专利名称：携带fl基因重组质粒的纳米阳离子脂质体、制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种可高效携带FL基因重组质粒的新型纳米阳离子脂质体、制备方法及应用。
背景技术：
结肠癌是极为常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率逐年上升，严重威胁着人类的健康。手术治疗作为传统的治疗手段之一，虽可以切除肿瘤病灶，但无法彻底清除体内所有的癌细胞，而残存的癌细胞则可以引起肿瘤的复发与转移。放疗、化疗作为手术治疗有力的辅助治疗手段，对清除残留癌细胞、防止肿瘤的复发与转移大有裨益，但因其本身存在的严重的毒副作用及癌细胞对其可能存在的不敏感性或抗药性，使其临床应用受到了很大的限制。 近年来，随着分子生物学的迅猛发展，肿瘤的基因治疗给人类克服肿瘤的威胁带来了希望，众多学者对结肠癌的基因治疗进行了大量研究，但至今，在基因治疗方面尚受诸多因素影响，效果并不理想。目前，以逆转录病毒和腺病毒等作为基因载体尽管转染效率很高，但制备复杂、具有免疫原性，存在严重安全隐患且不能在体内反复应用等弊端，并不能成为一种满意的基因载体。而非病毒载体采用人工合成的非生物活性材料携带、运输核酸物质进入细胞内，目前最常用的非病毒基因载体是阳离子脂质体等。阳离子脂质体虽具有低毒、低免疫反应、可修饰性强等优点，但转染效率仍较低，靶向分布不理想，稳定性较差。因此，如何制备安全、无毒副作用的基因载体，如何高效、靶向将目的基因运送到机体的靶部位发挥效应，从而起到分子水平治疗的效果，仍是基因治疗中一个亟待解决的难题。FL是一种膜蛋白，可调节造血干P祖细胞的增殖与分化，并可与多种细胞因子协同，提高造血功能。FL可促进树突状细胞(DC)、自然杀伤细胞(NK)、细胞毒T淋巴细胞(CTL)的增殖、分化与成熟，发挥其生物学效应，从而表现出抗肿瘤免疫作用，可显著抑制肿瘤的生长和转移。纳米粒(Nanoparticles, NP)是近年发展起来的一类非病毒类载体。纳米粒是粒径10-500nm之间的固状胶态粒子，它可增强基因耐核酸酶的能力，同时起到控释作用，延长其在体内的有效作用时间，纳米粒子还具有无毒，无免疫原性和可生物降解等优点，因其良好的组织穿透能力，极易被细胞吸收，因此作为基因治疗的载体有着独特的优越性。纳米阳离子脂质体粒为一种人工合成的载体材料，可运载质粒DNA、蛋白质、缩氨酸及低分子量的化合物，可在体内生物降解，其人体内的安全性、细胞毒性等研究已得到了普遍的认可。阳离子脂质体纳米粒包裹或吸附的治疗基因一般在24h内经历首次突发释放，其后进入缓慢释放的阶段长达一月之久，并保持所负载质粒的结构和功能的完整性，使质粒持久的释放和表达。阳离子脂质体纳米粒有较大的比表面积，可在其表面连接靶向分子或促进细胞转运的因子，从而实现基因治疗的主动靶向性，因其独特的优越性而备受重视。因此，纳米阳离子脂质体同时具有缓释作用和基因介导的双重功能，是一种有着良好发展前景的一类非病毒类载体。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一是提供一种能够携带FL基因重组体的纳米阳离子脂质体，可以在肿瘤细胞中释放出FL基因重组体并表达FL，从而发挥抗肿瘤的效应，具有高效低毒等优点；目的之二在于提供所述可携带FL基因重组体的纳米阳离子脂质体的制备方法，操作简便易行；目的之三在于提供所述能够携带FL基因重组体的纳米阳离子脂质体在抑制肿瘤生长方面的应用。携带FL基因重组体的纳米阳离子脂质体，其特征是，依据静电吸附原理，由Lipofectamine2000和携带FL基因的重组质粒pEGFP-cl-FL构成；所述携带FL基因的重组质粒pEGFP-cI-FL为将FL基因克隆至含有绿色荧光蛋白报告基因的pEGFP-c I载体中制·得。所述二者的最优比为8:1 (8 μ 1/1 μ g),其中Lipofectamine 2000以体积计,携带FL基因的重组质粒pEGFP-cl-FL以质量计。为达到上述目的，本发明的可高效在体内外转染基因的新型纳米级阳离子脂质体是通过以下方法制备的，该方法包括以下步骤(I)基因的合成化学合成FL基因序列(SEQ-I )，全长510bp，共编码169个氨基酸残基，将合成的基因进行序列测定。(2)重组质粒puc57-FL的制备将FL基因克隆至puc57载体的Sal I和BamH I之间，并将克隆有FL基因的重组质粒pUC57-FL进行酶切验证及序列测定。(3)重组质粒puc57-FL亚克隆至含有绿色荧光蛋白报告基因的pEGFP_cl载体构建重组质粒pEGFP-cl-FL :以Sal I和BamH I分别对重组质粒puc57_FL及pEGFP-cl载体进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳分别回收酶切产物；将puc57-FL (带有FL的片段)的酶切产物连接到pEGFP-cl载体酶切产物中，然后转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒，经Sal I和BamH I双酶切鉴定正确后，并对阳性菌种提取的重组质粒pEGFP-cl-FL进行测序。由于在重组质粒中含有绿色荧光蛋白报告基因，非常方便后续实验中基因表达的检测。(4)携带重组质粒阳离子纳米脂质体的制备及检测依据静电吸附原理制备阳离子载基因脂质体，取Lipofectamine 2000 (以体积计)加入无血清RPMI1640培养基；取步骤(3)构建的重组质粒pEGFP-cl-FL (以质量计)用无血清RPMI1640培养基稀释后，将两者混匀后，然后室温下孵育20±5min，即得携带FL基因重组质粒的纳米阳离子脂质体。用琼脂糖凝胶阻滞分析定性考察Lipofectamine 2000与重组质粒pEGFP-cl-FL结合率,并选择最优比。应用原子力电镜测定制备的载基因阳离子纳米脂质体的粒径及zeta电位等参数。可将本发明的可高效在体内外转染基因的新型纳米级阳离子脂质体放入洁净的玻璃瓶中，用氮气充填试管，将制备的纳米阳离子脂质体保存于试管中置于4°C避光保存。本发明人经过反复实验探索,使Lipofectamine 2000与重组质粒pEGFP_cl_FL分别按不同的比例室温孵育，经过琼脂糖凝胶电泳定性考察Lipofectamine 2000与重组质粒pEGFP-cl-FL的结合率，选择最优比为8:1。我们将制备的携带FL基因的阳离子纳米脂质体成功转染树突状细胞，实验中发现裸重组质粒基本没有表达荧光蛋白，说明其没有进入细胞内，基因没有表达，而阳离子纳米脂质体成功将FL基因很好的运载至细胞内，使基因在树突细胞内得到很好的表达，且随着培养时间的增加，蛋白表达量有所增加，证明了阳离子纳米脂质体作为基因载体具有巨大的优越性。我们将转染阳性的树突状细胞移植入构建的结肠癌动物模型，通过流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率和通过MTT法检测细胞死亡率可以看出，FL基因组肿瘤细胞凋亡率和死亡率显著高于对照组，细胞的增殖指数明显低于对照组。因此，本发明的可高效在体内外转染基因的新型纳米级阳离子脂质体具有制备方法简单、低毒、低免疫原性、缓释、高效靶向的特性，特别适合于作为体内外转染和基因治疗的基因载体，在肿瘤及其他领域的基因研究方面具有良好的应用前景。
图IpEGFP-cl载体的启动子和多克隆位点。
图2合成的puc57_FLT3L的序列测定结果。图3pEGFP-cl_FL重组质粒Sal I和BamH I双酶切鉴定图。图4Lipofectamine 2000 与 pEGFP-cl-FL 的复合物电镜照片。图5不同比例的Lipofectamine 2000与pEGFP-cl-FL结合的凝胶电泳分析，(I 代表裸 DNA，2_8 分别是 Lipo/DNA ( μ l/μ g) % 1:1,2:1,3:1,5:1,8:1, 10:1和 15:1,可见 Lipofectamine 2000 与重组质粒 pEGFP-cl-F 最优比是 8:1, Lipofectamine2000使DNA完全压缩而滞留在点样孔中)。图6Lipofectamine 2000/DNA复合物转染树突状细胞后24、48、72h荧光显微镜结
果O图7DC细胞移植动物模型后各组肿瘤体积的测量。(图中4条线自上而下分别为对照组，TRAIL基因组，FL基因组，FL/TRAIL混合组。)图8实时荧光定量PCR检测FL基因表达柱形图。(8个柱形图自左向右分别代表I: FL 组；2: TRAIL 组；3: FL/TRAIL 混合组；4:对照组· 5: FL 组；6: TRAIL 组；7: FL/TRAIL 混合组；8:对照组.)图9应用Western-blot法检测FL蛋白的表达。
具体实施例方式一、基因的合成I、FLT3L卿FL)基因合成合成FLT3L基因序列，并将该基因克隆至puc57载体的Sal I和BamH I之间。FLT3L基因全长510bp，共编码169个氨基酸残基。FLT3L基因的合成由上海生工生物工程技术有限公司完成。2、合成基因的验证分别将克隆有FLT3L基因的重组质粒pUC57_FLT3L进行酶切验证，并进行序列测定，以检测其核苷酸序列与设计的是否完全一致(测定结果如图2所示)。序列测定有上海英俊公司完成。3、DNA 酶切(I)将清洁干燥并经灭菌的Eppendorf管编号，用微量移液枪分别加入上述步骤质粒3 μ L, IOXTaq Bufferl. 5 μ L,再加入重蒸水使总体积为9 μ L,将管内溶液混匀后加入Sal I和BamH I各0. 5 μ L，用手指轻弹管壁使溶液混匀。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。(2)混匀反应体系后，将Eppendorf管置于37°C水浴保温2 3h，使酶切反应完全。(3)停止反应，置于冰箱中保存备用。4、DNA凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭(Ethidium bromide, EB)染色，在紫外光下至少可以检出I IOng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。凝胶电泳步骤如下 (I)取5 X TBE缓冲液20mL加水至200mL，配制成O. 5 X TBE稀释缓冲液，待用。(2)胶液的制备称取O. 25g琼脂糖，置于IOOmL锥形瓶中，加入25mL O. 5 X TBE稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为1%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发。(3)胶板的制备将胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持lmmol/L的间隙。(4)向冷却至5(T60°C的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5yg/mL。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入O. 5XTBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。(5)加样取10 μ L酶解液与2 μ L6X载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。(6)电泳加完样后立即接通电源。控制电压小于4V/cm，电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到凝胶2/3时，停止电泳。(7)观察在波长为254nm的长波长紫外灯下观察。DNA存在处可以见到桔红色荧光条带。5、重组质粒puc57-FLT3L亚克隆至pEGFP-cl载体(pEGFP-cl载体的启动子和多克隆位点如图I所示)。①酶切取两个500yL EP管，一个加入pEGFP-cl载体，一个加入puc57-FLT3L载体，然后分别加入水、酶Sal I和BamH I及其buffer,用量如下pucy/m 6μ[pliUFF-cl2 μΙ
Sal IlμLSal II
BamH IIuLBamH IIfiL
IOxT Buffer3 μ IOxT Buffer3 μ
ddH:0IOfxLddH;014 suL
总计20 μL总计20 μι37 °C水浴酶切过夜。②琼脂糖凝胶电泳，回收将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测是否出现带有FLT3L片段的带Γ50(Λρ)和线状pEGFP-cl vector的带，如有，用DNA片段快速纯化/回收试剂盒分别回收FLT3L片段和线状pEGFP-cl vector。回收步骤(I)在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率(注切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤)。(2)估计胶条的重量，加3倍体积的Buffer QG (即IOOmg的胶加入300 μ L的Buffer QG)；(3)50°C温浴IOmin直至胶完全溶解，溶液应该是淡黄色，若为橙色或紫色时，则需要加10 μ L 3mol/LNaAc (pH5. 0)，混匀，则溶液会转变为黄色；(4)加等体积的异丙醇，混匀；(5)将溶液转移到收集管的离心柱内，12000r/min离心Imin ；(6)倒去收集管内的液体，并将离心柱重新放于收集管内；(7)加O. 5mL Buffer QG于离心柱内，12000r/min离心lmin,倒去收集管内的液体，并将离心柱重新放于收集管内；(8)加O. 75mL Buffer WB于离心柱内，12000r/min离心lmin,倒去收集管内的液
体，并将离心柱重新放于收集管内；(9)高速离心2min (13000 14000r/min)后,将离心柱转移于另一干净的I. 5mL离心管内；(10)加入50yL Buffer EB或者超纯水于离心柱的滤膜中央，静置I 3min，10000r/min离心lmin,则溶液中含有目的DNA片段；(11)将DNA片段溶液置于_20°C保存。③连接
反应体系pEGFP-cl 载体2 μΕ
FLT3L 片段8 ^tL
IOxiigationBuffe1.5 μ
Τ4 DNA Iigase1.5 pL
IOxBSAi.5‘uL
CldH2O0.5 M.L
总计15 μι将混合体系在16 °C连接过夜。·④制备感受态及转化I)、大肠杆菌感受态细胞的制备(I)取1%大肠杆菌E. coli DH5a接种于含50mL LB培养基的试管中，37°C振荡培养过夜(250r/min)。(2)往一个2L的烧瓶中加入400mL LB培养液，再加入4mL过夜培养物，于37°C振荡培养(250r/min) 3h 至 OD600 约为 O. 3。(3)将培养液分装到8个50mL预冷无菌的聚丙烯管中，于冰上放置5 10min，然后于 4°C，1600g 离心 7min。(4)细胞沉淀用IOmL冰冷的CaCl2溶液重悬，于4°C，IlOOg离心5min。(5)细胞沉淀用IOmL冰冷的CaCl2溶液重悬，冰上放置30min，于4°C，IlOOg离心5min。(6)用2mL冰冷的CaCl2溶液重悬各管细胞，然后按每管100 μ L的量分装于预冷的无菌聚丙烯管中，立即冻存于_70°C。2)、连接产物转化大肠杆菌(I)取新制备的一管感受态细胞，冰上30min左右解冻。(2)将感受态细胞和4ng质粒DNA混匀，冰浴30min。(3)将Ep管置于42°C水浴中热击90sec，立即置于冰上3 4min。(4)在Ep管中加800 μ L LB培养基混匀，37°C培养Ih。(5)4000g离心lmin，取O. ImL涂在含适当浓度抗生素的LB平板上，平板在37°C下正向放置30min以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。⑤挑菌:AMP培养基上长出了菌落，挑选几个较大的周围没有杂菌的白色菌落，用牙签分别挑取，分别放入装有3mL的培养液的小管中，小管中加入了 3 μ L的Kana溶液，将小管放到摇床上，37°C培养一个晚上。⑥质粒DNA的小量制备(碱裂解法小量制备质粒DNA)(I)取I. 5mL培养物入微量离心管中，用微量离心机于4°C以最大转速离心30sec，将剩余的培养物贮存于4°C。(2)离心结束，尽可能吸干培养液。(3)将细菌沉淀重悬于100 μ L预冷的溶液I中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。(4)加200 μ L新鲜配制的溶液II，颠倒数次混匀(不要剧烈振荡)，并将离心管放置于冰上2 3min，使细胞膜裂解(溶液II为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清)。
(5)加入150 μ L预冷的溶液III，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3 5min。溶液III为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。(6)用小离心机于4°C以最大转速离心lOmin，将上清液转移到另一洁净离心管中。(7)加入等量体积的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混合有机相和水相，然后用小离心机于4°C以最大速度离心2min。(8)小心移出上清到一新的洁净微量离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2 5min沉淀核酸，4°C离心12000g离心5min，收集沉淀的核酸。 (9)加ImL 70%乙醇于沉淀中并将盖紧的试管颠倒数次，用小离心机于4°C以最大转速离心Imin。弃上清,将沉淀在室温下晾干。(10)沉淀溶于 20 μ L TE (含 RNaseA20 μ g/mL), 37 °C 水浴 30min 以降解 RNA 分子，-20°C保存备用。⑦酶切取500μ L的EP管，加入重组质粒3μ L、10 X Buffer T 1.5yL，再加入重蒸水使总体积为9 μ L，将管内溶液混匀后加入Sal I和BamH I各O. 5 μ L，放到37°C下水浴3h以上；⑧琼脂糖凝胶电泳，检查将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，在GIS凝胶成像系统中检测是否出现约500bp的带，若有则初步证明FLT3L片段克隆到pEGFP-cl载体上了，同时将FLT3L片段连入pEGFP-c I载体中的阳性菌种送上海的英俊生物公司测序。pEGFP-c I-FL重组质粒Sal I和BamH I双酶切鉴定图如图3所示，可见清晰地切出与FL基因大小(约510bp)相符的片段并与DNAmarker相符。二、阳离子载基因纳米脂质体的制备I、阳离子载基因纳米脂质体的制备依据静电吸附原理制备阳离子载基因脂质体。首先取一定量的Lipofectamine2000至I. 5mL的EP管中，加入定量的无血清RPMI1640培养基，放置5min ;取一定量的重组质粒pEGFP-cl-FL用无血清RPMI1640培养基稀释后，将两者混合(注混匀时不能用枪吹打，用手指轻轻弹EP管使其混勻)，室温孵育20min, Lipofectamine2000/重组质粒pEGFP-cl-FL复合物即制得，其电镜照片见图4。2、琼脂糖凝胶的制备及使用方法按照文献方法制备琼脂糖凝胶并做适当改进。称取O. 16g琼脂糖于锥形瓶中，力口入20mlI X TAE稀释液(Tris碱、EDTA、冰醋酸)，加热至琼脂糖沸腾溶解，即为O. 8%的琼脂糖凝胶液，待冷却至50 65°C时加入2μ I Goldview，轻轻混匀(注意不要产生气泡)，然后将琼脂糖凝胶液倒入插有模板梳的水平槽内，待凝固完全后，轻轻拔出模板梳，将装有凝胶的平板放入电泳槽内，将外槽注满TAE稀释液，高于胶面I 2mm。采用移液器量取Iy IIoadingbuffer,加入9 μ I样品，混勻，轻轻打入加样孔中(注意不要溢出)，选择电压90V,时间25min进行电泳。3、Lipofectamine 2000 与重组质粒 pEGFP_cl_FL 最优比的考察量取7等份Lipofectamine 2000,与适量重组质粒pEGFP-cl-FL溶液室温孵育 20min,使 Lipofectamine 2000 (以 Lipofectamine 2000 的体积计)与重组质粒pEGFP-cl-FL (以质量计)分别按不同的比例孵育，用琼脂糖凝胶阻滞分析定性考察了Lipofectamine 2000与重组质粒pEGFP-cl-FL结合率(如图5所示)，并选择最优比为8:1(8μ l/lyg)。三、树突状细胞的培养及体外转染试验I、树突状细胞的分离、培养及鉴定将环磷酰胺由小鼠尾静脉注射，取脾脏组织，加Tris-NH4CU rmCM-CSF/rmIL-4、TNF-Y等因子培养。相差显微镜下观察细胞形态特点，扫描电镜及透射电镜下观察细胞表面及超微结构。应用流式细胞仪分析细胞表面标记。2、载基因纳米阳离子脂质体体外转染试验采用树突状细胞系评价Lipofectamine2000/pEGFP-cl-FL复合物的细胞转染能力。 首先取2μ1 Lipofectamine2000至I. 5mL的EP管中，加入98 μ I的无血清RPMI1640培养基，放置5min ;取一定量的pEGFP-cl-FL用无血清RPMI1640培养基稀释至100 μ I后，将两者混合室温放置20min，制得Lipofectamine2000/pEGFP-cl-FL纳米阳离子脂质体复合物。同法取一定量的早已构建好的PDsRedl-Cl-TRAIL质粒作为对照基因与Lipofectamine2000 混合制得 Lipofectamine2000/pDsRedl-Cl-TRAIL 纳米阳离子脂质体复合物。转染前24h，在12孔培养板上接种树突状细胞数为IXlO5个/孔，用含有rmGM-CSF/rmIL4条件的完全培养基进行常规培养。当细胞约达到70 80%融合时，用PBS冲洗细胞2次，将树突状细胞分为3组，第一组于每孔中加入Iml由不含血清的培养基稀释Lipofectamine2000/pEGFP-cl_FL复合物，第二组于每孔中加入Iml由不含血清的培养基稀释Lipofectamine2000/pDsRedl-Cl-TRAIL复合物，第三组以转染裸质粒的细胞作为对照组。置于37° C，5%C02孵箱中培养4h，移去介质，用PBS冲洗细胞2次，加入含有lmlrmGM-CSF/rmIL4条件的培养基，24h_72h，使进入细胞内的基因得以表达，利用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果如图6所示，实验发现裸质粒基本没有表达荧光蛋白，说明裸质粒没有入细胞内，基因没有表达，而阳离子纳米脂质体成功将FL基因很好的运载至细胞内，使基因在树突细胞内得到很好的表达，且随着培养时间的增加，蛋白表达量有所增加，证明了阳离子纳米脂质体作为基因载体具有巨大的优越性。3、MTT法检测转染后树突状细胞对LOVO细胞的毒性取对数生长期的结肠癌LOVO细胞，分别加入用RPMI 1640培养基稀释至不同浓度的转染阳性的树突状细胞，加入MTT、DMS0，在免疫酶标仪上测定吸光度(OD)值，计算LOVO细胞相对增殖率(RGR)。阴性对照为1640培养液，阳性对照为聚丙烯酰胺单体溶液。结果显示FL组LOVO细胞死亡率明显高于对照组，FL组和对照组之间比较有显著意义，P < O. 05(见表I)。表I : MTT法检测转染后树突状细胞对LOVO细胞的毒性作用(％，s 士 s)
Fl基因组 Traii对照基因组对照组24h25.41士2.05 24.84±2.625.50±0.47 48h 39.85士3.58 38.66±3.71 5.72±0.65
▲应用MTT法检测转染后树突状细胞对LOVO细胞的毒性作用，通过FL基因组、Trail对照基因组分别和对照组比较，可以看出FL基因组和Trail基因组肿瘤细胞死亡率均显著高于对照组，P < O. 05。四、结肠癌动物模型肿瘤杀伤机制探讨I、动物模型的建立及载基因树突状细胞的移植裸鼠腋下皮下注射LOVO细胞，20天左右注射部位出现明显的种植瘤结节。观察瘤结节的形状，记录瘤结节体积大小。收集阳性DC，调节DC密度，采用直接注射法自动物模型瘤体附近皮下不同部位注射lOOul。将动物模型随机分为4组，一组注射携带FL基因的DC, 一组注射携带对照基因TRAIL的DC，另一组同时注射携带FL基因和TRAIL基因的DC，对照组注射等量含空白纳米脂质体的DC。2、结肠癌动物模型肿瘤杀伤机制探讨 ①肿瘤肿块直径变化的测定移植后第3、6、9、2和15天，分别测量各组裸鼠肿瘤的长轴(a)和短轴(b)，按公式V=ab2X π/6计算肿瘤体积，结果如图7所示，对照组肿瘤体积增长最快，FL基因组肿瘤体积增长较慢。②肿瘤细胞中FLmRNA和TRAILmRNA的测定设计FL和TRAIL引物，用实时荧光定量PCR仪进行检测FL和TRAIL基因在肿瘤细胞中的表达。引物及TaqMan探针由上海生物工程有限公司设计合成。结果如图8所示，通过实时荧光定量PCR可以在FL组检测到FLmRNA水平，而在对照组则没有检测到FL mRNA。③移植后LOVO细胞凋亡情况的检测应用流式细胞仪FCM技术，取肿瘤细胞离心后加碘化丙啶Iml染色30分钟，过滤后上机检测。结果显示，FL基因组肿瘤细胞凋亡率显著高于对照组，而肿瘤细胞的增殖指数明显低于对照组(见表2)。表2 :注射载基因DC后肿瘤细胞凋亡率和增值指数的变化
Fl基因组Trail对照基因组复合基因组对照组凋亡率(％)8.72±1.67 7.31士1.4940.86±3.17 0.69±0.51
增值指数(％)31.07±1.68 33.21士 1.52 15.41 士1.38 36.54士 2.25▲应用流式细胞仪分析肿瘤细胞的凋亡率和增值指数，通过FL基因组、Trail对照基因组分别和对照组比较，可以看出FL基因组和Trail基因组肿瘤细胞凋亡率均显著高于对照组，而肿瘤细胞的增殖指数明显低于对照组，P < O. 05 ;而复合基因组和对照组比较，P < O. 01.④MTT法检测细胞死亡率分别取转染后第24h、48h、96h肿瘤细胞，加入MTT及无酚红RPMI-1640，继续孵育后加入DMS0，在酶联免疫仪上测定光吸收值，按下列公式计算细胞死亡率细胞死亡率=(I-实验组平均D值/对照组平均D值)χ100%ο实验结果显示移植后第24h. 48h和96h，FL基因组肿瘤细胞死亡率显著高于对照组，且随时间增加肿瘤细胞死亡率也增高(见表3)。表3 =MTT法检测注射载基因DC后肿瘤细胞死亡率
权利要求
1.携带FL基因重组体的纳米阳离子脂质体,其特征是，由Lipofectamine2000和携带FL基因的重组质粒pEGFP-cl-FL构成；所述携带FL基因的重组质粒pEGFP-cl_FL为将FL基因克隆至pEGFP-cl载体中制得。
2.如权利要求I所述的携带FL基因重组体的纳米阳离子脂质体，其特征是，Lipofectamine2000和携带FL基因的重组质粒pEGFP-cl-FL的比例为8:1，其中Lipofectamine 2000以体积μ I计,携带FL基因的重组质粒pEGFP_cl_FL以质量μ g计。
3.一种制备权利要求I或2所述的携带FL基因重组体的纳米阳离子脂质体的方法，其特征是， (1)基因的合成化学合成如SEQ-I所述的FL基因序列，将合成的基因进行序列测定； (2)重组质粒puc57-FL的制备将FL基因克隆至puc57载体的SalI和BamH I之间，并将克隆有FL基因的重组质粒pUC57-FL进行酶切验证及序列测定； (3)重组质粒puc57-FL亚克隆至pEGFP-cl载体构建重组质粒pEGFP-cl-FL:以Sal I和BamH I同时对重组质粒puc57_FL及pEGFP-c I载体进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳分别回收酶切产物；将puc57-FL的酶切产物连接到pEGFP-c I载体酶切产物中，然后转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒，经Sal I和BamH I双酶切鉴定正确后，并对阳性菌种提取的重组质粒pEGFP-cl-FL进行测序； (4)携带重组质粒阳离子纳米脂质体的制备取Lipofectamine2000加入无血清RPMI1640培养基；取步骤(3)构建的重组质粒pEGFP-c I-FL用无血清RPMI1640培养基稀释后，将两者混匀后，然后室温下孵育20±5min，即得携带FL基因重组质粒的纳米阳离子脂质体。
4.权利要求I或2所述的携带FL基因重组体的纳米阳离子脂质体在抑制肿瘤生长方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种携带FL基因重组质粒的纳米阳离子脂质体、制备方法及应用，属于生物医药领域。该脂质体是依据静电吸附原理，由Lipofectamine 2000和携带FL基因的重组质粒pEGFP-cl-FL构成；所述携带FL基因的重组质粒pEGFP-cl-FL为将FL基因克隆至含有绿色荧光蛋白报告基因的pEGFP-c1载体中制得。本发明的纳米级阳离子脂质体具有制备方法简单、低毒、低免疫原性、缓释、高效靶向的特性，特别适合于作为体内外转染和基因治疗的基因载体，在肿瘤及其他领域的基因研究方面具有良好的应用前景。
文档编号C12N15/63GK102876697SQ20121035270
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者孙念峰, 田爱玲, 胡三元, 陈景波, 黄庆先 申请人:孙念峰