专利名称：异基因过继性细胞免疫治疗血液系统疾病的细胞类生物药物及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于异基因过继性细胞免疫治疗血液系统疾病的药物，尤其涉及一种过继性细胞免疫治疗MDS、或治疗白血病的生物类药物、及其制备方法。
背景技术：
目前认为多种血液系统疾病，包括红细胞疾病，如再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)等；白细胞疾病，如各种白血病、恶性淋巴瘤、恶性淋巴-网状细胞增生症、浆细胞病、组织细胞增生性疾病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性疾病(真性红细胞增多症、特发性血小板增多症、骨髓纤维化)等都是起源于造血干细胞或多能干细胞的克隆性 病。具有代表性的是骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic Syndromes，MDSXMDS是一种起源于造血髓系定向干细胞或多能干细胞的异质性克隆性病，特点为骨髓增生活跃，异常克隆细胞在骨髓中分化、成熟障碍，出现病态造血，在骨髓原位或释放入血后不久被破坏，导致造血效率低下，外周血细胞减少，细胞功能异常，表现为难治性一系或多系细胞减少的血液病。MDS是一种高度克隆性的恶性血液系统疾病。发病率约10 / 10万 12 / 10万人口，全球范围约有30万患者。任何年龄均可发病，男女之比为2 :1。MDS多累及中老年人，约80%患者大于60岁。MDS临床表现主要为贫血，几乎所有的MDS患者有贫血症状，如乏力、疲倦。约60%的MDS患者有中性粒细胞减少，由于同时存在中性粒细胞功能低下，使得MDS患者容易发生感染，约有20%的MDS死于感染。约20%的MDS患者有出血表现，常见于皮肤，呼吸道，消化道等，也有颅内出血者。部分患者可有肝，脾，淋巴结轻度肿大，少数患者可有胸骨压痛，肋骨或四肢关节痛。40% 60%的MDS患者有血小板减少，随着疾病进展可出现进行性血小板减少。根据血液学和骨髓形态学的特点，1982年FAB协作组将MDS分成5种类型I)难治性贫血(RA refractory anemia):临床以贫血为主，网织红细胞减少,夕卜周血中中性粒细胞和血小板大多也是减少的。外周血中原始细胞极少见(<1%)。骨髓增生活跃或明显活跃，红系增生多较明显，环形铁粒幼细胞〈15%，红细胞形态异常多见。粒系和巨核系细胞也有一定形态异常，但通常较轻。骨髓内原始细胞〈5%。2)难治性贫血伴环形铁粒细胞增多(RARS refractory anemia with ringsideroblasts):与RA的主要区别是出现环形铁粒幼细胞，占骨髓有核红细胞的15%以上。外周血白细胞和血小板计数多数正常，血清铁蛋白增高。3)难治性贫血伴原始细胞增多(RAEB refractory anemia with excess blasts)外周血中三系细胞大多数均有不同程度减少，少数病例只有两系细胞减少。外周血常有原始细胞出现，但〈5%。骨髓中原始细胞在5% 19%间。粒系和红系幼稚细胞数量增多，形态改变明显。
4)慢性粒单核细胞白血病(CMML chronic myelomonocytic leukemia):多见于年老者。肝、脾肿大多见。有贫血及血小板减少。最主要的特点是血液和骨髓中有较多的单核细胞。外周血中单核细胞的绝对数>1X109 / L，常伴有中性粒细胞增多及形态异常。外周血中原始细胞〈5%。骨髓增生明显活跃，粒红比率增高，原始细胞在5% 20%。5)难治性贫血伴原始细胞增多转变型(RAEB-T refractory anemia with excessblasts in transformation):血液及骨髓除具有RAEB的一些改变外,符合以下特点①外周血中原始细胞>;②骨髓中原始细胞> 20%，但〈30% ;③原始细胞中可见Auer小体；④约50%以上病人演变为急性白血病，患者生存时间短，多数不超过一年。WHO提出了新的MDS分型标准，认为骨髓原始细胞达20 %即为急性白血病，将RAEB-t归为急性髓系白血病(AML)，并将CMML归为MDS / MPD (骨髓增生异常综合征/骨髓增殖性疾病)，保留了 FAB的RA、RAS、RAEB ;并且将RA或RAS中伴有2系或3系增生异常 者单独列为难治性细胞减少伴多系增生异常(refractory cytopenia with multilineagedysplasia，RCMD)，将仅有5号染色体长臂缺失的RA独立为5q-综合征；还新增加了 MDS未能分类(u-MDS)。目前临床MDS分型中平行使用着FAB和WHO标准。RA和RAS患者多以贫血为主，临床进展缓慢，中位生存期3飞年，白血病转化率约5% 15%。RAEB和RAEB-t多以全血细胞减少为主，贫血、出血及感染易见，可伴有脾肿大，病情进展快，中位生存时间分别为12个月、5个月，白血病转化率高达CMML以贫血为主，可有感染和出血，脾肿大常见，中位生存期约20个月，约30%转变为AML。MDS通常起病缓慢，逐渐进展，少数患者起病急剧，从发病开始一年之内约有50%以上转化为白血病，MDS具有较高的死亡率，其死亡原因除白血病之外，多数由于感染，出血，尤其是颅内出血。原发性MDS的病因尚不明确，推测是由于生物、化学、或物理等因素引起基因突变，染色体异常使某个恶变的细胞克隆性增生，业已公认，诱变剂如病毒、某些药物(如化疗药)、辐射(放疗)，工业反应剂(如苯，聚乙烯)以及环境污染等的可致癌作用，诱变齐阿引起染色体的重排或基因重排，也可能只引起基因表达的改变导致MDS。继发性MDS患者常有明显发病诱因，苯类芳香烃化合物、化疗药物尤其是烷化剂、放射线均可诱导细胞基因突变而导致MDS或其他肿瘤发生。通过G6H)同工酶、限制性片段长度多态性分析等克隆分析技术研究发现，MDS是起源于造血干细胞的克隆性疾病。异常克隆细胞在骨髓中分化、成熟障碍，出现病态造血，在骨髓原位或释放入血后不久被破坏，导致无效造血。部分MDS患者可发现有原癌基因突变(如N-ras基因突变)或染色体异常(如+8、_7)，这些基因的异常可能也参与MDS的发生和发展。MDS终末细胞的功能，如中性粒细胞超氧阴离子水平、碱性磷酸酶也较正常低下。但上述基因改变多在MDS较晚期RAEB、RAEB-T型患者中发生，在MDS早期RA、RAS中较少，这说明用基因突变尚难解释全部MDS患者发病原因。过度增生的异常造血干细胞克隆常有两种演变途径一为由于过度增生逐渐演变为造血能力衰亡，骨髓可转为增生低下，临床表现为造血功能衰竭，为半数以上MDS患者死亡原因。另一种途径演变为急性白血病，MDS病程中约有三分之一的患者转化为白血病，多为 AML。治疗MDS的主要目的是减少因贫血、白细胞减少、血小板减少引起的并发症，提高患者的生活质量。MDS国际预后积分系统(IPSS)是依据患者血细胞减少的数量、骨髓中原始细胞比例及染色体核型评价预后，是指导治疗的一个基本工具低危O分；中危-I(Int-I) 0. 5 I分；中危-2 (Int-2) I. 5 2分；高危彡2. 5分。对于低危或者Int-I级患者治疗主要是改善生活质量，采用支持治疗、促造血、诱导分化和生物反应调节剂等治疗，而Int-2级和高危组MDS主要是提高存活，采用AML的联合化疗方案和造血干细胞移植等。(一)支持治疗对于继发性MDS有病因可寻者应尽可能停止接触可疑致病因素的物质或环境。根据病情选用成分输血。有感染者根据病原菌选择敏感抗生素及时控制感染。MDS伴巨幼贫血者可补充叶酸、维生素B12，RARS可给予维生素B6。(二)雄性激素，如司坦唑醇、11-庚酸睾丸酮等 司坦唑醇(康力龙)对核型正常的RA有效。达那唑对康力龙无效者可能有效,对血小板减少有效。治疗有效后血红蛋白、粒细胞及血小板数量增加。(三)肾上腺皮质激素对MDS合并自身免疫性疾病，如自身免疫性溶血性贫血、类风湿关节炎、大血管炎或纯红细胞再生障碍性贫血有效。用药3 4周后血象好转，对造血细胞形态异常无作用。(三)造血生长因子，如G-CSF、红细胞生成素(Epo)等适用于中、低危患者，以EPO应用最广泛、最安全，与G-CSF、GM-CSF联用可增加疗效，但是有促进细胞向白血病转化之虑。白细胞介素3 (IL-3)及TPO可酌情应用。它们刺激粒细胞和血小板生成，很少影响红细胞。(I) GM-CSF和G-CSF :可提高外周血中的粒细胞、单核细胞数，主要适用于白细胞减少并感染者，尤其是抗生素治疗无效或疑有真菌感染者。(2)EP0 :对无输血史，血清EPO < 100^200MU / ml的女性、核型正常，对输血依赖性低者疗效较好。EPO还能激活血小板活性，对血小板减少者有益。与维甲酸或G-CSF联用可加强EPO作用。(3)干扰素有直接抑制肿瘤细胞增殖作用，可抑制白血病克隆，目前临床很少应用。(五)诱导分化治疗可使用全反式维A酸和1，1，25 (OH)2Vit D3，少部分患者血象改善。造血生长因子(如G-CSF联合Epo)也有诱导分化剂作用。(I)维甲酸维甲酸显示有抑制恶性克隆生长或促使白血病细胞分化作用。ATRA+EP0是治疗低、中危MDS的一种有效的、能耐受的治疗方案。(2) I，25 (OH)2Vit D3:罗盖全2iig / d，至少用12周，与维甲酸合用可能效果更好。可抑制细胞增殖、促进分化和调节免疫功能，并有抗骨髓纤维化作用。(3)砷剂(AT0):三氧化二砷能抑制肿瘤细胞增殖，阻止肿瘤血管生成新生，诱导细胞分化成熟、凋亡，提高机体免疫功能等机制发挥抗肿瘤作用。对白血病细胞有抑制生长与促凋亡作用，小剂量砷剂有诱导分化作用，对部分患者有效。三氧化二砷治疗MDS有效，且较安全，不良反应少，成为治疗该病的一种新手段，总的有效率50%。(六)化学治疗化学治疗是清除MDS恶性克隆，恢复正常造血，治疗高危MDS的主要方法。
(I)强烈化疗含蒽环类的方案，I (IDA)A方案优于F (氟达拉滨)A和T (拓扑替康)A方案。而中剂量Ara-C联合IDA和拓扑替康对难治性/复发性AML和高危MDS有明显疗效，可作为挽救治疗措施。含有米托蒽醌的方案不适宜老年的MDS患者。在化疗方案中加入G-CSF则能够提高缓解率、改善患者的临床情况、增加能接受AIIo-SCT的病例数。(2)小剂量化疗对于老年MDS患者，由于强烈化疗的毒副作用明显，不适宜强化疗，则可选用小剂量化疗以延长生存期，改善生存质量。a)小剂量阿糖胞苷与G-CSF联合应用可提高疗效，对于高危MDS，则可提高细胞数，减少输血。剂量为5 25mg / d皮下注射10 20天为一疗程，停药2周后再重复此疗程，副作用为骨髓抑制 。b)小剂量马法兰可试用于治疗老年、高危MDS患者，其中骨髓增生减低性MDS对小剂量马法兰的反应更好。常用剂量为2mg / d，口服，总量90 140mg。无明显副作用。c)CAG 方案=Ara-C IOmg / m2，ql2hX 14 天，阿克拉霉素 14mg / m2，X4 天，G-CSF300 u g / d，X 14天，可试用于RAEB患者，取得了可喜的疗效。d)小剂量(高)三尖杉酯碱小剂量高三尖杉酯碱具有诱导分化和细胞毒双重作用。对老年体弱、有心、肝、肾损害的RAEB和RAEB-T患者，酌情应用。(七)抗凋亡治疗由于细胞凋亡异常在MDS发病中起着一定作用，故抗凋亡治疗取得了一定的疗效。(I)氨磷汀(阿米福汀，Amifostine)为磷酸化有机醇广谱细胞保护剂，其体内代谢产物有抗氧化保护正常干/祖细胞不被化疗药物杀伤的作用。能够减少细胞凋亡和刺激骨髓造血祖细胞的生长。若加用EPO和G-CSF则可改善造血，且无明显毒副作用。(2)己酮可可碱(Pentoxifiline)为黄嘌呤衍生物，可干扰TNF-a ,TNF-0与IL-1等因子，减少其在MDS发病中的促凋亡作用。(A)抗血管生成药物沙利度胺(反应停，thalidomide)具有抑制TNF- a的产生和抗血管生成作用，能够有效改善某些MDS患者的细胞减少。用法150 200mg / d。对改善贫血，减少输血依赖性有一定疗效，骨髓中原始细胞数较少者疗效好。副作用主要有乏力、嗜睡、便秘、水肿、肌肉痛、皮疹等。近来雷利度胺(来那度胺Lenalidomide)是一种具备抗血管增生和抗肿瘤活性的新一代免疫调节剂，临床试验证实该药对伴5q_染色体异常的输血依赖性低危和中危-I骨髓增生异常综合征和多发性骨髓瘤疗效肯定。(九)免疫抑制剂需进行治疗的低危或中危患者,如果不适合进行化疗或干细胞移植(SCT),应接受I个疗程抗胸腺细胞球蛋白(ATG)或环孢菌素A治疗。ATG和Csk :通过抑制Ts细胞来调节MDS的免疫反应，促进MDS造血细胞生长，二者无交叉耐药。Csk同时有免疫抑制、抗凋亡双重作用，并可逆转耐药，对⑶4 /⑶8比值倒置，TCR-a或-0基因重排的患者疗效较好。(十)去甲基化药物达珂(地西他滨DACOGEN) :Dacogen适用于IPSS评分系统中中危_2和高危的初治，复治骨髓增生异常综合征(MDS)患者，包括原发性和继发性的MDS，按照FAB分型所有的亚型。地西他滨是一个去甲基化药物，属于胞嘧啶核苷酸类似物，其作用机制独特。它能逆转异常DNA甲基化，掺入DNA序列捕获DNA转移酶，消耗细胞内DNA甲基转移酶，它具有比阿糖胞苷和氮杂包苷更高的体内细胞毒性，它比氮杂包苷具有更强烈的诱导细胞分化能力和抑制甲基化的能力，因而，在肿瘤性疾病的治疗中具有不可替代的优势和效率。地西他滨的使用方案为20mg / m2，每天一次，I小时静脉注射，连续5天，每4周一个疗程。地西他滨治疗总体安全性较高，严重(3 4级)的不良反应发生率低(< 5% )，主要副作用(不良反应)是中性粒细胞减少，血小板减少，贫血等骨髓抑制表现，但与强化化疗相比，其治疗相关死亡率明显降低(P=O. 001)。其他毒副作用发生率相对较低，通过对症处理或减量或延迟用药可缓解。达珂禁用于已知对地西他滨过敏的患者。(-| )异基因造血干细胞移植异基因干细胞移植是目前将MDS治愈的唯一希望。AIIo-SCT的适应证是年龄<55岁，有HLA相合供体的高危和中危患者，对低危患者应严格掌握治疗指征。而非清髓性干细胞移植适用于年龄较大或内脏功能不全的患者。
由于MDS多为老年患者，移植相关死亡率偏高，低危患者既往较少移植。近来随着降低强度的非清髓性造血干细胞移植技术日益成熟，移植能用于更多低危MDS患者。IPSS-Int-2和高危者，尤其是年轻、原始细胞增多和伴有预后不良染色体核型者首先应考虑是否移植。目前对对于MDS缺乏良好的治疗药物，各种治疗方法有效率(改善率)大约在30%左右，效果均不十分理想，病人生活质量差。异基因造血干细胞移植是目前唯一能治愈MDS的疗法，但有诸多限制条件，同时由于MDS多为老年患者，移植相关死亡率偏高。支持治疗仍是目前的标准方案。
发明内容
针对目前对于多种血液系统疾病，包括红细胞疾病，如再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)等；白细胞疾病，如各种白血病、恶性淋巴瘤、恶性淋巴-网状细胞增生症、浆细胞病、组织细胞增生性疾病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性疾病(真性红细胞增多症、特发性血小板增多症、骨髓纤维化)等大多数都没有良好的治疗药物和方法的问题，本发明提供了一种用于一种制备用于异基因过继性细胞免疫治疗血液系统疾病，例如MDS或白血病药物的药物、以及所述药物的制备方法。本发明的第一个目的是提供一种制备用于异基因过继性细胞免疫治疗血液系统疾病药物的方法，步骤包括步骤1，将免疫细胞与抗原在液态细胞培养基中置于培养容器中共同培养，从而获得具有抗相应抗原的特异性免疫细胞培养物；步骤2，从步骤I中获得的培养物中分离具有免疫应答反应的细胞类生物药物；其中，所述的液态细胞培养基中，除免疫细胞外，还包括组分a) ^e)a)细胞有丝分裂原如刀豆素、植物血凝素、美洲商陆、脂多糖、葡聚糖、抗CD3抗体中的任意一种或几种。b)抗原所述抗原为造血干细胞异常克隆细胞,可以是源于同种异体、异种、自身的抗原。c)超抗原可以是外源性超抗原和内源性超抗原中的任意一种或两种的组合，夕卜源性超抗原如细菌内毒素，内源性超抗原如逆转录病毒、热休克蛋白中的任意一种或几种。d)细胞因子如来源于淋巴细胞、单核细胞和其他细胞产生的淋巴因子、单核因子、激活炎症的细胞因子和刺激造血的细胞因子中的任意一种或几种。e)免疫佐剂如无机佐剂、有机佐剂、合成佐剂和油剂中的任意一种或几种。其中，所述培养液可以是基础培养液加血清或无血清培养液。本发明所述的方法中，所述免疫细胞可以是异体细胞或自体细胞，本发明中优选为异体细胞。 本发明所述的方法中，所述免疫细胞可以是野生型免疫细胞，也可以是基因改性细胞，并优选为基因改性细胞。本发明所述的方法中，所述具有免疫应答反应的细胞，如肿瘤浸润淋巴细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞、自然杀伤细胞、肿瘤相关巨噬细胞、激活的杀伤性单核细胞、细胞毒T淋巴细胞和/或树突状细胞。并优选为淋巴细胞，如T细胞、B细胞、NK细胞等，最优选为T细胞。其中，所述免疫细胞与特定抗原的细胞数量比例优选为5 100 :1。其中，所述免疫细胞与特定抗原共同培养时间优选为3 180天。根据本发明所述方法的一种优选实施方式，其中，步骤I中还可以加入抗原递呈细胞。其中，所述细胞培养容器优选为三维大体积高密度细胞培养容器，但也可以是其它任意已知的培养容器，包括生物反应器。根据本发明所述方法的一种优选实施方式，其中，还包括细胞克隆步骤以步骤I中得到的培养物，或者步骤2中得到的具有免疫应答反应的细胞为原料，在所述培养基中进行克隆，得到具有免疫应答反应的细胞株。所述克隆可以是1)间歇循环刺激法；2)连续刺激法。本发明的第二个目的是提供一种上述任意方法制备的用于过继性细胞免疫治疗血液系统疾病的细胞类生物药物，所述药物由上述第一个目的中所述方法制备。所述血液系统疾病包括1)红细胞疾病，如再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)等；2)白细胞疾病，如各种白血病、恶性淋巴瘤、恶性淋巴-网状细胞增生症、浆细胞病、组织细胞增生性疾病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性疾病(真性红细胞增多症、特发性血小板增多症、骨髓纤维化)等。本发明所述的药物，可以制成任意可用的剂型、和/或通过任意可用途径输入患者或需求者体内。本发明第三个目的是提供一种用于异基因过继性细胞免疫治疗血液系统疾病的生物制剂，包括容器，以及置于所述容器中的、本发明第二个目中的所述的药物。其中，所述生物制剂还可以包括生理盐水、白蛋白、以及其他稳定剂中的任意一种。本发明上述内容中，所述“药物”也包括用于预防MDS和白血病的疫苗。本发明所述方法制备的含T淋巴细胞的药物中，T淋巴细胞可以是来自异体的细胞，使用时不会出现异体排异反应，安全性高；并且通过实验验证。例如使用本发明所提供的药物治疗MDS，血色素、白细胞、红细胞等指标明显上升，伴随临床症状体征的明显改善，体力恢复正常；治疗后的骨髓穿刺、骨髓活检和骨髓干细胞培养均有造血功能明显改善。治疗过程中病人耐受良好。
图I为患者使用本发明药物治疗前(2011年3月7日)的骨髓活检照片；图2为患者开始使用本发明药物治疗后(2011年9月27日)骨髓活检照片；图3为患者使用本发明药物治疗后(2012年4月2日)骨髓活检照片。
具体实施例方式本发明提供了一种用于治疗MDS的药物及其制备方法，制备步骤包括 步骤1，将免疫细胞与抗原在液态细胞培养基中置于培养容器中共同培养，从而获得具有抗相应抗原的特异性免疫细胞培养物；步骤2，从步骤I中获得的培养物中分离具有免疫应答反应的细胞类生物药物；其中，所述的液态细胞培养基中，除免疫细胞外，还包括组分a)、)a)细胞有丝分裂原如刀豆素、植物血凝素、美洲商陆、脂多糖、葡聚糖、抗CD3抗体中的任意一种或几种。b)抗原所述抗原为造血干细胞异常克隆细胞,可以是源于同种异体、异种、自身的抗原。c)外源性超抗原、和/或内源性超抗原如细菌内毒素，内源性超抗原如逆转录病毒、热休克蛋白中的任意一种或几种；可以是外源性超抗原和内源性超抗原中的任意一种或两种的组合。d)细胞因子如来源于淋巴细胞、单核细胞和其他细胞产生的淋巴因子、单核因子、激活炎症的细胞因子和刺激造血的细胞因子中的任意一种或几种。e)免疫佐剂如无机佐剂、有机佐剂、合成佐剂和油剂中的任意一种或几种。其中，所述培养液可以是基础培养液加血清或无血清培养液。其中，所述免疫细胞可以是异体细胞或自体细胞，本发明中优选为异体细胞。其中，所述免疫细胞可以是野生型免疫细胞，也可以是基因改性细胞，并优选为基因改性细胞。其中，所述具有免疫应答反应的细胞，如肿瘤浸润淋巴细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞、自然杀伤细胞、肿瘤相关巨噬细胞、激活的杀伤性单核细胞、细胞毒T淋巴细胞和/或树突状细胞。并优选为淋巴细胞，如T细胞、B细胞、NK细胞等，最优选为T细胞。其中，所述免疫细胞与特定抗原的重量比例优选为5 100 :1。其中，所述免疫细胞与特定抗原共同培养时间优选为3 180天。其中，步骤I中还可以加入抗原递呈细胞。其中，所述细胞培养容器优选为三维大体积高密度细胞培养容器，但也可以是其它任意已知的培养容器，包括生物反应器。其中，还可以包括细胞克隆步骤以步骤I中得到的培养物，或者步骤2中得到的具有免疫应答反应的细胞为原料，在所述培养基中进行克隆，得到具有免疫应答反应的细胞株。所述克隆可以是1)间歇循环刺激法；2)连续刺激法。本发明所述的药物，可以制成任意可用的剂型、和/或通过任意可用途径输入患者或需求者体内。本发明还提供一种生物制剂，包括容器，以及置于所述容器中的、本发明第二个目中的所述的药物。其中，所述生物制剂还可以包括生理盐水、白蛋白、以及其他稳定剂等组分。实施例I源于异体的单个核细胞，与特定抗原(造血干细胞异常克隆细胞)在液态培养基中共同培养，所述培养基还包括刀豆素、外源性超抗原、淋巴因子、免疫佐剂，其中，刀豆素在培养基中用量为lug / L ;外源性超抗原(绿脓杆菌毒素)在培养基中用量为5 yg / L； 淋巴因子(白细胞介素II)在培养基中用量为IOOOu / L ;免疫佐剂(5%吐温-80)用量为0. ImL / L0T淋巴细胞与特定抗原(Raji (Burkitt ^ s淋巴瘤细胞))的比例为5 :1 (细胞数
量比)。将T淋巴细胞与特定抗原共同培养30天，获得具有抗相应抗原的特异性免疫细胞培养物。从培养物中分离出具有免疫应答反应的细胞，主要为细胞毒T淋巴细胞。实施例2源于异体的单个核细胞(基因改性T淋巴细胞)，与特定抗原(造血干细胞异常克隆细胞)在液态培养基中共同培养，所述培养基还包括植物血凝素、内源性超抗原、淋巴因子、免疫佐剂，其中，植物血凝素(PHA)在培养基中用量为5 ii g / L ;内源性超抗原(绿脓杆菌毒素)在培养基中用量为lug / L ;淋巴因子(干扰素)在培养基中用量为IOOOu / L ;免疫佐剂(5%吐温-80)用量为0. ImL / L0T淋巴细胞与特定抗原(M0LT-4 (急性淋巴母细胞白血病细胞))比例为50 1 (细胞数量比)。将T淋巴细胞与特定抗原共同培养90天，获得具有抗相应抗原的特异性免疫细胞培养物。从培养物中分离出具有免疫应答反应的细胞，主要为细胞毒T淋巴细胞。实施例3源于异体的单个核细胞(基因改性T淋巴细胞)，与特定抗原(造血干细胞异常克隆细胞)在液态培养基中共同培养，所述培养基包括植物血凝素、外源性超抗原、淋巴因子、免疫佐剂。其中，植物血凝素在培养基中用量为IOyg / L ;外源性超抗原(绿脓杆菌毒素)在培养基中用量为5iig / L ;淋巴因子(白细胞介素II)在培养基中用量为500u / L;免疫佐剂(5%吐温-80)用量为0. ImL / L0T淋巴细胞与特定抗原(K-562 (慢性髓原白血病细胞))的比例为100 1 (细胞数
量比)。将T淋巴细胞与特定抗原共同培养10天，获得具有抗相应抗原的特异性免疫细胞培养物。从培养物中分离出具有免疫应答反应的细胞，主要为细胞毒T淋巴细胞。
实施例4源于异体的单个T淋巴细胞，与特定抗原(造血干细胞异常克隆细胞)在液态培养基中共同培养，所述培养基包括刀豆素、外源性超抗原、淋巴因子、免疫佐剂，其中，植物血凝素(PHA)在培养基中用量为IOy g / L ;外源性超抗原(绿脓杆菌毒素)在培养基中用量为lug / L ;淋巴因子(白细胞介素II)在培养基中用量为800u / L ;免疫佐剂(5%吐温-80)用量为0. ImL / L0T淋巴细胞与Dami (巨核细胞白血病细胞)的比例为10 :1 (细胞数量比)。将抗原与T淋巴细胞(单个核细胞)在37°C、5%C02条件下培养I天。重悬，经离心收集界面细胞，调整细胞浓度，加入经过照射的自身MNC，以未照射的自身细胞为饲养细胞和抗原提呈细胞，培养7天，重复该步骤。收集细胞，有限稀释后，在上述条件下继续培养，传代并经间歇刺激培养。
从上述培养物中分离出具有免疫应答反应的细胞株。实施例5源于异体的单个T淋巴细胞，与特定抗原(造血干细胞异常克隆细胞)在液态培养基中共同培养，所述培养基为无血清培养基，加入包括刀豆素、外源性超抗原、淋巴因子、有机溶剂，其中，植物血凝素(PHA)在培养基中用量为IOiig / L ;外源性超抗原(绿脓杆菌毒素)在培养基中用量为Iu g / L ;淋巴因子(白细胞介素II)在培养基中用量为800u / L0T淋巴细胞与HEL299 (红白细胞白血病细胞)的比例为10 :1 (细胞数量比)。将抗原与T淋巴细胞(单个核细胞)在37°C、5% CO2条件下培养I天。将所培养细胞加入大体积细胞培养生物反应器，进行高密度细胞培养30天。从培养物中分离出具有免疫应答反应的细胞，主要为细胞毒T淋巴细胞。效果实施例姓名林XX 性别男性年龄18岁临床诊断MDS因皮肤苍白，乏力头晕，劳累后心悸气短半年于2010-12-30入院。检查发现三系减少，白细胞2. 34X109 / L、红细胞2. 14X 109/L、血色素81g / L、血小板86X 109 / L。胸骨穿刺显示三系增生伴轻度病态造血骨髓象。病情进展较快，第一次诊断后的五个月即需输血，其后靠输血维持，五个多月期间共输血4300mL。第一次入院至第二次入院(2011年I月4日至2011年3月7日，天津血研所)临床表现皮肤苍白，头晕乏力加重，活动后心悸气短血象检查结果白细胞，2. 34-5. 25X IO9 / L，红细胞I. 9-2. 42X IO9 / L，血红蛋白 78.2-96g / L，血小板 77-107 X IO9 / L。骨髓象检查诊断意见结合病史，粒红两系增生减低骨髓象。2011年3月7日骨髓活检(送检组织I. OcmXO. 2cmX0.2cm)照片见图1，骨髓增生极度低下，造血细胞缺乏，未见巨核细胞。网状纤维染色阴性。第二次入院确诊到异基因过继性细胞免疫治疗前(2011-03-08到2011_07_12，包
括第三次住院)临床表现为皮肤苍白，头晕乏力明显加重,活动后心悸气短,需要输血1200mL。患者的血常规白细胞，2. 60-4. 66X IO9 / L、红细胞I. 3-2. 83X IO9 / L、血红蛋白48. 2-92g / L、血小板 83-119X 109 / L。
骨髓象检查诊断意见此部位骨髓粒巨两系增生，红系比例减低，粒红两系形态异
堂
巾O开始细胞免疫治疗至第四次入院(2011年7月13日到2011年9月28日，天津血研所)临床表现病情尚无明显好转。输血2000ml。7月15日至9月21日进行14次细胞免疫治疗，大约每:T4天一次。血象检查结果白细胞，2.4-4. 23X IO9 / L，红细胞I. 33-2. 55X IO9 / L，血红蛋白 48-76g / L，血小板 51-115 X IO9 / L。 骨髓象检查诊断意见诊断意见粒红巨三系增生减低骨髓象。2011年9月27日骨髓活检照片见图2，骨髓增生极度低下(< 10%)，极少数偏成熟阶段粒红系细胞。未见巨核细胞。未见原始细胞增多。第四次入院至第五次入院(2011年9月29到2011年12月22日，天津血研所)输血临床表现病情开始稳定，输血需求量减少(1100ml，最后一次为2011-11-25)细胞治疗11-29到12-7，五次治疗，每2-3天一次血象检查结果白细胞，3.0-5. 55X IO9 / L、红细胞2. 04-2. 97X IO9 / L、血红蛋白 61-93g / L、血小板 40-100X 109 / L。骨髓象检查诊断意见粒红巨三系增生减低骨髓象。骨髓活检显示，骨髓增生极度低下，脂肪细胞增生，粒红细胞和巨核细胞缺乏，网状纤维染色阴性。第五次入院至第六次入院(2011年12月23日到2012年4月2日，天津血研所)临床表现病情开始好转，症状体征减轻，不需要再输血。细胞治疗2012年2月9日到2012年2月17日，四次治疗，每2-3天一次。血象检查结果白细胞，3. 03-7. 16X IO9 / L、红细胞2. 28-3. 39X IO9 / L、血红蛋白 87-123g / L、血小板 43-78 X IO9 / L。骨髓象检查诊断意见结合病史，与2011年12月22日骨髓相比，三系增生程度增力口，原始细胞易见伴成熟红细胞明显异型性。2012年4月2日骨髓活检显示，骨髓增生较活跃(80%)，粒红比例减小，粒红系各阶段细胞可见，均已中幼及以下阶段细胞为主，粒系幼稚阶段细胞轻度增多，巨核细胞易见，分叶核为主，可见单圆核巨核细胞和多圆核巨核细胞，网状纤维染色( + )，照片见图3。第六次入院至今(2012年4月21日到2012年8月26日)临床表现病情进一步明显好转，症状体征明显减轻，体力逐步恢复正常细胞治疗2012年5月12日到2012年5月18日，四次治疗，每2天一次。2012年6月15日到2012年6月22日，五次治疗，每1-2天一次。血象检查结果白细胞，4. 18-7. 46X IO9 / L、红细胞2. 61-4. 45X IO9 / L、血红蛋白 99-162g / L、血小板 47-69 X IO9 / L。患者从发病后的第七个月开始进行异基因过继性细胞免疫治疗。一年来共治疗30次，采用细胞为上述实施例中制备的细胞毒T淋巴细胞(CD8+T细胞，约95%)。每次细胞数量为1X109，静脉滴注。从第二次入院确诊到异基因过继性细胞免疫治疗前(2011-03-08到 2011-07-12)，患者的血常规白细胞 2. 60-4. 66X 109/L、红细胞 I. 3-2. 83X109 / L、血红蛋白48. 2-92g / L、血小板83-119X109 / L。治疗两个多月后，输血次数及数量减少，四个月后不用再输血维持。治疗近一年时(2012-04-21到2012-09-08)，血常规白细胞 4. 18-7. 46X109 / L、红细胞 2. 61-4. 45X 109 / L、血红蛋白 99_162g / L、血小板，47-69X109 / L0其中血色素逐步从最低4. 8g / L上升到16. 2g / L，升高了极其显著的11. 4g / L，伴随临床症状体征的明显改善，体力恢复正常。治疗后的骨髓穿刺、骨髓活检和骨髓干细胞培养均有造血功能明显改善。治疗过程中病人耐受很好，除治疗当天有不需特殊处理的短暂畏寒、寒战和发热夕卜，没有任何其他毒副作用。未观察到腹泻，皮疹，肝功能损害等移植物抗宿主反应的表现。 表I，治疗前后血象变化
权利要求
1.一种制备用于异基因过继性细胞免疫治疗血液系统疾病药物的方法，其特征在于，步骤包括 步骤1，将免疫细胞与抗原在液态细胞培养基中置于培养容器中共同培养，从而获得具有抗相应抗原的特异性免疫细胞培养物； 步骤2，从步骤I中获得的培养物中分离具有免疫应答反应的细胞类生物药物； 其中，所述的液态细胞培养基中，除免疫细胞外，还包括组分a) ^e) a)细胞有丝分裂原； b)抗原所述抗原为造血干细胞异常克隆细胞； c)超抗原； d)细胞因子； e)免疫佐剂。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，细胞有丝分裂原选自刀豆素、植物血凝素、美洲商陆、脂多糖、葡聚糖、抗CD3抗体中的任意一种或几种。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述超抗原选自外源性超抗原和内源性超抗原中的任意一种或其组合；外源性超抗原为细菌内毒素，内源性超抗原选自逆转录病毒、热休克蛋白中的任意一种或几种。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，细胞因子选自来源于淋巴细胞、单核细胞和其他细胞产生的淋巴因子、单核因子、激活炎症的细胞因子和刺激造血的细胞因子中的任意一种或几种。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述培养液选自基础培养液加血清、或无血清培养液中的任意一种。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞选自异体细胞或自体细胞的任意一种。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞选自不经基因改性的免疫细胞或基因改性的免疫细胞的任意一种。
8.根据权利要求1、6或7所述的方法，其特征在于，所述具有免疫应答反应的细胞选自肿瘤浸润淋巴细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞、自然杀伤细胞、肿瘤相关巨噬细胞、激活的杀伤性单核细胞、细胞毒T淋巴细胞和/或树突状细胞。
9.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤I中还加入抗原递呈细胞。
10.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述细胞培养容器为三维大体积高密度细胞培养容器。
11.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，还包括细胞克隆步骤以步骤I中得到的培养物，或者步骤2中得到的具有免疫应答反应的细胞为原料，在所述培养基中进行克隆，得到具有免疫应答反应的细胞株。
12.—种如权利要求I所述方法制备的用于过继性细胞免疫治疗血液系统疾病的细胞类生物药物，其特征在于，所述血液系统疾病包括红细胞疾病，白细胞疾病。
13.根据权利要求I所述的生物药物，其特征在于，所述红细胞疾病包括再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症；所述白血病疾病包括白血病、恶性淋巴瘤、恶性淋巴-网状细胞增生症、浆细胞病、组织细胞增生性疾病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性疾病。
14.一种用于异基因过继性细胞免疫治疗血液系统疾病的生物制剂，其特征在于，包括容器，以及置于容器内的、权利要求12所述的用于过继性细胞免疫治疗MDS的细胞类生物药物。
全文摘要
本发明提供了一种制备用于异基因过继性细胞免疫治疗血液系统疾病，例如MDS或白血病的细胞类生物药物、生物制剂、以及制备方法。将免疫细胞与抗原在液态细胞培养基中置于培养容器中共同培养，从而获得具有抗相应抗原的特异性免疫细胞培养物；从获得的培养物中分离具有免疫应答反应的细胞类生物药物。免疫细胞可以是异体细胞，使用时不会出现异体排异反应，安全性高；治疗MDS后的骨髓穿刺、骨髓活检和骨髓干细胞培养均有造血功能明显改善。治疗过程中病人耐受良好。本发明通过提高机体的免疫力这一全新的病因治疗策略来治疗MDS，有效地恢复了患者体内造血功能，对于包括白血病在内的其他造血干细胞恶性克隆性疾病的治疗具有良好前景。
文档编号C12N5/0783GK102847143SQ20121035297
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月20日 优先权日2012年9月20日
发明者刘华 申请人:上海星华生物医药科技有限公司