专利名称：1bl/1rs易位系的鉴定方法
技术领域：
本发明1BL/1RS易位系的鉴定方法，属于细胞生物学领域。
背景技术：
黑麦(Secale cereale L)是小麦的重要近缘植物之一，具有多花、多粉、广适等 特点(吴金华，麦类作物学报，2005，25(1) :115-119)。黑麦1RS片段上携带有抗叶锈、秆 锈、条锈和白粉病的抗性基因Lr26、 Sr31、 Yr9、 Pro8，及抗飞虱基因Gb2和大量抗逆基因， 1BL/1RS易位小麦面粉的可溶性纤维含量高于一般小麦，对人体有益(尚海英，西南农业 学报，2004，17(3) :273-277)。 1RS上还存在增加小穗数的QTL位点和提高产量性状、增 加蛋白质含量等多种优良性状相关基因(侯永翠，西南农业学报，2003，16(4) :14-19)。 Melz、 Schlegel和Thiele(1992)通过对附加系、端体系和小麦的phl6系分析，发现1RS、 1RL、2RL、3RS和5RS与对应的小麦染色体臂间有部分同源关系，因而可产生小麦_黑麦的 异附加系、代换系和易位系。由于1RS在遗传上能够很好的补偿1BS缺失引起的负效应 (Lukasz-ewski， Genome， 2004， 47 (1) :36)，所以小麦1B/1R易位系可以直接应用于小麦育 种(王静，作物学报，2006， 32(1) :30-33， 131-117)。 虽然普遍认为1RS上有编码黑麦碱的Sec — 1位点，而1RS代替了 IBS造成了 IBS 上重要基因位点Glu — 3、 Gli — 1的丢失，造成1BL/1RS易位小麦面粉的烘烤加工品质较 差(任燕，麦类作物学报，2006，26(3) :152-158)。但短时间内很难育出新的品种来取代所 有的1BL/1RS易位品种。所以利用不含黑麦碱的改良1BL/1RS新易位来替换中国小麦品种 中普遍存在的1BL/1RS易位，既可保持1BL/1RS易位系的优点又能改善其烘烤加工品质。
目前对1BL/1RS易位系进行鉴定主要应用细胞学，生化和分子标记等技术。
发明内容
1、1BL/1RS易位系的细胞遗传学鉴定方法
(1)有丝分裂和减数分裂的染色体分析 1RS上的随体或次縊痕在小麦背景中表现不出来，普通小麦中期I细胞中通常有 四条染色体(1B、6B)短臂上有明显的随体，若1RS取代了 1BS，则1BL/1RS易位系的染色 体中就只有两条染色体带有随体，据此能够快速判断1RS的存在，不过只适用于1RS取代 IBS的情况，在取代1AS或IDS时不适用(William, Euphytica， 1998， 108 :1-19) 。 Mettin、 Zeller和Berzonsky等通过对有丝分裂中期细胞中含随体的染色体进行计数鉴定出 1BL/1RS易位系。 另外，利用染色体同源性，用待测的材料与普通小麦的1B双单体或1B/1R易位系 配杂交组合，从F1的中期I的花粉母细胞的构型中判断是否为1BL/1RS易位系(Cuadrado M C， Genome， 1988,30 :793-796)。 Mettin等利用待测材料和整倍体小麦、已知1BL/1RS易 位系杂交，观察Fl的中期I的花粉母细胞的构型鉴定出待测品种1BL/1RS易位系。 [ooog] (2)染色体分带技术
染色体分带技术是经过酸碱处理后染色体上显示着色深浅不一的带纹的技术，具 体的显带机理说法各异，目前比较一致的看法是带区的染色质更能抵抗分带过程中的各 种处理。染色体分带技术主要有C-带、N-带，根据黑麦染色体的端体上含有不同于小麦的 特异带纹，可鉴定1BL/1RS易位系、1R代换系和1R附加系。Rayburn等用N-带从普通小麦 群体中鉴定出1BL/1RS易位系。(钟少斌等，作物学报，1991，17(5) :321-325)利用C带和 N带技术对普通小麦选系"840-59-4-2"进行分析，确定其为1BL/1RS易位系。但是分带技 术一般不能用来鉴定小片段的易位系。
(3)原位杂交 原位杂交是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的 方法。它在操作程序上比分带技术要复杂，但鉴定结果更精确，能够鉴定小片段的易位系， Islam等曾预言在鉴定黑麦小片段上原位杂交将比生化或分带技术更有利用价值。原位杂 结合分带技术能够鉴定1AL/1RS、 1DL/1RS和1BL/1RS，且能够确定易位点丄即itan和Jiang 用FISH鉴定出Amigo为1BL/1RS整臂易位系。
4、小结 (1)细胞遗传学方法的比较 通过1RS和1BS上特异的C-带、1BS随体的缺失以及黑麦的基因组原位杂交 (GISH)和荧光原位杂交(FISH)可以鉴定1BL/lRS易位系，除C-分带法外，其他方法只能区 分1RS是否完整进入小麦染色体组，但不能可靠地区分是1BL/1RS还是1AL/1RS或1DL/1RS 易位。 (2)生化技术的比较 生化标记的检测相对较为简便和快速，所需费用也并不太高。几种方法分别是从 植物的胚乳、面粉和叶片中取样，均不破坏胚，均可快速简单地检测大量样品，除HPLC外， 均能有效的鉴定1AL/1RS、1BL/1RS和1DL/1RS易位系，凝胶电泳可以区别不同来源的1RS， 而且，适当结合同工酶标记、单克隆抗体、凝胶电泳和Elisa能够鉴定1RS易位系和1R代换 系。 (3)分子标记技术的比较 SSR标记优点在于数量丰富、带型简单、标记呈共显性；但其前期工作量较大，涉 及到大量DNA序列分析及引物合成，工作量大、费用高。RAPD标记由于重复性差，还存在共 迁移的问题，使其在应用上受到一定的限制。尽管RFLP技术已在许多领域取得了令人瞩目 的研究成果，但RFLP对DNA多态性检测的灵敏度不高，RFLP连锁图上还有较大的空间区； 同时，RFLP还存有操作复杂、成本高、费时等不足。因此，RFLP应用和推广受到一定限制。
不同分子标记各有优缺点，应针对不同对象和研究目的选择合适的分子标记。同 时，分子标记的选择还应考虑到DNA用量的多少、标记(探针、引物)获得的难易、技术掌握 的程度以及实验费用等。另外，分子标记必须与其它实验手段(如细胞学、生化、原位杂交 等)相结合，以便在外源种质鉴定中发挥最大的功效。
(4)几种方法的综合比较 Javornik等对鉴定小麦背景中1BL/1RS易位染色体的N-带技术和3种蛋白质电 泳方法间进行比较研究，认为蛋白质电泳技术是最为简便有效的方法，魏育明等(2001)对 生化和分子标记方法，包括蛋白质电泳技术(A-PAGE)、荧光原位杂交(FISH) 、RFLP、RAPD和特异性PCR标记进行比较研究，结果表明，RAPD标记难以鉴定1BL/1RS易位染色体，其余均 能对1BL/1RS易位染色体进行有效鉴定，FISH和RFLP方法比较费时费力且花费昂贵，而特 异性PCR标记又在一定程度上受模板DNA浓度的影响。所以，蛋白质APAGE方法是一种简 单、快速、经济有效的方法，最易于在小麦育种选择中应用。 但是，在外源种质鉴定中，单凭一种技术很难作出完全正确的判断，需要利用多种 技术相互补充、相互印证。所以目前外源种质的鉴定已成为一个多技术的综合利用。
权利要求
1BL/1RS易位系的鉴定方法其特征在于(1)细胞遗传学方法的比较通过1RS和1BS上特异的C-带、1BS随体的缺失以及黑麦的基因组原位杂交(GISH)和荧光原位杂交(FISH)可以鉴定1BL/1RS易位系，除C-分带法外，其他方法只能区分1RS是否完整进入小麦染色体组，但不能可靠地区分是1BL/1RS还是1AL/1RS或1DL/1RS易位；(2)生化技术的比较生化标记的检测相对较为简便和快速，所需费用也并不太高。几种方法分别是从植物的胚乳、面粉和叶片中取样，均不破坏胚，均可快速简单地检测大量样品，除HPLC外，均能有效的鉴定1AL/1RS、1BL/1RS和1DL/1RS易位系，凝胶电泳可以区别不同来源的1RS，而且，适当结合同工酶标记、单克隆抗体、凝胶电泳和Elisa能够鉴定1RS易位系和1R代换系；(3)分子标记技术的比较SSR标记优点在于数量丰富、带型简单、标记呈共显性；但其前期工作量较大，涉及到大量DNA序列分析及引物合成，工作量大、费用高；RAPD标记由于重复性差，还存在共迁移的问题，使其在应用上受到一定的限制。尽管RFLP技术已在许多领域取得了令人瞩目的研究成果，但RFLP对DNA多态性检测的灵敏度不高，RFLP连锁图上还有较大的空间区；同时，RFLP还存有操作复杂、成本高、费时等不足；因此，RFLP应用和推广受到一定限制；不同分子标记各有优缺点，应针对不同对象和研究目的选择合适的分子标记，同时，分子标记的选择还应考虑到DNA用量的多少、标记(探针、引物)获得的难易、技术掌握的程度以及实验费用等，另外，分子标记必须与其它实验手段(如细胞学、生化、原位杂交等)相结合，以便在外源种质鉴定中发挥最大的功效；(4)几种方法的综合比较Javornik等对鉴定小麦背景中1BL/1RS易位染色体的N-带技术和3种蛋白质电泳方法间进行比较研究，认为蛋白质电泳技术是最为简便有效的方法，魏育明等(2001)对生化和分子标记方法，包括蛋白质电泳技术(A-PAGE)、荧光原位杂交(FISH)、RFLP、RAPD和特异性PCR标记进行比较研究，结果表明，RAPD标记难以鉴定1BL/1RS易位染色体，其余均能对1BL/1RS易位染色体进行有效鉴定，FISH和RFLP方法比较费时费力且花费昂贵，而特异性PCR标记又在一定程度上受模板DNA浓度的影响，所以，蛋白质APAGE方法是一种简单、快速、经济有效的方法，最易于在小麦育种选择中应用；但是，在外源种质鉴定中，单凭一种技术很难作出完全正确的判断，需要利用多种技术相互补充、相互印证，所以目前外源种质的鉴定已成为一个多技术的综合利用。
全文摘要
黑麦(Secale cereale L)是小麦的重要近缘植物之一，具有多花、多粉、广适等特点，黑麦1RS片段上携带有抗叶锈、秆锈、条锈和白粉病的抗性基因Lr26、Sr31、Yr9、Pro8，及抗飞虱基因Gb2和大量抗逆基因，1BL/1RS易位小麦面粉的可溶性纤维含量高于一般小麦，对人体有益。1RS上还存在增加小穗数的QTL位点和提高产量性状、增加蛋白质含量等多种优良性状相关基因。Melz、Schlegel和Thiele通过对附加系、端体系和小麦的ph16系分析，发现1RS、1RL、2RL、3RS和5RS与对应的小麦染色体臂间有部分同源关系，因而可产生小麦-黑麦的异附加系、代换系和易位系。由于1RS在遗传上能够很好的补偿1BS缺失引起的负效应，所以小麦1B/1R易位系可以直接应用于小麦育种，本研究就是基于此进行的。
文档编号G01N27/26GK101760534SQ20081023799
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月19日 优先权日2008年12月19日
发明者曹淑兰 申请人:曹淑兰