专利名称：一个簇毛麦6vs染色体特异的分子标记6vs-ut及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和遗传育种科学技术领域，具体涉及一个特异追踪簇毛麦6VS染色体的分子标记及其用法。·
背景技术：
小麦是全球三大粮食作物之一，也是我国总产第一的粮食作物，是保障我国粮食安全的重要决定因素之一。小麦在其生育进程中常会受到生物或非生物胁迫的影响。小麦白粉病是一种世界性小麦病害，近年来随着我国农田水利设施改善和水肥条件提高，其危害逐年加重。通过远缘杂交和染色体工程技术手段育成的小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位系对目前已发现的白粉病生理小种均表现高抗或免疫，其抗白粉病基因Pm21位于簇毛麦6V染色体短臂上(6VS)，是目前对小麦白粉病抗谱最广、抗性最强的基因(见参考文献ChenPD, Qi LL, Zhou B，Zhang SZ, Liu DJ. Development and molecular cytogenetic analysisof wheat-Haynaldia villosa 6VS/6AL translocation lines specifying resistance topowdery mildew. Theor Appl Genet, 1995，91 (6-7) : 1125-1128)。近年来 T6AL. 6VS 易位系在小麦抗白粉病新品种选育中得到广泛利用，目前已育成20多个抗白粉病小麦新品种，推广面积超过5000万亩。T6AL. 6VS易位系是在普通小麦遗传背景中由簇毛麦6V染色体短臂(6VS)替换了普通小麦6A染色体的短臂(6AS)，从而形成T6AL. 6VS易位染色体。由于簇毛麦与普通小麦亲缘关系较远，导致二者不发生染色体重组，T6AL. 6VS易位染色体始终以易位的形式出现在后代中。目前，未发现利用T6AL.6VS易位系培育的新品种或新品系中出现染色体易位形式的改变。因此，簇毛麦6VS控制的性状及其载有的DNA序列均以协同传递的方式出现在后代中。目前，部分研究已公布了部分与6VS上抗白粉病基因Pm21连锁的相关分子标记OPTni彻、0PT1719QQ、SCAR1400, SCAR1265, NAU/XiBaol5902 和 NAU/XiBaol61586。但是，总体而言，这些标记在标记辅助选择育种中都存在不稳定的缺点，一个原因是由标记类型决定的，如RAPD标记0PT1714QQ和0PT1719QQ ;其次是由于标记序列过长(大多接近或超过1000bp)、PCR反应体系和反应条件要求苛刻，PCR结果可重复性差造成的。这些缺点均不利于标记辅助选择技术在小麦育种实践中的应用。EST (expressed sequence tag,表达序列标签)是指从植物不同组织来源的cDNA文库中随机挑选克隆，对其5’和3’端进行测序获得的短cDNA序列。EST-STS(sequence-tagged site, STS)标记是直接依据已经定位于基因组物理图上的EST序列设计引物，对基因组或者cDNA进行扩增，从中寻找与目的基因连锁或具有染色体特异性的EST标记。由于EST-STS标记直接来源于表达基因序列，保守性较高，特别有利于界定物种之间的差异。因此，基于比较基因组学原理，利用与小麦亲缘关系较近的短柄草的基因组序列信息，可以开发普通小麦亲缘物种簇毛麦特定染色体的特异性EST-STS分子标记。本发明就是基于上述思想指导下，利用比较基因组学原理，根据可电子定位于短柄草3号染色体短臂的小麦族作物EST序列设计以PCR技术为基础的EST-STS标记，筛选簇毛麦6V染色体短臂(6VS)特异性分子标记，用于快速检测和追踪普通小麦遗传背景中T6AL. 6VS易位染色体及其控制的抗白粉病性状，为小麦抗白粉病分子标记辅助选择育种提供新型、实用、高效的分子标记。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异追踪簇毛麦6VS染色体的分子标记及其用法，它利用比较基因组学原理，根据可电子定位于短柄草3号染色体短臂的小麦EST序列，设计以PCR技术为基础的EST-STS标记引物。由于聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率有限，所用亲本材料的PCR扩增产物虽然实际长度不同，但在电泳过程中却显示出相似的迁移率。对此，本发明对PCR产物进行克隆和测序，进而重新设计特异性引物，筛选簇毛麦6VS染色体特异性分子标记，为抗白粉病小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位系在小麦抗白粉病新品种培育中的应用提供一种新型、实用、高效的分子标记辅助选择技术。
为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案根据可电子定位于短柄草3号染色体短臂的小麦EST序列BE445603设计引物，从簇毛麦及普通小麦基因组中扩增对应的DNA片段，经克隆和测序后，针对DNA片段中长度差异较大的区域进一步设计标记引物，该标记引物扩增出的一段301bp的DNA条带位于簇毛麦6VS染色体，可以特异地追踪6VS染色体及其控制的抗小麦白粉病性状，标记引物序列为6VS-UTF :5，-GAAGACTGGTAGCGATGCAGTCA-3’(SEQ ID NO. 5)，6VS-UTR :5’ -AGAACAGATACACCTCCACTGACCA-3’(SEQ ID NO. 6)。本发明还公开了所述的簇毛麦6VS染色体特异的分子标记6VS-UT在追踪小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位染色体中的用途。用所述的簇毛麦6VS染色体特异的分子标记6VS-UT追踪小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位染色的方法，是用该分子标记引物对待测材料进行PCR扩增，扩增出301bp条带的材料，为含有小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位染色体的材料。本发明所述分子标记的具体用法为(I)PCR反应体系10ii L反应体系中含约10 20ng模板DNA，lXPCRbuffer，
I.5mmol L-1MgCl2^OOmmol rMNTP，两条引物终浓度各为 0. 2iimol L_1,0. 5UTaq DNA 聚合酶，用无菌蒸懼水补充反应体系至10 ii L ;(2) PCR反应程序94°C预变性3分钟；94°C变性20秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，32个循环；72°C延伸5分钟；4°C保存；(3)PCR产物检测PCR扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，用银染法染色。本发明在利用T6AL. 6VS易位系为亲本进行抗白粉病性状的追踪时，凡是扩增出301bp条带的材料，都含有小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位染色体，并对白粉病表现高抗；凡是不能扩增出301bp条带的材料，都不具有T6AL. 6VS易位染色体，相应丢失由6VS染色体控制的白粉病抗性。本发明具有以下有益效果I、本发明的分子标记6VS-UT在鉴定簇毛麦6VS染色体时特异性强已开发的分子标记0PT1714(i(i和0PT1719(KI都非6VS特异性标记，只有在亲本间存在与6VS的多态性时，才可以利用，而使用6VS-UT时，无论涉及何种亲本，只要出现301bp条带，就可以确定材料中含有6VS染色体。2、本发明的6VS染色体特异性EST-STS标记相较SCAR标记更易于识别PCR扩增失败导致的“假阴性”:本发明的标记为共显性标记，在普通小麦遗传背景中，无论是否具有T6AL. 6VS易位染色体，都可以扩增出两条背景条带，可用于判断PCR扩增是否成功，排除“假阴性”。3、本发明的分子标记稳定性好，容易为育种实践利用本发明的标记由于目标条带较短，仅301bp，PCR扩增时对DNA模板质量的要求不高，在部分降解的DNA模板中仍能有效扩增出目标产物，且目标产物呈现为强带，易于判断，有利于提高标记辅助选择的效率。
图I :序列比对结果。UT-HV :簇毛麦中的序列；UT_TA :普通小麦中的序列。箭头所示为重新设计的引物位置。图2 M DNA marker DL2000 ；1 :簇毛麦；2 :普通小麦；3 :小麦-簇毛麦易位系T6AL. 6VS ；R :分离群体中的抗病材料；S :分离群体中的感病材料。箭头所示为301bp的特异性条带。
具体实施例方式本发明具体实施方式
采用以下技术方案根据可电子定位于短柄草3号染色体短臂的小麦EST序列BE445603设计引物，从簇毛麦及普通小麦基因组中扩增对应的DNA片段，经克隆和测序后，针对DNA片段中长度差异较大的区域进一步设计标记引物，该标记引物扩增出的一段301bp的DNA条带，该条带位于簇毛麦6VS染色体，可以特异地追踪6VS染色体及其控制的抗小麦白粉病性状。实施例I、引物的设计选择短柄草3号染色体短臂上的保守基因，在NCBI或Graingenes数据库中进行BLAST分析,检索到小麦EST序列BE445603,用Primer Premier 5. 0软件设计引物，引物序列为UT-Pl :5’ -CCAAATGAAGCGTATTGTGCTTG-3’ (SEQ ID NO. I),UT-P2 :5’ -GTAGATGGTCTGATCAAATTCTTCTGGT-3’(SEQ ID NO. 2)。2、簇毛麦6VS染色体特异性EST-STS标记的筛选(I)PCR扩增以簇毛麦、普通小麦、小麦-簇毛麦易位系T6AL. 6VS为材料(均为公知公用种质材料，由南京农业大学细胞遗传研究所提供)，提取基因组DNA后进行PCR扩增，IOu L PCR反应体系中含约 10 20ng模板DNA，I XPCRbuffer，I. 5mmol L_lMgC12，200mmolL-ldNTP，两条引物终浓度各为0. 2iimolL-l，0. 5U Taq DNA聚合酶，用无菌蒸馏水补充反应体系至10 ii L ；PCR反应程序为94°C预变性3分钟；94°C变性20秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，32个循环；72°C延伸5分钟；4°C保存。(2) PCR产物的检测PCR扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(29:1)上进行电泳分离，采用银染法染色。(3)PCR产物的克隆与测序由于簇毛麦、普通小麦的PCR产物具有相似的迁移率，所以回收各自的PCR产物后，分别与pMD18-T (TAKARA公司)连接，经转化大肠杆菌感受态细胞后，筛选出阳性克隆进行测序。簇毛麦的PCR产物为917bp (SEQ ID NO. 3)，普通小麦的PCR产物为901bp (SEQ ID NO. 4)。对两条序列进行比对分析，进而重新设计一对引物(见图I):6VS-UTF :5， -CCAGGAGGGCCTCCAGGA-3’ (SEQ ID NO. 5),6VS-UTR :5’ -CTGGGAGCTCCTGCTGCGT-3’ (SEQ ID NO. 6)。(4)多态性标记的确定以重新设计的引物，按上述方法进行PCR及电泳检测，筛选到一个簇毛麦6VS染色体特异的分子标记6VS-UT，以该标记引物进行PCR扩增，能在普通小麦中扩增到两个背景条带，在簇毛麦中扩增到一条301bp的DNA条带，而在小麦-簇毛麦易位系T6AL. 6VS中，既能扩增到两个背景条带，也能扩增到一条301bp条带(见图2中f 3)，表明301bp条带可定位于簇毛麦6VS染色体，因此，分子标记6VS-UT能在小麦背景中特异性追踪簇毛麦6VS染色体。3、簇毛麦6VS染色体特异性标记6VS-UT在分子标记辅助选择育种中的应用利用筛选到的簇毛麦6VS染色体特异性标记引物6VS-UT，对宁麦9号(公知公用，由江苏省农业科学院培育)与抗白粉病T6AL. 6VS易位系(公知公用，由南京农业大学细胞遗传研究所创制并提供)杂交组合的分离群体进行鉴定，结合白粉病抗性鉴定，结果显示在所有供试材料中，凡具有301bp条带的材料,都表现高抗白粉病；凡缺失301bp条带的材料都表现高感白粉病(见图2中R或S)。该结果表明，本发明开发的EST-STS标记6VS-UT能有效追踪小麦背景中的簇毛麦6VS染色体，在分子标记辅助选择育种中具有潜在的应用价值。
权利要求
1.一个簇毛麦6VS染色体特异的分子标记6VS-UT，其特征在于该分子标记引物的具体序列为6VS-UTF :5’ -GAAGACTGGTAGCGATGCAGTCA-3’，6VS-UTR :5’ -AGAACAGATACACCTCCACTGACCA-3’。
2.权利要求I所述的簇毛麦6VS染色体特异的分子标记6VS-UT在追踪小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位染色体中的用途。
3.一种用权利要求I所述的簇毛麦6VS染色体特异的分子标记6VS-UT追踪小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位染色的方法，是用该分子标记引物对待测材料进行PCR扩增，扩增出301bp条带的材料，为含有小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位染色体的材料。
全文摘要
本发明公开了一个特异追踪簇毛麦6VS染色体的分子标记6VS-UT及其用法，它涉及分子生物学和遗传育种科学技术领域。本发明根据可电子定位于短柄草3号染色体短臂的小麦EST序列BE445603设计引物，从簇毛麦与普通小麦基因组中扩增并克隆对应的DNA，在测序的基础上进一步设计特异性分子标记引物，具体序列为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示，以标记引物进行PCR时能扩增出一条301bp的特异性DNA条带，能快速有效地追踪簇毛麦6VS染色体及其控制的抗小麦白粉病性状，在小麦抗白粉病分子标记辅助选择育种中具有较强的实用价值。
文档编号C12N15/11GK102851281SQ20121035369
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月20日 优先权日2012年9月20日
发明者何华纲, 朱姗颖, 别同德, 霍金金, 李晶晶 申请人:江苏大学