专利名称：一种检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学检测领域，涉及结核分枝杆菌利福平耐药性检测方法，提出一种检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的方法。
背景技术：
近年全球范围内，发达国家和发展中国家都出现结核病流行的大回升。据统计，全球已有1/3 (约20亿)人感染了结核菌，现有结核病人约2000万，每年新发生约900万病人，每年死亡人数高达300万。而耐多药结核病(Multidrug-resistant tuberculosis,·MDR-TB) / 广泛耐药结核病(Extensively drug-resistanttuberculosis, XDR-TB)的涌现，更是对全球公共卫生安全构成了严重威胁，大大增加全球结核病控制的负担。据WHO资料显示，中国现有的耐药结核病患者数占全球20%左右，结核病依然是中国三大传染病之一，防治仍然面临着严峻的挑战。2007— 2008年全国结核病耐药基线调查显示我国肺结核病人中耐多药率为8. 32%，广泛耐药率为0.68%。据此估算，我国每年新发耐多药(MDR)肺结核患者12万例，而人员迁移流动、城市居住条件拥挤不堪等现况加剧了它的发生。目前结核病最常用的诊断方法已有100多年的历史，抗结核病药物在过去50年间没有变化，遏制耐药结核病蔓延需要创新理念，而更深入地了解抗结核药物以及结核分枝杆菌的耐药机制对于更好地预防和控制结核的蔓延是非常必要的。利福平自1972年首次作为抗结核药物以来，一直发挥着巨大的杀菌效力，它是目前一线抗结核药物中最重要的药物之一。利福平抗菌谱广且作用强大，对静止期和繁殖期的结核菌均有作用，能增加链霉素和异烟肼的抗菌活性。它通过作用于结核分枝杆菌的RNA聚合酶3亚基，抑制RNA聚合酶活性，干扰分枝杆菌RNA的转录，阻碍蛋白质合成而发挥抗菌作用。RNA聚合酶是由四个不同的亚基a、00 '和0组成,分别由rpoA、rpoB、rpoC和rpoD基因编码。全酶是由核心酶和0亚基共同构成，核心酶是由两条a链，一条0链和一条链4条肽链形成的具有催化能力的酶，0亚基作为启动子特异地启动转录。目前，对利福平耐药已经成为结核病治疗方面一个较为严重的问题，并且这些耐药菌很快还会产生对异烟肼的耐药，从而形成耐多药结核分枝杆菌。研究发现结核分枝杆菌耐利福平的发生是由于其编码RNA聚合酶3亚基的rpoB基因突变所致。rpoB基因含有3534bp的开放阅读框架，编码1178个氨基酸。此基因中少数密码子突变会引起它所编码的氨基酸的改变，使得RNA聚合酶分子上利福平结合位点的构象发生改变，从而丧失了结合利福平的能力导致耐药性的出现。超过95%的突变都是发生在rpoB基因的一个高度保守的81bp(507飞33位27个氨基酸)的核心区域内，主要包括点突变、缺失突变等，因此该区又称为RFP耐药决定区。突变通常发生在531、526和516位密码子，其他突变的密码子还有511、513、514、515等，，但最常见的突变位点是531位丝氨酸(Ser)—亮氨酸(Leu)，526位组氨酸(His)—酪氨酸(Tyr) >516位天冬氨酸(Asp)—纟颜氨酸(Val),其中531位是突变率最高的密码子。现有的结核分枝杆菌利福平耐药性检测所使用的方法，有绝对浓度法、RFLP法和测序法，其中绝对浓度法存在着二次培养，每次八周，周期长及污染机率高；RFLP法由于采用限制性内切酶，而RFP耐药决定区内缺少合适的酶切位点，致rpoB基因突变的检出率仅为10%，不能满足临床诊断的要求；测序法价格昂贵等缺陷。
发明内容
发明人在多年从事医学检测的工作和研究活动中，发现现有的对结核分枝杆菌利福平耐药性检测方法，存在着诸多缺陷，经过不断探索分析，反复大量试验，目的在于提出一种检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的方法，能够快速、准确、低成本检测出rpoB基因RFP耐药决定区的全部突变，更有效地满足临床诊治的需求。本发明目的通过以下技术方案实现
一种检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的方法，该方法采用以下步骤培养-提取-扩·增-纯化-消化-分离-密集-显像-鉴定，其中
A.培养，米集病人痰液标本于37°C进行一次培养,制备结核分枝杆菌培养物；
B.提取，从上述结核分枝杆菌培养物中提取总DNA；
C.扩增，采用包括新型上、下游引物在内的反应体系进行PCR反应，扩增出258bpDNA基因片段；
所述反应体系为 IOXTaq Buffer 5 u 1,10mmol/L dNTP 4 y 1，20mmol/L 新型上、下游引物 Iu 1/pair, DNA 模板 2. 5ul,5u/ U I Taq DNA polymerase 0. 5ul,加灭菌双蒸水至总体积50ul,
所述新型上游引物采用地高辛标记序列5’ DIG-GCGGCGGATCAAGGTCAAGA 3’，新型下游引物采用地高辛标记序列5’ DIG-CGAGTGGCACACAGACGCGGC 3，
所述PCR反应的条件，采用94°C预变性5min，然后按93°C 0. 5min变性，采用58°C 45s退火，72°C Imin延伸，经35个循环后，最后一次循环72°C延伸IOmin;
D.纯化，对上述PCR反应扩增出的258bpDNA基因片段产物，采用核酸外切酶和DNA片段纯化试剂进行提纯；
E.消化，采用核糖核酸裂解酶对纯化后的258bpDNA基因片段产物进行裂解消化，成为长度不同的多个基因片段；
所述消化的条件采用从30°C以0. 1°C /s的速度逐渐上升到80°C对基因片段进行梯度加热以充分消化；
F.分离，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离经消化后的多个基因片段；
G.密集，将分离后的多个基因片段转移到醋酸纤维滤膜上，并加以提纯、浓缩、密集；
H.显像，采用标记地高辛显色系统对密集后的醋酸纤维滤膜进行条带着色显像，得到基因片段图谱；
I.鉴定，以正常型做对照，依据图谱中条带长度、数量、迁移位置及显像强度鉴别确定结核分枝杆菌rpoB突变基因。本发明的这种检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的方法，与现有的检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的方法相比，由于采用一次培养，减少了培养次数，缩短了检测周期，实现了快速检测，又减少了细菌、真菌等杂菌的污染机率；由于反应体系中采用了能扩增覆盖rpoB基因RFP耐药决定区的新型上、下游引物，对目的基因片段进行扩增，生成的258bp基因片段适于消化生成良好的条带；由于在消化前采用了纯化步骤，排除了 PCR反应中异常扩增产物和未充分反应的剩余反应体系等杂质；由于采用核糖核酸裂解酶进行裂解消化，无需选择酶切位点，能检测rpoB基因耐药决定区内的全部突变基因；由于采用梯度温度消化，能对PCR产物进行充分消化；由于在显像前将分离后的消化产物转移到醋酸纤维滤膜上加以提纯密集，增强了图谱条带的显像清晰度；由于采用标记地高辛显色系统，对条带进行着色，排除了环境中核酸杂质对图谱的干扰，增强了图谱条带着色的识别性，从而提高了结核分枝杆菌rpoB突变基因检测的检出率和鉴定的准确率；由于采用了常规分子生物学设备及易得的药剂，所以降低了成本。总之，本发明具有检测快速、检出率高、图谱识别性好、鉴定准确、成本低等显著优点，更确切有效地满足临床诊治的需求。
图I表示本发明检测流程 图2表示结核分枝杆菌rpoB突变基因图谱。·
具体实施例方式结合附图和实施例，进一步说明本发明一种检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的方法的具体步骤，其特征和优点更加清楚。实施例，参见图I本发明一种检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的方法，采用以下步骤培养-提取-扩增-纯化-消化-分离-密集-显像-鉴定，其中
A.培养，采集肺结核病人痰液，接种于改良罗氏培养基(由无锡某某药业公司提供)，于37 °C孵箱中一次培养4周；
B.提取，取一环结核分枝杆菌培养物溶于100U I蒸馏水，100°C加热30分钟，12，OOOg离心10分钟，取上清液2. 5 ill作为PCR反应体系中的DNA模板，其余贮存于_20°C冰箱中备用;
C.扩增，采用以下的反应体系进行PCR扩增反应
IOXTaq Buffer 5. 0 y，10mmol/L dNTP 4. 0 y 1，20mmol/L 新型上、下游引物 I. Oy I/pair, DNA 模板 2. 5 U I, 5u/U I Taq DNA polymerase 0. 5 U I,加灭菌双蒸水至总体积50u I ；
其中新型上游引物采用地高辛标记序列5’ DIG-GCGGCGGATCAAGGTCAAGA 3’，新型下游引物采用地高辛标记序列5’ DIG-CGAGTGGCACACAGACGCGGC 3’ ；
该新型上、下游引物(由发明人设计，委托某某公司制备)，用无菌双蒸水溶解并稀释到20mmol/L,并贮存于_20°C冰箱中备用；
扩增反应条件，采用94°C预变性5min，然后按93°C 0. 5min变性，采用58°C 45s退火，72°C Imin延伸，经35个循环后，最后一次循环72°C延伸lOmin，可扩增rpoB基因开放阅读框共258bp长的基因片段；
D.纯化，向扩增后的258bp基因片段中加入5U/ill核酸外切酶I(由某某生物工程有限公司提供)10iU，在37°C保温15min，再采用离子交换柱(由某某生物工程有限公司提供)对258bp基因片段进行洗脱纯化；
E.消化，将纯化后的258bp基因片段在热循环器中加热至95°C，维持15s，再冷却至30°C，加入一定量的核糖核酸裂解酶预混液(由某某生物有限公司提供)，所用量能满足核糖核酸裂解酶预混液中 MOPS 10 mM, Tween-20 0. 05%, Nonidet P-40 0. 05%,MnCl2 0. 2 mM, Cleavase I enzyme 25U，pH 7. 5的组分含量的要求，再将温度从30°C以0. I0C / s的速度升高到80°C，加入16ul终止液，得到含长度不同的基因片段的混合物；
F.分离,将10%变性聚丙烯酰胺凝胶板室温聚合40min后,40°C加热40min,将凝胶板温度升至50°C，向凝胶板加样孔注入10 — 15iU消化得到基因片段，在0. 5 X TBE缓冲液中垂直电泳(电压600V，电流40-50mA) 20min，使长度不同的基因片段在凝胶板内彼此间分离开；
G.密集
将凝胶板中的基因片段用半干法转移到醋酸纤维滤膜上，使基因片段加以提纯、浓缩、·磁隹
山: oH.显像，将密集后的醋酸纤维滤膜按下述步骤处理
(1)用缓冲液I在室温下冲洗醋酸纤维滤膜2次，每次3min，去除杂质并维持pH值； 该缓冲液 I 的成分含IOOmmol / L tris-HCl, IOOmmol / L NaCl, SOmmoI /T, MgCl,
pH 7. 5 ；
(2)将冲洗处理后的醋酸纤维滤膜，放入封闭液并于室温下浸泡45min，起到封闭未吸附核酸的空白部位的作用，以减少显色液的异常着色；
该封闭液含以下成分封闭剂(Boehringer Mannheim) 0. 2%, NaCl 150mM, Tris-HClIOOmM,pH 7.5 ；
(3)加入40iiI碱性磷酸酶标记的地高辛抗体(20 ii g/ml)于37°C保温30min,结合于基因片段上，以便更好地着色。(4)用缓冲液I在室温下再漂洗醋酸纤维滤膜3次，每次3min，去除杂质并维持pH值；
(5)用缓冲液2于室温下浸泡醋酸纤维滤膜lOmin，固定地高辛抗体；
缓冲液 2 的成分含SDS 0. l%,NaCl 150mmol / L, tris-HCl IOOmmol / L，pH 7. 5 ；
(6)用300u g/ml的BCIP / NBT显色液室温避光浸泡醋酸纤维滤膜4h，并每隔I小时取出在显微镜下观察显色强度，使基因片段良好显像；
(7)取出醋酸纤维滤膜晾干；
(8)对晾干后的醋酸纤维滤膜在成像系统中扫描，制成本发明的图谱。I、鉴定
以正常型的条带为对照，依据图谱中条带的分子量变大或变小、条带的缺失或多出、条带位置的迁移、条带显像强度的明暗等来鉴别突变基因。与正常型条带一致的图谱中的条带表示未突变基因。参见图2，以谱带20为对照，谱带I 一 19表示突变基因，被检RFP耐药决定区其它位未突变基因，图中未示。其中，谱带I表示526 (CAC->TAC)点突变，谱带2表示531 (TCG->TTG)点突变，谱带3表示526 (CAC->CTC)点突变，谱带4表示517 — 518 (CAGAAC)缺失突变，谱带5表示513 —516 (AATTCATGG)缺失突变，谱带6表示514 (CAA_>TTC)点突变，谱带7表示511 (CTG_>CGG)点突变，谱带8表示512 (AGC->ACC)点突变，谱带9表示513 (CAA_>AAA)点突变，谱带10表示513(CAA->CTA)点突变，谱带11表示517 — 518 (CAGAAC)缺失突变，谱带12表示531 (TCG->TTG)点突变，谱带13表示526 (CAC->AAC)点突变，谱带14表示516 (CFG->CGG)点突变，谱带15表示513 (CAA->AAA)点突变，谱带16表示515 (CAC->GAC)点突变，谱带17表示531 (TCG->TTG)点突变，谱带18表示515 (CGG->CGT)点突变，谱带19表示528 (CGC->CGT)点突变，谱带20表示以正常型为对照。·
权利要求
1. 一种检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的方法，其特征是该方法采用以下步骤培养-提取-扩增-纯化-消化-分离-密集-显像-鉴定，其中 A.培养，米集病人痰液标本于37°C进行一次培养,制备结核分枝杆菌培养物； B.提取，从上述结核分枝杆菌培养物中提取总DNA； C.扩增，采用包括新型上、下游引物在内的反应体系进行PCR反应，扩增出258bpDNA基因片段； D.纯化，对上述PCR反应扩增出的258bpDNA基因片段产物，采用核酸外切酶和DNA片段纯化试剂进行提纯； E.消化，采用核糖核酸裂解酶对纯化后的258bpDNA基因片段产物进行裂解消化，成为长度不同的多个基因片段； F.分离，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离经消化后的多个基因片段； G.密集，将分离后的多个基因片段转移到醋酸纤维滤膜上，并加以提纯、浓缩、密集； H.显像，采用标记地高辛显色系统对密集后的醋酸纤维滤膜进行条带着色显像，得到基因片段图谱； I.鉴定，以正常型做对照，依据图谱中条带长度、数量、迁移位置及显像强度鉴别确定结核分枝杆菌rpoB突变基因。
2.根据权利要求I所述的一种检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的方法，其特征是在扩增步骤中， 所述反应体系为 IOXTaq Buffer 5 u 1,10mmol/L dNTP 4 y 1，20mmol/L 新型上、下游引物 Iu 1/pair, DNA 模板 2. 5ul,5u/ U I Taq DNA polymerase 0. 5ul,加灭菌双蒸水至总体积50ul ； 所述新型上游引物采用地高辛标记序列5’ DIG-GCGGCGGATCAAGGTCAAGA 3’，新型下游引物采用地高辛标记序列5’ DIG-CGAGTGGCACACAGACGCGGC 3 ； 所述PCR反应的条件，采用94°C预变性5min，然后按93°C 0. 5min变性，采用58°C 45s退火，72°C Imin延伸，经35个循环后，最后一次循环72°C延伸lOmin。
3.根据权利要求I所述的一种检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的方法，其特征是在消化步骤中，所述消化的条件采用从30°C以0. l°C/s的速度逐渐上升到80°C对基因片段进行梯度加热以充分消化。
全文摘要
本发明属于分子生物学检测领域，涉及结核分枝杆菌利福平耐药性检测方法，提出一种检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的方法，采用以下步骤培养—提取—扩增—纯化—消化—分离—密集—显像—鉴定，与现有的同类检测方法相比，由于采用一次培养，采用新型上、下游引物，由于采用纯化步骤，采用裂解消化，采用在显像前经过密集步骤，由于采用标记地高辛抗体显色系统，以及采用常规设备和易得药剂，所以本发明具有检测快速、检出率高、图谱识别性好、鉴定准确、成本低等显著优点，更确切有效地满足临床诊治的需求。
文档编号C12Q1/68GK102787168SQ20121029260
公开日2012年11月21日 申请日期2012年8月17日 优先权日2012年8月17日
发明者包东武, 满永宏, 罗小萌 申请人:南阳医学高等专科学校