一种相互易位染色体的断点分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞遗传工程领域，尤其是涉及一种相互易位染色体的断点分析方 法。
【背景技术】
[0002] 染色体相互易位是指非同源染色体的染色质发生交换而引起的染色体结构变化， 其在新生儿中的发生率约为1/500至1/6251。染色体相互易位携带者往往没有临床表型， 因此常常被称为染色体相互易位携带者。然而由于在减数分裂过程中染色体的异常分离， 会产生很大比例的染色体异常的配子。对于非Robertsonian易位携带者来说，理论上仅能 产生1/18完全正常的配子，1/18携带相互易位染色体的配子，其余均为异常配子。这些配 子受精后会形成部分三体或者部分单体的受精卵，容易导致胚胎发生早期流产。目前通过 荧光原位杂交（FISH)、基因芯片（SNP Array)以及新一代测序（NGS)技术对由于相互易位 异常减数分裂导致的部分三体或者部分单体胚胎进行植入前遗传学诊断（PGD)的技术已 经十分成熟。然而，目前还没有一种临床上可以接受的方法在胚胎植入前将染色体完全正 常的胚胎和携带相互易位染色体的胚胎区分开来。相互易位携带者仍有可能生育携带相互 易位染色体的后代，该后代到了生育年龄仍然面临由于反复流产而求助于PGD进行辅助生 殖的窘境。
[0003]寻找相互易位断点一直是细胞遗传学研究的热点之一。目前寻找相互易位断点的 主要方法有荧光原位杂交（FISH) +染色体步移法、相互易位染色体流式分选+新一代测序 技术（Next Generation Sequencing, NGS)、FISH+ 区域捕获 +NGS 及环化建库 +NGS 等。早 期寻找相互易位染色体断点的方法需要通过原位杂交确定大概的染色体位置，再通过染色 体步移测序寻找断点，方法费时费力，且由于基因组结构十分复杂，成功率不高。随着测序 技术的进步，测序成本迅速降低，大规模序列分析也逐步变为可能。人们逐步采用NGS技术 对基因组进行分析，从而寻找相互易位染色体断点。2008年德国Ropers研究小组采用特殊 的流式细胞分选术分选相互易位染色体，再对分选后的染色体进行NGS分析，从而找到断 点。这一技术需要特殊的流式细胞仪和分选技术，测序成本也很高，难于推广和临床应用。 2011年美国约翰霍普金斯大学和哈弗大学的两个独立小组均报道了运用区域捕获技术结 合NGS技术进行断点查找的工作，这一方法虽然可以大大减少测序通量，然而需要设计特 殊的捕获芯片，费时费力，仍然难以应用于临床。2012年新英格兰医学杂志报道了美国哈弗 大学的新研究成果，利用DNA环化建库结合NGS技术进行断点寻找。该方法无需进行中期 核分裂相的制备，可以利用DNA直接进行环化建库，分析断点信息，将断点分析又向临床推 进了一步。然而，该方法需要用到特殊的建库方法，测序量仍然较大（约需测序两亿八千万 reads)，在临床应用上仍有一定困难。目前还没有一种合适的方法进行相互易位染色体断 点分析。
【发明内容】
[0004] 基于此，有必要提供一种快速有效的相互易位染色体的断点分析方法。
[0005] -种相互易位染色体的断点分析方法，包括如下步骤：
[0006] 步骤S1，制作细胞周期处于有丝分裂中期的细胞样本；
[0007] 步骤S2,收集所述细胞样本，进行染色体显带操作，选取条带清晰的样本；
[0008] 步骤S3,在所述样本上找到相互易位的染色体，切割下易位染色体断点附近的染 色质，并对切割下的染色质进行扩增处理；
[0009] 步骤S4,对扩增处理后的染色质进行NGS测序分析，并将测序结果比对至人类基 因组上，获得相互易位染色体的断点位置。
[0010] 在其中一个实施例中，所述步骤S1中，所述细胞样本为外周血细胞样本。
[0011] 在其中一个实施例中，所述步骤S1包括如下步骤：将肝素抗凝外周血接种至含 PHA的RPMI1640培养基中，37°C恒温箱培养72小时后加入五氟尿嘧啶和尿嘧啶核苷，继续 培养17小时后加入胸腺嘧啶核苷，再在5小时后加入秋水仙素，再在2小时后收集得到所 述细胞样本。
[0012] 在其中一个实施例中，所述步骤S2包括如下步骤：
[0013] 步骤S21，向所述细胞样本中加入低渗液进行低渗处理；
[0014] 步骤S22,向低渗处理后的所述细胞样本中加入固定液进行固定处理，并制备固定 后的细胞悬液；
[0015] 步骤S23,对所述细胞悬液进行滴片处理，制得细胞滴片；
[0016] 步骤S24,对所述细胞滴片进行染色处理；
[0017] 步骤S25,染色处理后，进行镜检，选取中期染色体形态分散良好、条带清晰的样 本。
[0018] 在其中一个实施例中，在步骤S21中，所述低渗液是浓度为0. 075M的KC1溶液；
[0019] 在步骤S22中，所述固定液是体积比为3:1的甲醇与乙酸的混合液体，所述细胞悬 液是按照0. 5mL外周血培养收获的细胞制备2mL细胞悬液的标准制备。
[0020] 在其中一个实施例中，在所述步骤S23中，在滴片过程中，保持60-lOOcm的高度进 行滴片，每张盖玻片中部滴一滴所述细胞悬液。
[0021] 在其中一个实施例中，在所述步骤S24中，在进行染色之前还包括对细胞滴片进 行老化处理，并将老化处理后的细胞滴片置于胰蛋白酶溶液中消化处理的步骤，再对消化 处理后得到的细胞滴片进行所述染色处理，其中，染色处理使用的染色液为Giemsa染色 液。
[0022] 在其中一个实施例中，在所述步骤S3中，收集的易位染色体断点附近的染色质拷 贝数量为6-8个。
[0023] 在其中一个实施例中，所述步骤S3包括如下步骤：
[0024] 步骤S31，将样本置于显微镜下找到相互易位的染色体，并切割下易位染色体断点 附近的染色质；
[0025] 步骤S32,将切割下的染色质转移入含有UN1引物的收集液中，进行预扩增处理， 所述UN1引物的序列如SEQ ID No. 1所示；
[0026] 步骤S33,对将预扩增处理得到溶液置于含有UN1引物的扩增液中，进行PCR扩增 处理。
[0027] 在其中一个实施例中，在所述步骤S32中，所述收集液包括如下体积份数的各组 分：1 y L 的 5XT0P0 缓冲液、0? 5 y L 的 2mM dNTP、0. 1 y L 的 UN1 引物、3. 5 y L 的 dH20 以及 0. lyL的拓扑异构酶I。
[0028] 在其中一个实施例中，在所述步骤S32中，预扩增的条件为：先94°C处理5min，然 后按照94°C lmin、30°C l_5min、37°C 3min循环4-15次，其中，每个循环在30°C处理时均需 向反应体系中加入0. 2 y L的T7DNA测序酶。
[0029] 在其中一个实施例中，在所述步骤S33中，所述扩增液包括如下体积分数的各组 分：5yL 的 10XPCR 缓冲液、5yL 的 2mM dNTP、lyL 的 UN1 引物、40yL 的 _ 以及 2.5U 的Taq DNA多聚酶。
[0030] 在其中一个实施例中，在所述步骤S33中，所述PCR扩增的条件为：先94°C处理 5min，然后按照 94°C lmin、56°C lmin、72°C 1.5min 循环 30 次，再 72°C 5min，最后于 16°C保 存。
[0031] 在其中一个实施例中，在所述步骤S3之后，所述步骤S4之前，还包括对扩增产物 进行PCR荧光标记，并在有丝分裂中期核分裂相中进行FISH，以验证显微切割是否成功的 步骤。
[0032] 在其中一个实施例中，在所述步骤S4中，包括构建测序文库、对构建的测序文库 进行NGS测序以及对测序结果进行数据分析的步骤。
[0033] 在其中一个实施例中，在所述步骤S4之后还包括：
[0034] 在获得的断点位置附近设计引物，对样本的gDNA进行PCR扩增；
[0035] 对PCR产物进行Sanger测序验证，获取确切的断点位置。
[0036] 上述相互易位染色体的断点分析方法利用染色体显微切割技术获得易位染色体 断点附近染色质，再利用NGS技术测序分析，可以快速且相对价廉地进行断点的精确定位， 有利于对相互易位染色体进行后续分析，如可以利用这些信息设计引物，对相互易位携带 者的PGD胚胎进行诊断，分辨完全正常胚胎和携带相互易位染色体的胚胎，通过仅移植完 全正常的胚胎而阻断相互易位染色体在该家族中的传递。
[0037] 该分析方法将染色体显微切割技术和NGS技术结合起来形成一个新的 染色体显微切割为基础的NGS技术（Microdissection based next-generation sequencing, Micro-NGS)，通过染色体显微切割技术快速特异地富集断点附近染色质，既可 减少后期测序通量和信息分析难度以降低成本，又可以快速获得相互易位染色体断点附近 的序列信息，精确寻找到断点位置，为后期分析提供支持。
【附图说明】
[0038] 图1为一实施方式的相互易位染色体的断点分析方法的流程示意图；
[0039] 图2为实施例的部分核型图（a)及易位染色体涂探针FISH结果（b)和衍生染色 体跨断点片段显微切割产物反向杂交FISH验证结果，图中，（c)为der(l)，（d)为der (2)， chr表示染色体，der表示衍生染色体，本实施例外周血核型为46, XX，t (1 ;2) (p31 ;ql3);
[0040] 图3为NGS测序分析得到的断点分析示意图；
[0041]图4为衍生4号染色体跨断点DNA片段PCR扩增结果（a)和Sanger测序图（b)， 衍生9号染色体跨断点DNA片段PCR扩增结果（c)和Sanger测序图（d)，其中，M为DNA maker，1泳道为实验者的gDNA，2泳道为正常人gDNA，黑色箭头示断裂连接点处；
[0042] 图5为精确断点序列图。
【具体实施方式】
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