通量检测的miRNA检测芯片及其制 作方法和应用。
[0005] -种miRNA检测芯片，包括设有金膜的基底、特异性RNA探针和单链DNA探针；
[0006] 所述特异性RNA探针含有用于检测目标miRNA的特异性序列，所述特异性序列可 与由所述目标miRNA逆转录形成的cDNA杂交；
[0007] 所述特异性RNA探针的一端修饰生物素，所述生物素上结合有荧光标记物，所述 特异性RNA探针的另一端修饰巯基，所述特异性RNA探针修饰有巯基的一端通过Au-S键固 定在所述设有金膜的基底上；
[0008] 所述单链DNA探针用于检测对照，所述单链DNA探针的一端修饰生物素，所述生物 素上结合有荧光标记物，所述单链DNA探针的另一端修饰巯基，所述单链DNA探针修饰有巯 基的一端通过Au-S键固定在所述设有金膜的基底上。
[0009] 在一个实施例中，所述特异性RNA探针为一种，所述特异性RNA探针的序列为SEQ ID No. 1 或 SEQ ID No. 2。
[0010] 在一个实施例中，所述特异性RNA探针为两种，所述特异性RNA探针的序列分别为 SEQ ID No. 1和 SEQ ID No. 2。
[0011] 在一个实施例中，所述单链DNA探针的序列如SEQ ID No. 3所示。
[0012] 在一个实施例中，所述荧光标记物为异硫氰酸荧光素标记的链酶亲和素。
[0013] 上述miRNA检测芯片的制作方法，包括如下步骤：
[0014] 构建用于检测目标miRNA的特异性序列，所述特异性序列可与由目标miRNA逆转 录形成的cDNA杂交，在所述特异性序列的一端修饰生物素并且将荧光标记物结合在所述 生物素上，接着在所述特异性序列的另一端修饰巯基，得到特异性RNA探针；
[0015] 构建用于检测对照的单链DNA序列，在所述单链DNA序列的一端修饰生物素并且 将荧光标记物结合在所述生物素上，接着在所述单链DNA序列的另一端修饰巯基，得到单 链DNA探针；
[0016] 在基底表面形成一层金膜，得到设有金膜的基底；
[0017] 将所述特异性RNA探针及所述单链DNA探针分别点样至所述设有金膜的基底上， 4°C密封保存，使所述特异性RNA探针及所述单链DNA探针与所述设有金膜的基底之间发生 Au-S键自组装而对探针进行固定；及
[0018] 采用无水乙醇溶液封闭空白区域，得到所述miRNA检测芯片。
[0019] -种miRNA的检测方法，包括如下步骤：
[0020] 提取待测miRNA，并以提取的所述待测miRNA为模板，在逆转录酶的作用下，逆转 录形成与所述待测miRNA互补的cDNA ;
[0021] 将上述任一实施例所述的miRNA检测芯片置于荧光显微镜下进行荧光检测，得到 初始荧光强度；
[0022] 在所述miRNA检测芯片中加入与所述待测miRNA互补的cDNA，得到miRNA/cDNA杂 交体；
[0023] 加入核糖核酸酶水解所述miRNA/cDNA杂交体中的miRNA，释放出杂交体中的 cDNA ；
[0024] 洗涤除去游离的cDNA、核糖核酸酶以及荧光标记物，将所述miRNA检测芯片置于 荧光显微镜下进行荧光检测，得到酶切后荧光强度；以及
[0025] 通过比较所述初始荧光强度和所述酶切后荧光强度，获得miRNA检测芯片表面的 特异性RNA探针的降解量，从而得到待测miRNA的含量。
[0026] 在一个实施例中，所述得到酶切后荧光强度后，还包括芯片再生步骤，所述芯片再 生步骤为采用10mm〇l/L的NaOH溶液再生芯片表面，再以不含核糖核酸酶的水溶液冲洗芯 片表面。
[0027] 在一个实施例中，所述加入核糖核酸酶水解所述miRNA/cDNA杂交体中的miRNA 的操作中，所述水解操作为将核糖核酸酶滴加在所述miRNA检测芯片表面，铺满探针区域， 静置10分钟，使核糖核酸酶切割所述miRNA/cDNA杂交体中的miRNA，释放出杂交体中的 cDNA，释放出来的cDNA又继续与芯片表面剩余的完整的miRNA探针链再杂交、再水解。
[0028] 在一个实施例中，所述核糖核酸酶为RNase H，所述RNase H的浓度为60U/mL。
[0029] 上述miRNA检测芯片中的特异性RNA探针和单链DNA探针均结合有荧光标记物， 并且特异性RNA探针含有用于检测目标miRNA的特异性序列。当待测miRNA逆转录形成 的cDNA能与该特异性序列杂交时，形成miRNA/cDNA杂交体。再通过使用核糖核酸酶酶切 miRNA/cDNA杂交体中的miRNA，使得结合在特异性RNA探针上的荧光标记物脱离，通过比较 芯片初始荧光强度和酶切后荧光强度，获得miRNA检测芯片表面的特异性RNA探针的降解 量，从而得到待测miRNA的含量。同时，释放的cDNA可以反复与芯片表面的特异性RNA序 列结合，再水解，直到芯片表面的RAN探针完全被水解，从而形成了一种基于非PCR的放大 检测效应，操作简便可以实现miRNA的高通量检测。
【附图说明】
[0030] 图1为一实施方式的miRNA检测芯片的结构示意图；
[0031] 图2为一实施方式的miRNA检测芯片的制作方法的流程图；
[0032] 图3为一实施方式的miRNA的检测方法的流程图；
[0033] 图4为cDNA浓度与初始荧光强度和酶切后荧光强度差值的标准曲线图；
[0034] 图5a为一实施方式的电动生物荧光显微镜下检测miRNA检测芯片上单链DNA探 针区域的初始荧光强度照片；
[0035] 图5b为一实施方式的电动生物荧光显微镜下检测miRNA检测芯片上单链DNA探 针区域的酶切后荧光强度照片；
[0036] 图6a为一实施方式的电动生物荧光显微镜下检测miRNA检测芯片上特异性 mir-29a-3p RNA探针区域的初始荧光强度照片；
[0037] 图6b为一实施方式的电动生物荧光显微镜下检测miRNA检测芯片上特异性 mir-29a-3p RNA探针区域的酶切后荧光强度照片；
[0038] 图7a为一实施方式的电动生物荧光显微镜下检测miRNA检测芯片上特异性 mir-181a-5p RNA探针区域的初始荧光强度照片；
[0039] 图7b为一实施方式的电动生物荧光显微镜下检测miRNA检测芯片上特异性 mir-181a-5p RNA探针区域的酶切后荧光强