专利名称：一个簇毛麦6vs染色体特异的分子标记6vs-ssd及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和遗传育种科学技术领域，具体涉及一个特异追踪簇毛麦6VS染色体的分子标记及其用法。
背景技术：
小麦是全球三大粮食作物之一，也是我国总产第一的粮食作物，是保障我国粮食安全的重要决定因素之一。小麦在其生育进程中常会受到生物或非生物胁迫的影响。小麦白粉病是一种世界性小麦病害，近年来随着我国农田水利设施改善和水肥条件提高，其危害逐年加重。通过远缘杂交和染色体工程技术手段育成的小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位系对目前已发现的白粉病生理小种均表现高抗或免疫，其抗白粉病基因位于簇毛麦6V染色体短臂上(6VS)，是目前对小麦白粉病抗谱最广、抗性最强的基因。近年来T6AL. 6VS易位系在小麦抗白粉病新品种选育中得到广泛利用，目前已育成20多个抗白粉病小麦新品种，·推广面积超过5000万亩。T6AL. 6VS易位系是在普通小麦遗传背景中由簇毛麦6V染色体短臂(6VS)替换了普通小麦6A染色体的短臂(6AS)，从而形成T6AL. 6VS易位染色体。由于簇毛麦与普通小麦亲缘关系较远，导致二者不发生染色体重组，T6AL. 6VS易位染色体始终以易位的形式出现在后代中。目前，未发现利用T6AL. 6VS易位系培育的新品种或新品系中出现染色体易位形式的改变。因此，簇毛麦6VS控制的性状及其载有的DNA序列均以协同传递的方式出现在后代中。目前，部分研究已公布了部分与6VS上抗白粉病基因Pm21连锁的相关分子标记OPT171400,OPT171900 ,SCAR1400,SCAR1265,NAU/XiBao15902 和 NAU/XiBaol61586。但是，总体而言，这些标记在标记辅助选择育种中都存在不稳定的缺点，一个原因是由标记类型决定的，如RAPD标记0PT1714QQ和0PT1719QQ ;其次是由于标记序列过长(大多接近或超过lOOObp)、PCR反应体系和反应条件要求苛刻，PCR结果可重复性差造成的。这些缺点均不利于标记辅助选择技术在小麦育种实践中的应用。EST (expressed sequence tag,表达序列标签)是指从植物不同组织来源的cDNA文库中随机挑选克隆，对其5’和3’端进行测序获得的短cDNA序列。EST-STS(sequence-tagged site, STS)标记是直接依据已经定位于基因组物理图上的EST序列设计引物，对基因组或者cDNA进行扩增，从中寻找与目的基因连锁或具有染色体特异性的EST标记。由于EST-STS标记直接来源于表达基因序列，保守性较高，特别有利于界定物种之间的差异。因此，基于比较基因组学原理，利用普通小麦EST图谱，同样可以开发普通小麦亲缘物种簇毛麦特定染色体的特异性分子标记。本发明就是基于上述思想指导下，利用比较基因组学原理，根据普通小麦bin-map图谱上第6部分同源群短臂上的EST序列设计以PCR技术为基础的EST-STS标记，筛选簇毛麦6V染色体短臂(6VS)特异性分子标记，用于快速检测和追踪普通小麦遗传背景中T6AL. 6VS易位染色体及其控制的抗白粉病性状，为小麦抗白粉病分子标记辅助选择育种提供新型、实用、高效的分子标记。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异追踪簇毛麦6VS染色体的分子标记及其用法，它利用比较基因组学原理，根据普通小麦bin-map图谱上第6部分同源群短臂的EST序列，设计以PCR技术为基础的EST-STS标记引物，筛选簇毛麦6VS染色体特异性分子标记，为抗白粉病小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位系在小麦抗白粉病新品种培育中的应用提供一种新型、实用、高效的分子标记辅助选择技术。为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案它是根据普通小麦bin-Map图谱第6部分同源群短臂的EST序列BE585684设计得到的，标记引物扩增出的一段约350bp的DNA条带位于簇毛麦6VS染色体，可以特异地追踪6VS染色体及其控制的抗小麦白粉病性状，标记引物序列为
6VS-SSDF :5’-CCAACTCTAGCTGACCGCAGACTA-3’ (SEQ ID NO. I),
6VS-SSDR :5’ -ATTCCATGGTGTAATAGCTCCAACTAC-3’ (SEQ ID NO. 2)。本发明还公开了所述的簇毛麦6VS染色体特异的分子标记6VS-SSD在追踪小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位染色体中的用途。用所述的簇毛麦6VS染色体特异的分子标记6VS-SSD追踪小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位染色的方法，是用该分子标记引物对待测材料进行PCR扩增，扩增出350bp条带的材料，为含有小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位染色体的材料。本发明所述分子标记的具体用法为
(1)PCR反应体系:10μ L 反应体系中含约 10 — 20ng模板DNA，IXPCR buffer, I. 5mmolΓ1 MgCl2, 200mmol Γ1 dNTP，两条引物终浓度各为 0. 2 μ mol Λθ. 5U Taq DNA 聚合酶，用无菌蒸懼水补充反应体系至IOyL;
(2)PCR反应程序94°C预变性3分钟；94°C变性20秒，58°C退火30秒，72°C延伸30秒，32个循环；72°C延伸5分钟；4°C保存；
(3)PCR产物检测PCR扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，用银染法染色。本发明在利用T6AL. 6VS易位系为亲本进行抗白粉病性状的追踪时，凡是扩增出350bp条带的材料，都含有小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位染色体，并对白粉病表现高抗；凡是不能扩增出350bp条带的材料，都不具有T6AL. 6VS易位染色体，相应丢失由6VS染色体控制的白粉病抗性。本发明具有以下有益效果
I、本发明的分子标记6VS-SSD在鉴定簇毛麦6VS染色体时特异性强已开发的分子标记0PT1714(i(i和0PT1719(i(i都非6VS特异性标记，只有在亲本间存在与6VS的多态性时，才可以利用，而使用6VS-SSD时，无论涉及何种亲本，只要出现350bp条带，就可以确定材料中含有6VS染色体。2、本发明的6VS染色体特异性EST-STS标记相较SCAR标记更易于识别PCR扩增失败导致的“假阴性”:本发明的标记为共显性标记，在普通小麦遗传背景中，无论是否具有T6AL. 6VS易位染色体，都可以扩增出两条约为500bp的背景条带，可用于判断PCR扩增是否成功，排除“假阴性”。3、本发明的分子标记稳定性好，容易为育种实践利用本发明的标记由于目标条带较短，仅350bp，PCR扩增时对DNA模板质量的要求不高，在部分降解的DNA模板中仍能有效扩增出目标产物，而且PCR反应的延伸时间仅需30秒，有利于提高标记辅助选择的效率。
图I :分子标记 6VS-SSD 的 PCR 扩增结果。M DNA marker DL2000 ；1 :簇毛麦；2 普通小麦；3 :小麦-簇毛麦易位系T6AL. 6VS ；Γ12 :宁麦9号与T6AL. 6VS易位系杂交组合的分离群体。箭头所示为350bp的特异性条带。
具体实施方式
本发明具体实施方式
采用以下技术方案根据普通小麦bin-Map图谱第6部分同源群的EST序列BE585684设计一对标记引物，利用PCR技术扩增出的一段350bp的DNA条带，该条带可位于簇毛麦6VS染色体，能特异地追踪6VS染色体及其控制的抗小麦白粉病性状。实施例
I、引物的设计与合成
根据美国农部网站http://wheat. pw. usda. gov的信息,搜索定位于普通小麦第6部分同源群的EST序列,利用Primer Premier 5. O软件进行引物设计，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。2、簇毛麦6VS染色体特异性EST-STS标记的筛选
(I)PCR扩增以簇毛麦、普通小麦、小麦-簇毛麦易位系T6AL. 6VS为材料(均为公知公用种质材料，由南京农业大学细胞遗传研究所提供)，提取基因组DNA后进行PCR扩增，IOyL PCR 反应体系中含约 10 — 20ng 模板 DNA，1XPCR buffer, I. 5mmol Γ1 MgCl 2,200mmol Γ1 dNTP，两条引物终浓度各为O. 2 μ mol Γ',Ο. 5U Taq DNA聚合酶，用无菌蒸馏水补充反应体系至10 μ L ；PCR反应程序为94°C预变性3分钟；94°C变性20秒，58°C退火30秒，72 °C延伸30秒，32个循环；72°C延伸5分钟；4°C保存。(2) PCR产物的检测PCR扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(29:1)上进行电泳分离，采用银染法染色。 (3)PCR结果分析本发明筛选到一个簇毛麦6VS染色体特异的分子标记6VS-SSD，标记引物是根据定位于小麦第6部分同源群短臂的EST序列BE585684设计，具体序列为6VS-SSDF :5’ -CCAACTCTAGCTGACCGCAGACTA-3’ (SEQ ID NO. I),
6VS-SSDR :5’-ATTCCATGGTGTAATAGCTCCAACTAC-3’ (SEQ ID NO. 2)。以该标记引物进行PCR扩增，能在普通小麦中扩增到两条约为500bp的DNA条带，在簇毛麦中扩增到一条约为350bp的DNA条带，而在小麦-簇毛麦易位系T6AL. 6VS中，既能扩增到两条约500bp条带,也能扩增到一条约350bp条带(见图I中1 3),表明350bp条带可定位于簇毛麦6VS染色体，因此，分子标记6VS-SSD能在小麦背景中特异性追踪簇毛麦6VS染色体。
3、簇毛麦6VS染色体特异性标记6VS-SSD在分子标记辅助选择育种中的应用利用筛选到的簇毛麦6VS染色体特异性标记引物6VS-SSD，对宁麦9号(公知公用，由江苏省农业科学院培育)与抗白粉病T6AL. 6VS易位系(公知公用，由南京农业大学细胞遗传研究所创制并提供)杂交组合的分离群体进行鉴定，结合白粉病抗性鉴定，结果显示在所有供试材料中，凡具有350bp条带的材料，都表现高抗白粉病；凡缺失350bp条带的材料都表现高感白粉病(见图I中4 12)。该结果表明，本发明开发的EST-STS标记6VS-SSD能有效追踪小麦背景中的簇毛麦6VS染色体，在分子标记辅助选择育种中具有潜在的应用价值。·
权利要求
1.一个簇毛麦6VS染色体特异的分子标记6VS-SSD，其特征在于该分子标记引物的序列为6VS-SSDF :5’ -CCAACTCTAGCTGACCGCAGACTA-3’，6VS-SSDR :5’ -ATTCCATGGTGTAATAGCTCCAACTAC-3’。
2.权利要求I所述的簇毛麦6VS染色体特异的分子标记6VS-SSD在追踪小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位染色体中的用途。
3.一种用权利要求I所述的簇毛麦6VS染色体特异的分子标记6VS-SSD追踪小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位染色的方法，是用该分子标记引物对待测材料进行PCR扩增，扩增出350bp条带的材料，为含有小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位染色体的材料。
全文摘要
本发明公开了一个特异追踪簇毛麦6VS染色体的分子标记6VS-SSD及其用法，它涉及分子生物学和遗传育种科学技术领域。该标记引物是根据小麦第6部分同源群短臂的EST序列BE585684设计，具体序列为6VS-SSDF5’-CCAACTCTAGCTGACCGCAGACTA-3’，6VS-SSDR5’-ATTCCATGGTGTAATAGCTCCAACTAC-3’，以标记引物进行PCR时能扩增出一条350bp的特异性DNA条带，能快速有效地追踪簇毛麦6VS染色体及其控制的抗小麦白粉病性状，在小麦抗白粉病分子标记辅助选择育种中具有较强的实用价值。
文档编号C12Q1/68GK102943073SQ20121029471
公开日2013年2月27日 申请日期2012年8月20日 优先权日2012年8月20日
发明者何华纲, 别同德, 朱姗颖, 胡向均, 李晶晶 申请人:江苏大学