用于表达肿瘤相关抗原的癌症的肽疫苗的制作方法

专利名称：用于表达肿瘤相关抗原的癌症的肽疫苗的制作方法
技术领域：
本专利申请要求获得2007年2月21日提交的美国临时专利申请60/902，949的权利，本文以提述方式并入其全部内容用于所有目的。本发明涉及生物科学领域，更具体地，涉及癌症治疗领域。特别地，本发明涉及新型免疫原性肽，其可极其有效地用作癌症疫苗，本发明还涉及包含这些肽的用于治疗和预防肿瘤的药物。
背景技术：
已经证明，⑶8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)可以识别来源于呈递在MHC-I类分子上的肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens, TAA)的表位肽,并随后裂解肿瘤细胞。自从第一例TAA — MAGE家族被发现以来，使用免疫学方法已经发现了许多其它的TAA (BoonT. (1993)Int J Cancer 54:177-80. ;Boon T.et al., (1996)J Exp Med 183:725-9. ;vander Bruggen P et al. , (1991) Science254:1643-7. ;Brichard V et al. , (1993) J ExpMed 178:489-95. ;Kawakami Y et al. , (1994) J Exp Med 180:347-52·)。现在，它们中的一些作为免疫治疗的靶标已经用于临床开发。迄今发现的TAA包括MAGE (van derBruggen P et al. , (1991) Science 254:1643-7.)、gplOO (Kawakami Y et al. , (1994)J Exp Med 180:347-52.), SART (Shichi jo S et al. ,(1998) J Exp Med 187:277-88.)和 NY-ES0-1 (Chen Y. T. et al. , (1997) Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 94:1914-8. ) 另一方面，某些已经证实在肿瘤细胞中在一定程度上特异过表达的基因产物也显示可以被识别作为用于诱导细胞免疫响应的靶标。这些基因产物包括p53 (Umano Y etal., (2001)Br J Cancer, 84:1052-7.), HER2/neu(Tanaka H et al. , (2001)Br J Cancer,84:94-9.), CEA (Nukaya I et al. , (1999) Int. J. Cancer 80,92-7·)等。尽管在有关TAA的基础和临床研究中已经取得了显著的进展(Rosenberg SAet al. , (1998)Nature Med, 4:321-7. ;Mukherji B. et al. , (1995)Proc Natl Acad SciUSA, 92:8078-82. :Hu X et al. , (1996) Cancer Res, 56:2479-83.)，但是目前可用的适于癌症治疗的候选TAA数目非常有限。在癌细胞中大量表达并且其表达仅限于癌细胞的TAA应当是免疫治疗靶标的有希望的候选物。HLA-A24和HLA-A0201都是日本人和白种人中的常见HLA等位基因(DateY et al. , (1996)Tissue Antigens 47:93-101. ;Kondo A et al., (1995)JTmmunoI155 : 4307-12. ;Kubo RT et al. , (1994)J Immunol 152:3913-24. ;Imanishi etal., Proceeding of the eleventh International Histocompatibility Workshop andConference Oxford University Press, Oxford, 1065(1992) ;Williams F et al. , (1997)Tissue Antigen 49:129-33.)。因此，由这些HLA等位基因呈递的癌抗原肽在治疗日本人和白种人患者的癌症方面可能特别有用。而且，已知低亲和性CTL的体外诱导通常是通过暴露于高浓度的肽，从而在抗原呈递细胞(APC)上产生高水平的可以有效激活这些CTL 的特异妝/MHC 复合体(Alexander-Miller et al. , (1996) Proc Natl Acad Sci USA93:4102-7.)。最近，HLA-I类结合肽序列可以用算法进行预测(Jounal of Immunological Methods, (1995), Vol. 185,pp. 181-190，J. Tmmunol. , (1994), Vol. 152,pp. 163-175，protein science, (2000)，Vol. 9，pp. 1838-1846)。然而，很难说预测的表位肽能够被切割成合适的大小，并在靶细胞表面上与HLA分子一起表达，以及被CTL识别。而且，所述的算法，例如 BIMAS (http://bimas. dcrt. nih. gov/cgi_Din/molbio/Ken_parker_comboform)(Parker KC, etal. , (1994) J Immunol. ; 152 (I) : 163-75. ; Kuzushima K, et al. , (2001)Blood. ;98(6) : 1872-81.))，虽然能够提示HLA分子结合肽，但是所提示的肽并不非常严格(Bachinsky MM, et. al. , Cancer Tmmun. 2005Mar 22; 5:6. ) 因此，TAA 筛选仍然存在大量 挑战和困难。最近在cDNA微阵列技术中取得的进展已经使人们能够构建出与正常细胞相比较的恶性细胞的基因表达谱(Okabe, H. et al. , (2001) Cancer Res.，61，2129-37. ;Lin YM. etal., (2002)Oncogene, 21;4120-8. ;Hasegawa S. et al., (2002)Cancer Res 62:7012-7·)。借助这种方法能够更全面地理解癌细胞的复杂本质和癌发生的机制，并使得鉴定在肿瘤中表达失调的基因更加容易(Bienz M. et al. , (2000)Cell 103，31卜20·)。在已经鉴定的在癌症中被上调的转录本中，最近发现了 CDH3 (GenBank Accession No. NM 001793;SEQID Nos. 1，2)，EPHA4(GenBank Accession No. L36645;SEQ ID Nos. 3，4)，ECT2(GenBankAccession No.AY37 6439;SEQ ID Nos. 5, 6),HIG2(GenBank AccessionNo. NM_013332;SEQ ID Nos. 7，8)INHBB(GenBank Accession No.NM_002193;SEQ IDNos. 9, 10) ,KIF20A(GenBank Accession No. NM_005733;SEQ IDNos. 11，12)，KNTC2(GenBankAccession No. AFO17790;SEQ ID Nos. 13，14)，TTK(GenBank Accession No. NM_003318;SEQID Nos. 15，16)和 URLClO (GenBankAccession No. NM_017527; SEQ ID Nos. 17，18)。这里通过提述方式并入上述引文的全部内容。这些基因在所分析案例(见下文)的各种癌组织的肿瘤细胞中被特异上调，本发明人对它们特别感兴趣。因此，衍生自⑶H3，EPHA4, ECT2, HIG2，INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK和URLC10的免疫原性肽可用于选择性杀死表达这些抗原的肿瘤细胞。本发明解决了这个需求，以及别的需求。因为细胞毒药物例如M-VAC通常导致严重的不良反应，很明显，基于已得到充分表征的作用机制，细心选择新型的靶分子对于开发副作用风险最小的有效抗癌药物是非常有用的。为了这个目标，前人已经对不同癌症和正常人类组织进行了表达谱分析。这些研究发现了多种在癌症中特异过表达的基因(Lin YM, etal., Oncogene. 2002Jun 13 ; 21:4120-8. ;Kitahara 0，et al.，Cancer Res. 2001May I;61:3544-9. ;Suzuki C，et al.，Cancer Res. 2003Novl;63:7038-41. ;AshidaS，Cancer Res. 2004 Sep I; 64:5963-72. ; Ochi K，et al.，Int J Oncol. 2004Mar; 24 (3):647-55. ;Kaneta Y，et al.，Int J Oncol. 2003Sep;23:681-91. ;Obama Kj Hepatology. 2005Jun;41:1339-48. ;Kato T，et al.，Cancer Res. 2005 Jul I;65:5638-46. ;KitaharaO，et al. , Neoplasia. 2002Jul-Aug;4:295-303. ;Saito-Hisaminato A et al.，DNA Res2002，9:35-45.)。这些已鉴定出在各种癌症中过表达的基因的实例包括但不限于⑶H3，EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK 和 URLClO。CDH3 在以前已经被鉴定为在膀胱癌、宫颈癌、胆管细胞癌、结直肠癌、子宮内膜异位、 胃癌、弥散型胃癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、软组织肿瘤和睾丸肿瘤中过表达。EPHA4已经在膀胱癌、宫颈癌、胆管细胞癌、子宮内膜异位、弥散型胃癌、卵巣癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、前列腺癌和软组织肿瘤中被鉴定。ECT2已经在膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性骨髄性白血病(CML)、结直肠癌、食道癌、NSCLC、淋巴瘤、前列腺癌、肾癌和小细胞肺癌(SCLC)中被鉴定。HIG2已经在肾癌和SCLC中被鉴定。INHBB已经在胆管细胞癌、食道癌、NSCLC、肾癌、SCLC和软组织肿瘤中被鉴定。KIF20A已经在膀胱癌、乳腺癌、胆管细胞癌、食道癌、NSCLC、胰腺癌、前列腺癌、肾癌和SCLC中被鉴定。KNTC2已经在膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、食道癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC和软组织肿瘤中被鉴定。TTK已经在膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、食道癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、SCLC和软组织肿瘤中被鉴定。URCLlO已经在膀胱癌、宫颈癌、胆管细胞癌、食道癌、胃癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌和SCLC中被鉴定。
发明概要本发明部分地基于可用于免疫治疗的靶标的发现。因为TAA往往不具有免疫原性，所以合适靶标的发现是极其重要的。如上文提到的，已经确认⑶H3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和URLClO出在各种癌症中被上调。更具体地说，这些基因是用全基因组范围的cDNA微阵列进行基因表达谱分析而鉴定的。如上文讨论的，已显示⑶H3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK和URLClO的表达在从胰腺癌细胞到肾癌的各种肿瘤细胞中被特异上调。如表I中所示，CDH3的表达在34例膀胱癌中的26例，19例宫颈癌中的17例，所有的19例胆管细胞癌、34例结直肠癌中的30例，21例子宫内膜异位中的20例，20例胃癌中的13例，8例弥散型胃癌中的7例，37例NSCLC中的36例，全部16例胰腺癌，全部21例软组织肿瘤和全部10例睾丸肿瘤中确实被提高。表I进ー步证明EPHA4的表达在34例膀胱癌中的14例，14例宫颈癌中的8例，25例胆管细胞癌中的10例、15例子宮内膜异位中的5例，8例弥散型胃癌中的5例，全部5例卵巢癌，全部14例胰腺癌，51例前列腺癌中的20例，和23例软组织肿瘤中的14例中确实被提高。ECT2的表达在19例膀胱癌中的17例，12例乳腺癌中的5例，全部14例宫颈癌，全部13例胆管细胞癌，全部5例CML，8例结直肠癌中的7例，16例食道癌中的12例，16例NSCLC中的6例，10例淋巴瘤中的8例，I例胰腺癌中的I例，13例前列腺癌中的10例，6例肾癌中的3例，和13例SCLC癌肿的12例中确实被提高。HIG2的表达在20例肾癌中的19例，和9例软组织肿瘤中的7例中确实被提高。INHBB的表达在21例胆管细胞癌中的10例，全部12例食道癌，13例NSCLC中的10例，24例肾癌中的22例，14例SCLC癌症中的8例，和49例软组织肿瘤中的45例中确实被提闻。KIF20A的表达在全部31例膀胱癌，61例乳腺癌中的38例，11例胆管细胞癌中的10例，19例食道癌中的7例，22例NSCLC中的21例，全部6例卵巢癌，36例前列腺癌中的17例，11例肾癌中的6例，和全部15例SCLC中确实被提高。KNTC2的表达在32例膀胱癌中的30例，56例乳腺癌中的47例，全部10例宫颈癌，22例胆管细胞癌中的16例，37例CML中的17例，10例结直肠癌中的3例，46例食道癌中的11例，19例NSCLC中的15例，8例淋巴瘤中的7例，24例骨肉瘤中的20例，5例卵巢癌中的3例，全部2例胰腺癌，37例前列腺癌中的15例，19例肾癌中的14例，全部15例SCLC，和59例软组织肿瘤中的40例中确实被提高。TTK的表达在全部27例膀胱癌，30例乳腺癌中的25例，16例宫颈癌中的15例，全部10例胆管细胞癌，7例CML中的5例，10例结直肠癌中的6例，44例食道癌中的24例，15例肝癌中的8例，全部12例NSCLC，全部6例淋巴瘤，16例骨肉瘤中的13例，17例前列腺癌中的12例，全部15例SCLCjP 33例软组织肿瘤中的16例中确实被提高。URLClO的表达在全部29例膀胱癌，16例宫颈癌中的15例，全部7例胆管细胞癌， 19例食道癌中的7例，全部3例胃癌，27例NSCLC中的24例，19例骨肉瘤中的15例，5例胰腺癌中的4例，43例软组织肿瘤中的33例中确实被提高。本发明至少部分地基于这些基因(CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和URLC10)的基因产物的特异表位肽的鉴定，其具有诱导特异针对相应分子的细胞毒T淋巴细胞(CTL)的能力。如下文中将详细介绍的，用衍生自CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK 或 URLClO 的、可结合 HLA_A*2402 或 HLA_A*0201 的候选肽刺激健康供体的外周血单个核细胞(PBMC)。然后建立具有特异针对用每种候选肽冲击(pulse)的HLA-A24或HLA-A2阳性靶细胞的细胞毒性的CTL克隆和/或细胞系。这些结果证明，这些肽是HLA-A24或HLA-A2限制性表位肽，能够诱导针对表达CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK或URLClO的细胞的强カ而特异的免疫响应。因此，本发明提供了用于治疗或预防与CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK或URLClO过表达相关的疾病，例如癌症，的方法。这些方法涉及向需要的受试者施用本发明 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 和/或 URLClO 多肽的步骤。施用这些肽的结果可导致抗肿瘤免疫的诱导。因此，本发明提供了用于在受试者体内诱导抗肿瘤免疫的方法，这些方法涉及向受试者施用⑶H3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB,KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLClO多肽的步骤，本发明还提供了用于治疗或预防与⑶H3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 和/或 URLClO 过表达相关的疾病例如癌症的药物组合物，该药物组合物包含CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK和URLClO多肽。这些癌症的实例包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宮内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。本发明进一歩提供了用于预防上述疾病的手术后复发的方法。关于上述具体的目标和目的，本领域的技术人员可以理解，本发明的ー个或多个方面可以满足特定的目的，而ー个或多个其它的方面则可以满足某些其它的目的。各个目标可能不能全面等同地适用于本发明的每ー个方面。因此，对于本发明任ー个方面而言，本文中的目的可以分别地看待。结合附图和实施例阅读下面的详细说明书，本发明的目的和特征将变得更加清晰明了。然而，应当理解，无论是本发明的前述概要还是下文的详细说明书都是优选的实施方案，并不对本发明或者本发明的其它可选择实施方案构成限制。特别地，尽管本文是參考大量的具体实施方案对本发明进行介绍，但是应当意识到，这些描述只是本发明的举例说明，不应认为对本发明具有限制。在不背离如附加权利要求中描述的本发明的精神和范围的前提下，本领域的技术人员可以进行各种修改和适用。类似地，根据上述概要和下文介绍的某些实施方案，本发明的其它目的、特征、利益和优势是容易想到的，对本领域的技术人员而言也是显而易见的。这些目的、特征、利益和优势在所附的实施例、数据、图表以及其合理的推论(无论是就其本身还是联系本文引用的參考文献)的基础上是容易想到的。附图简述通过联系附图的简要说明和本发明的详细介绍以及下面的优选实施方案，本发明的各个方面和应用对于技术人员而言将变得显而易见。
[

图1-1]图I描述了表位肽的筛选结果，其显示，CDH3-A24-10-332(SEQ ID NO: 34),CDH3-A24-10-470 (SEQ ID NO:358)、CDH3-A24-9_513(SEQ ID NO:19)、CDH3-A24-9_406(SEQID N0:22)、CDH3-A24-10-807(SEQ ID NO :30)和 CDH3-A24-10-655 (SEQ ID NO :344)显示出强的IFN-gamma产生。〃a〃是阴性肽的实例，其虽然可能具有与HLA_A*2402的结合活性，但没有检测出诱导CTL的能力。〃b〃表现了 CDH3-A24-10-332(SEQ ID NO:34)的CTL诱导能力。IFN-gamma ELISP0T 测定显示与对照相比 CDH3-A24-10-332 (SEQID NO:34)展示了高效的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#4建立的CTL系被证明具有特异针对用表位肽冲击过的靶细胞的响应。〃c〃描述了 CDH3-A24-10-470(SEQ ID NO:358)的CTL诱导能力。通过 IFN-gammaELISPOT 测定显示 CDH3-A24-10-470(SEQ ID NO:358)与对照相比具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#4建立的CTL系被证明具有特异针对经表位肽冲击的靶细胞的响应。〃(!〃描述了 CDH3-A24-9-513(SEQ ID NO: 19)的CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISP0T 测定显示与对照相比 CDH3-A24-9-513 (SEQ ID NO: 19)具有强的IFN-gamma产生。左图画框的孔所示的#6孔证明了针对经表位肽冲击的祀细胞的特异性响应。而且，从中图画框的孔所示的阳性孔#5建立的CTL系显示了针对经表位肽冲击的靶细胞的特异性响应。〃e〃描述了 CDH3-A24-9-406(SEQ ID NO: 22)的CTL诱导能力。IFN-gamma ELISP0T测定显示与对照相比CDH3-A24-9-406 (SEQID NO:22)显示强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#2建立的CTL系显示了针对经表位肽冲击的靶细胞的特异性响应。[图1-2]图I描述了表位肽的筛选结果，其显示，CDH3-A24-10-332(SEQ ID NO: 34),CDH3-A24-10-470 (SEQ ID NO:358)、CDH3-A24-9_513(SEQ ID NO:19)、CDH3-A24-9_406(SEQID N0:22)、CDH3-A24-10-807(SEQ ID NO :30)和 CDH3-A24-10-655 (SEQ ID NO :344)显示出强的 IFN-gamma 产生。〃f"描述了 CDH3-A24-10-807 (SEQ ID NO :30)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISP0T 测定证明，与对照相比，CDH3-A24-10-807 (SEQ ID NO: 30)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#5建立了 CTL系和克隆。用所述肽建立的CTL克隆显示了针对用全长⑶H3基因和HLA-A24分子二者转染的C0S7的特异性CTL活性(右下图)。另ー方面，制备了用全长⑶H3而没有用HLA-A24转染的C0S7和用HLA-A24而没有用全长⑶H3转染的C0S7作为阴性对照。所述CTL克隆显示出针对用⑶H3和HLA-A24二者转染的C0S7的高特异性CTL活性。〃g"描述了 CDH3-A24-10-655 (SEQID NO:344)的CTL诱导能力。IFN-gamma ELISPOT测定显示与对照相比CDH3-A24-10-655 (SEQ ID NO:344)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#1建立了 CTL系和克隆。针对所述肽产生的建立的CTL克隆显示特异针对用全长⑶H3基因和HLA-A24分子二者转染的C0S7的CTL活性(右下图)。另ー方面，制备了用全长⑶H3而没有用HLA-A24转染的C0S7和用HLA-A24而没有用全长⑶H3转染的C0S7作为阴性对照。所述CTL克隆显示出针对用CDH3和HLA-A24 二者转染的C0S7的高的特异性CTL活性。[图2]图2描述了表位肽的筛选结果，其显示，Epha4-A24-9-453(SEQ ID N0:41)、
Epha4-A24-9-5(SEQ ID NO:44)、Epha4-A24-9_420(SEQ ID NO:48)、Epha4_A24-9_869(SEQID N0:46)、Epha4-A24-10-24(SEQ ID NO:78)Epha4-A02-9_501(SEQ ID NO:376)和Epha4-A02-9-165 (SEQ ID NO:379)显示出强的 IFN-gamma 产生。〃a〃 描述了阴性肽的实例，其虽然可能具有与HLA的结合活性，但没有检测出CTL诱导能力。"b"描述了Epha4-A24-9-453 (SEQID NO:41)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比Epha4-A24-9-453 (SEQ ID NO:41)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#3建立的CTL系显示特异针对经表位肽冲击的靶细胞的响应。〃c〃描述了 Epha4-A24-9-5 (SEQ ID NO:44)的 CTL-诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比Epha4-A24-9-5(SEQ ID NO:44)显示强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#2建立的CTL系显示特异针对经该表位肽冲击的靶细胞的响应。〃(!〃描述7 Epha4-A24-9-420 (SEQ IDNO:48)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比Epha4-A24-9-420(SEQ ID NO:48)显示强的IFN-gamma产生。上图画框的孔所示的#6孔证明了特异针对经该表位肽冲击的靶细胞的响应。而且，从中图画框的孔所示的阳性孔#6建立的CTL系证明了特异针对经表位肽冲击的靶细胞的响应。〃e〃描述了Epha4-A24-9-869 (SEQ ID NO:46)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比Epha4-A24-9-869(SEQ ID NO:46)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#5建立的CTL系证明了特异针对经表位肽冲击的靶细胞的响应。〃f"描述7 Epha4-A24-10-24(SEQ ID NO: 78)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比Epha4-A24-10-24(SEQ ID NO: 78)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#4建立的CTL系证明了特异针对用表位肽冲击的靶细胞的响应。〃g"描述了Epha4-A02-9-501(SEQ ID NO:376)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比Epha4-A02-9-501(SEQ ID NO:376)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#8建立了 CTL系和克隆。用Cr释放測定(CRA)測量了所建立的CTL系针对用肽冲击的靶细胞的细胞毒活性(下图)，CTL系具有非常强的特异针对用肽冲击的靶细胞的细胞毒活性。〃h〃描述了 Epha4-A02-9-165(SEQ ID NO:379)的 CTL 诱导能力。IFN-gammaELISPOT 测定显示与对照相比 Epha4-A02-9-165(SEQ ID NO:379)具有强的 IFN-gamma 产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#3建立了 CTL系和克隆。用Cr释放測定(CRA)測量了所建立的CTL系针对用肽冲击的靶细胞的细胞毒活性(右图)，CTL系具有非常强的特异针对用肽冲击的靶细胞的细胞毒活性。
[图3]图3描述了表位肽的筛选結果，其进ー步证明，ECT2-A24-9-515(SEQIDNO: 80), ECT2-A24-10-40 (SEQ ID NO: 100)和 ECT2-A24-10-101 (SEQ IDN0:101)显示出强的IFN-gamma产生。〃a〃描述了阴性肽的实例，其虽然可能具有与HLA的结合活性但没有检测出具有CTL-诱导能力。〃b〃描述了 ECT2-A24-9-515(SEQ ID NO:80)的CTL诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比 ECT2-A24-9-515 (SEQ ID NO:80)显示强的IFN-gamma产生。左图画框的孔所示的#5和#7孔显示了特异针对用表位肽冲击的靶细胞的响应。而且，从第二图中的画框的孔所示的阳性孔#7建立的CTL系显示了特异针对用表位肽冲击的靶细胞的响应。通过Cr释放测定(CRA)测量CTL系针对内源表达ECT2和HLA-A24的癌细胞系TE6的细胞毒活性，CTL克隆具有非常强的针对TE6的细胞毒活性。另一方面，效应细胞没有显示CTL系针对癌细胞系的细胞毒活性，没有检测出仅表达ECT2的TE5。〃c〃描述了 ECT2-A24-10-40(SEQ ID NO: 100)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT测定显示与对照相比ECT2-A24-10-40(SEQ ID NO: 100)具有强的IFN-gamma产生，并且从 画框的孔所示的阳性孔#2建立了 CTL系和克隆。用所述肽产生并建立的CTL克隆显示了特异针对用全长ECT2基因和HLA-A24分子二者转染的C0S7的CTL活性。另ー方面，制备了用全长ECT2而没有用HLA-A24转染的C0S7，用HLA-A24和作为全长ECT2的替代物的URLClO基因转染的C0S7，和用HLA-A24转染并用ECT2-10-101冲击的C0S7，作为阴性对照。CTL克隆显示出针对同时用ECT2和HLA-A24转染的C0S7的高的特异CTL活性。〃(!〃描述了ECT2-A24-10-101(SEQ IDN0:101)的 CTL诱导能力。IFN-gamma ELISPOT测定显示与对照相比ECT2-A24-10-101(SEQ ID NO: 101)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#1建立了 CTL系。用所述肽产生并建立的CTL克隆显示了特异针对同时用全长ECT2基因和HLA-A24分子转染的C0S7的CTL活性。制备了用全长ECT2而没有用HLA-A24转染的C0S7、用HLA-A24和作为全长ECT2的替代物的URLClO基因转染的C0S7、和用HLA-A24转染并用ECT2-10-101冲击的C0S7，作为阴性对照。CTL克隆显示出针对同时用ECT2和HLA-A24转染的C0S7的高特异CTL活性。[图4-1]图4描述了表位肽的筛选結果，其进ー步证明，HIG2-A24-9-19 (SEQIDNO: I 10)，HIG2-A24-9-22 (SEQ ID NO : I I I )，H I G2-A24-9-8 (SEQ IDNO:387), HIG2-A24-10-7 (SEQ ID NO : I I 2)，HI G2-A24-I O-I 8 (SE Q IDNO:394), HIG2-A02-9-15 (SEQ ID NO:116)，HIG2-A02-9-4 (SEQ ID NO:117)和HIG2-A02-10-8 (SEQ ID NO: 121)显示出强的IFN-gamma产生。〃a〃描述了阴性肽的实例，其虽然可能具有与HLA的结合活性但没有检测出具有CTL-诱导能力。"b"描述了HIG2-A24-9-19 (SEQ ID NO: 110)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比HIG2-A24-9-19 (SEQ ID N0:110)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#6建立的CTL系显示了特异针对用表位肽冲击的靶细胞的响应。"c〃描述了HIG2-A24-9-22 (SEQ ID N0:111)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比HIG2-A24-9-22 (SEQ ID NO: 111)显示强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#7建立的CTL系和克隆证明了特异针对用表位肽冲击的靶细胞的响应。〃d〃描述了 HIG2-A24-9-8 (SEQ ID NO:387)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比HIG2-A24-9-8(SEQ ID NO:387)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#5建立的CTL系和克隆证明了特异针对用表位肽冲击的靶细胞的响应。"e〃描述了HIG2-A02-9-8 (SEQ ID NO: 114)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比HIG2-A02-9-8 (SEQ ID NO: 114)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#10建立了 CTL系。用所述肽产生并建立的CTL系显示了特异针对同时用全长HIG2基因和HLA-A02分子转染的293T的CTL活性。制备了用全长HIG2而没有用HLA-A02转染的293T、用HLA-A02和作为全长HIG2的替代物的FoxP3基因转染的293T、以及用HLA-A02转染并用HIG2-9-15冲击的293T作为阴性对照。CTL系针对同时用HIG2和HLA-A02转染的293T显示了高的特异CTL活性。[图4-2]图4描述了表位肽的筛选結果，其进ー步证明，HIG2-A24-9-19 (SEQID NO:I 10)，HIG2-A24-9-22 (SEQ ID NO : 11 I)，HIG2-A24-9-8(SEQ IDNO : 387), HIG2-A24-10-7 (SEQ ID NO : I I 2)，H I G2-A24-I O-I 8 (SEQ ID NO:394), HIG2-A02-9-15 (SEQ ID NO:116)，HIG2-A02-9-4 (SEQ ID NO:117)和HIG2-A02-10-8 (SEQ ID NO: 121)显示出强的 IFN-gamma 产生。〃f "描述了HIG2-A24-10-7 (SEQ ID NO: 112)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比HIG2-A24-10-7 (SEQ ID NO: 112)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#1和#7建立的CTL系或克隆显示了特异针对用该表位肽冲击的靶细胞的响应。"g〃描述了 HIG2-A24-10-18(SEQ ID NO:394)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比HIG2-A24-10-18(SEQ ID NO:394)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#7建立的CTL系和克隆显示了特异针对用该表位肽冲击的靶细胞的响应。〃h〃描述了 HIG2-A02-9-15(SEQ ID NO: 116)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比HIG2-A02-9-15(SEQ ID NO: 116)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#10建立了 CTL系。用所述肽产生并建立的CTL系显示了特异针对同时用全长HIG2基因和HLA-A02分子转染的C0S7的CTL活性。制备了用全长HIG2而没有用HLA-A02转染的C0S7和用HLA-A02转染并用HIG2-9-8肽冲击的C0S7，作为阴性对照。CTL系显示出针对同时用HIG2和HLA-A02转染的C0S7的高特异CTL活性。[图4-3]图4描述了表位肽的筛选結果，其进ー步证明，HIG2-A24-9-19 (SEQID NO:I 10)，HIG2-A24-9-22 (SEQ ID NO : 11 I)，HIG2-A24-9-8(SEQ IDNO : 387), HIG2-A24-10-7 (SEQ ID NO : I I 2)，H I G2-A24-I O-I 8 (SEQ IDNO:394), HIG2-A02-9-15 (SEQ ID NO:116)，HIG2-A02-9-4 (SEQ ID NO:117)和HIG2-A02-10-8 (SEQ ID NO: 121)显示出强的 IFN-gamma 产生。〃i "描述了HIG2-A02-9-4(SEQ ID NO: 117)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比HIG2-A02-9-4 (SEQ ID NO: 117)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#10建立了 CTL系和克隆。用所述肽产生并建立的CTL系显示了特异针对同时用全长HIG2基因和HLA-A02分子转染的C0S7的CTL活性(中图)。另外，制备了用全长HIG2而没有用HLA-A02转染的C0S7，用HLA-A02和作为全长HIG2替代物的TTK基因转染的C0S7，和用HLA-A02转染并用HIG2-9-8冲击的C0S7，作为阴性对照。通过Cr释放测定(CRA)测量了 CTL克隆针对同时用全长HIG2基因和HLA-A02分子转染的293T和针对内源表达HIG2和HLA-A02的癌细胞系Caki-I的细胞毒活性(下图)，CTL克隆针对同时用HIG2基因和HLA-A02转染的转染子，以及针对Caki-I均具有极强的细胞毒活性。另ー方面，效应细胞没有显示具有针对仅用HIG2或者仅用HLA-A02转染的293T以及针对仅表达HIG2的癌细胞系 A498 的 CTL 系的细胞毒活性。"j"描述了 HIG2-A02-10-8(SEQ ID NO: 121)的 CTL-诱导能力。IFN-gamma ELISPOT测定显示与对照相比HIG2-A02-10-8 (SEQ ID NO: 121)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#9建立的CTL系证明了特异针对用该表位肽冲击的靶细胞的响应。[图5-1]图5描述了表位肽的筛选结果，其进ー步证明，INHBB-A24-9-180 (SEQIDNO:395)，INHBB-A24-10-180 (SEQ ID NO:I 33)，INHBB-A24-10-305 (SEQ IDNO: 135), INHBB-A24-10-7 (SEQ ID NO: 137)和 INHBB-A24-10-212 (SEQ ID NO: 426)显示出强的IFN-gamma产生。〃a〃描述了阴性肽的实例，其虽然可能具有与HLA的结合活性但没有检测出具有CTL诱导能力。〃b〃描述了 INHBB-A24-9-180(SEQ ID NO:395)的CTL诱导能 力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比 INHBB-A24-9-180 (SEQ ID NO:395)显示强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#7建立了 CTL系和克隆。通过Cr释放测定(CRA)测量所建立的CTL克隆针对同时表达INHBB和HLA-A02的肿瘤细胞Miapaca2的CTL活性(下图)，效应细胞显示出针对Miapaca2的高的特异细胞毒活性。另ー方面，它没有显示出针对表达INHBB而非HLA-A02的Caki-I的显著特异细胞毒活性。〃c〃描述了INHBB-A24-10-180 (SEQ ID NO: 133)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比INHBB-A24-10-180(SEQ ID NO: 133)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#3建立了 CTL系。用所述肽产生并建立的CTL系显示了针对同时用全长INHBB基因和HLA-A24分子转染的293T的高的特异CTL活性。另外，制备了用全长INHBB而没有用HLA-A24转染的293T和用HLA-A24转染并用INHBB-10-305肽冲击的293T，作为阴性对照。[图5-2]图5描述了表位肽的筛选结果，其进ー步证明，INHBB-A24-9-180 (SEQID NO:395)，INHBB-A24-10-180 (SEQ ID NO:133), INHBB-A24-10-305 (SEQ IDNO: 135), INHBB-A24-10-7 (SEQ ID NO: 137)和 INHBB-A24-10-212 (SEQ ID N0:426)显示出强的 IFN-gamma 产生。〃(!〃描述了 INHBB-A24-10-305 (SEQ ID NO: 135)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比 INHBB-A24-10-305 (SEQ ID NO: 135)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#2建立了 CTL系和克隆。用所述肽产生并建立的CTL克隆显示了针对同时用全长INHBB基因和HLA-A24分子转染的293T的高特异CTL活性。另外，制备了用全长INHBB而没有用HLA-A24转染的293T和用HLA-A24转染并用INHBB-10-180肽冲击的293T，作为阴性对照。〃e〃描述了 INHBB-A24-10-7 (SEQ IDNO: 137))的 CTL诱导能力。IFN-gamma ELISPOT测定显示与对照相比 INHBB-A24-10-7 (SEQID NO: 137))显示了强的IFN-gamma产生，并且从上图的画框的孔所示的阳性孔#8和下图的画框的孔所示的#2建立了 CTL系。来自#8孔的CTL系针对同时用全长INHBB基因和HLA-A24分子转染的293T显示了高的特异CTL活性。另外，制备了用全长INHBB而没有用HLA-A24转染的293T和用HLA-A24转染并用INHBB-10-40肽冲击的293T，作为阴性对照。〃f"描述了 INHBB-A24-10-212(SEQ ID NO :426)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比INHBB-A24-10-212(SEQ ID NO:426)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#1建立的CTL系显示了特异针对用表位肽冲击的靶细胞的响应。[图6-1]图6描述了表位肽的筛选结果，其进ー步证明，KIF20A-A24-10-304(SEQ IDNO:186), KIF20A-A24-9-383(SEQ ID NO:178), KIF20A-A24-10-66(SEQ ID NO:194)和KIF20A-A24-9-305 (SEQ ID NO: 174)显示出强的 IFN-gamma 产生。"a"描述了阴性肽的实例，其虽然可能具有与HLA的结合活性但没有检测出具有CTL-诱导能力。。"b"描述了KIF20A-A24-10-304(SEQ ID NO: 186)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比KIF20A-A24-10-304(SEQ ID NO: 186)显示强的IFN-gamma产生。右下图中画框的孔所示的#5孔证明了特异针对用表位肽冲击的靶细胞的响应。而且，从左上图中画框的孔所示的阳性孔#5建立的CTL系和克隆也证明了特异针对用表位肽冲击的靶细胞的响 应。用所述肽产生并建立的CTL克隆显示了特异针对用全长KIF20A基因转染的24-LCL的CTL活性。另外，制备了用模拟(mock)载体转染的24-LCL，作为阴性对照。通过Cr释放测定(CRA)测量了 CTL克隆针对同时表达KIF20A和HLA-A24的肿瘤细胞Miapaca2的细胞毒活性，CTL克隆具有非常强的特异针对Miapaca2的细胞毒活性(右下图)。另ー方面，没有显示出特异针对表达KIF20A而非HLA-A24的PK59的细胞毒活性。〃c〃描述了KIF20A-A24-9-383 (SEQ ID NO: 178)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比KIF20A-A24-9-383(SEQ ID NO: 178)显示强的IFN-gamma产生。右图中画框的孔所示的#3和4孔证明了特异针对用表位肽冲击的靶细胞的响应。而且，从左图中画框的孔所示的阳性孔#3建立的CTL系也证明了特异针对用表位肽冲击的靶细胞的响应。所建立的CTL系证明了针对同时用全长KIF20A基因和HLA-A24分子转染的C0S7的高特异CTL活性。另外，制备了用全长KIF20A而没有用HLA-A24转染的C0S7和用HLA-A24转染并用KIF20A-9-621肽冲击的C0S7，作为阴性对照。[图6-2]图6描述了表位肽的筛选结果，其进ー步证明，KIF20A-A24-10-304(SEQ IDNO: 186), KIF20A-A24-9-383 (SEQ ID NO: 178)，KIF20A-A24-10-66 (SEQ ID NO:194)和 KIF20A-A24-9-305 (SEQ ID NO: 174)显示出强的 IFN-gamma 产生。〃d〃 描述了KIF20A-A24-10-66(SEQ ID NO: 194)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比KIF20A-A24-10-66(SEQ ID NO: 194)具有强的IFN-gamma产生，并且从左上图中画框的孔所示的阳性孔#6和中下图中画框的孔所示的#3建立的CTL系证明了特异针对用表位肽冲击的靶细胞的响应。而且，通过有限稀释从来自#6孔的CTL系选出的CTL克隆显示了特异针对靶细胞的CTL活性。所建立的CTL克隆显示出特异针对同时用全长KIF20A基因和HLA-A24分子转染的C0S7的CTL活性。另外，制备了用全长KIF20A而没有用HLA-A24转染的C0S7，用HLA-A24和作为全长KIF20A的替代物的URLC10基因转染的C0S7，以及用HLA-A24转染并用KIF20A-10-308肽冲击的C0S7，作为阴性对照。〃e〃描述了KIF20A-A24-9-305 (SEQ ID NO: 174)的 CTL诱导能力。IFN-gamma ELISPOT测定显示与对照相比KIF20A-A24-9-305(SEQ ID NO: 174)具有强的IFN-gamma产生，并且从左上图中画框的孔所示的阳性孔#2和中下图中画框的孔所示的#6建立的CTL系证明了特异针对用表位肽冲击的靶细胞的响应。而且，通过有限稀释从来自#2孔的CTL系选出的CTL克隆证明了特异针对靶细胞的CTL活性。通过Cr释放测定(CRA)测量了 CTL克隆针对同时表达KIF20A和HLA-A24的肿瘤细胞MIapaca2的细胞毒活性，CTL克隆具有非常强的针对MIapaca2的细胞毒活性。另ー方面，针对表达KIF20A而不表达HLA-A24的PK59没有显示出显著的特异细胞毒活性。[图7-1]图7描述了表位肽的筛选结果，其进ー步证明，KNTC2-A24-9-309 (SEQID NO: 196) , KNTC2-A24-9-124 (SEQ ID NO:20 2) , KIF20A-A24-9-1 54 (SEQID NO:210) KNTC2-A24-9-150 (SEQ ID NO : 213)，KNTC2-A24-10-452 (SEQ IDNO: 214), KNTC2-A24-10-227 (SEQ ID NO: 217)和 KNTC2-A24-10-273 (SEQ ID NO: 223)显示出强的IFN-gamma产生。〃a〃描述了阴性肽的实例，其虽然可能具有与HLA的结合活性但没有检测出具有CTL-诱导能力。。〃b〃描述了 KNTC2-A24-9-309(SEQ ID NO: 196)的CTL i秀 导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比 KNTC2-A24-9-309 (SEQ ID NO: 196)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#8建立的CTL系证明了特异针对用该表位肽冲击的靶细胞的响应。〃c〃描述了 KNTC2-A24-9-124(SEQ ID NO:202)的CTL诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比 KNTC2-A24-9-124(SEQ ID N0:202)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#5建立的CTL系证明了特异针对用该表位肽冲击的靶细胞的响应。〃(!〃描述了 KIF20A-A24-9-154(SEQ ID N0:210)的CTL诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比 KIF20A-A24-9-154(SEQ ID N0:210)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#5建立的CTL系和克隆证明了特异针对用表位肽冲击的靶细胞的响应。〃e〃描述了 KNTC2-A24-9-150(SEQ ID N0:213)的CTL诱导能力。IFN-gamma ELISPOT测定显示与对照相比 KNTC2-A24-9-150 (SEQ ID NO:213)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#7建立的CTL系证明了特异针对用该表位肽冲击的靶细胞的响应。[图7-2]图7描述了表位肽的筛选结果，其进ー步证明，KNTC2-A24-9-309 (SEQID NO: 196) , KNTC2-A24-9-124 (SEQ ID NO:20 2) , KIF20A-A24-9-1 54 (SEQID NO:210)KNTC2-A24-9-150 (SEQ ID NO:213) , KNTC2-A24-10-452 (SEQ IDNO:214), KNTC2-A24-10-227 (SEQ ID N0:217)和 KNTC2-A24-10-273 (SEQ ID NO:223)显示出强的 IFN-gamma 产生。〃f"描述了 KNTC2-A24-10-452 (SEQ ID NO: 214)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比 KNTC2-A24-10-452 (SEQ ID NO:214)具有强的IFN-gamma产生，并且从左上图中画框的孔所示的阳性孔#4和中图中画框孔#5建立的CTL系和克隆显示了特异针对用该表位肽冲击的靶细胞的响应。而且，通过有限稀释从来自#5孔的CTL系选出的CTL克隆证明了特异针对靶细胞的CTL活性。从#4孔建立的CTL系显示出特异针对同时用全长KNTC2基因和HLA-A24分子转染的HEK293的CTL活性。另外，制备了用全长KNTC2而没有用HLA-A24转染的HEK293，用HLA-A24而没有用全长KNTC2转染的HEK293，和用HLA-A24转染并用KNTC-9-309肽冲击的HEK293，作为阴性对照。〃g〃描述了 KNTC2-A24-10-227(SEQ ID N0:217)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比KNTC2-A24-10-227(SEQ ID N0:217)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#1建立的CTL系证明了特异针对用表位肽冲击的靶细胞的响应。〃h〃描述7 KNTC2-A24-10-273 (SEQ ID NO:223)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比KNTC2-A24-10-273(SEQ IDNO:223)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#8建立的CTL系证明了特异针对用该表位肽冲击的靶细胞的响应。[图8-1]图8描述了表位肽的筛选結果，其进ー步证明，TTK-A02-9-462 (SEQIDN0:227), TTK-A02-9-719(SEQ ID NO:233)，TTK-A02-9-547(SEQ ID NO:228)和TTK-A02-10-462 (SEQ ID NO :254)显示出强的IFN-gamma产生。〃a〃描述了阴性肽的实例，其虽然可能具有与HLA的结合活性但没有检测出具有CTL-诱导能力。"b"描述了TTK-A02-9-462 (SEQ ID NO:227)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比TTK-A02-9-462 (SEQ ID NO: 227)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔M建立的CTL系和两个克隆证明了特异针对用表位肽冲击的靶细胞的响应。所建立的CTL克隆显示出针对同时用TTK基因和HLA-A02分子转染的C0S7的高特异CTL活性。 另外，制备了用全长TTK而没有用HLA-A02转染的C0S7，用HLA-A02而没有用全长TTK转染的C0S7，和用HLA-A02转染并用TTK-9-547肽冲击的TTK，作为阴性对照。〃c〃描述了TTK-A02-9-719(SEQ ID NO:233)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比TTK-A02-9-719(SEQ ID NO:233)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#1建立了 CTL系和克隆。所建立的CTL系针对同时用全长TTK基因和HLA-A02分子转染的C0S7显示出高的特异CTL活性。另外，制备了用全长TTK而没有用HLA-A02转染的C0S7以及用HLA-A02和作为全长TTK的替代物的HIG2基因转染的C0S7，作为阴性对照。[图8-2]图8描述了表位肽的筛选結果，其进ー步证明，TTK-A02-9-462 (SEQIDN0:227), TTK-A02-9-719(SEQ ID NO:233)，TTK-A02-9-547 (SEQ ID NO:228)和 TTK-A02-10-462 (SEQ ID NO:254)显示出强的 IFN-gamma 产生。〃d〃 描述了TTK-A02-9-547 (SEQ ID NO:228)的 CTL 诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比TTK-A02-9-547 (SEQ ID NO: 228)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#2建立了 CTL系和克隆。所建立的CTL系显示出针对同时用全长TTK基因和HLA-A02分子转染的C0S7的高特异CTL活性。另外，制备了用全长TTK而没有用HLA-A02转染的C0S7，用HLA-A02而没有用全长TTK转染的C0S7，和用HLA-A02转染并用TTK-10-462冲击的C0S7，作为阴性对照。[图8-3]图8描述了表位肽的筛选结果，其进ー步证明，TTK-A02-9-462 (SEQ ID NO: 227)、TTK-A02-9-719(SEQ ID NO:233)、TTK-A02-9_547(SEQ ID NO:228)和TTK-A02-10-462(SEQID NO:254)显示出强的 IFN-gamma 产生。〃e〃描述了 TTK-A02-10-462 (SEQ ID NO:254)的CTL 诱导能力。IFN-gammaELISPOT 测定显示与对照相比 TTK-A02-10-462 (SEQ ID NO:254)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#8建立了 CTL系和3个克隆。所建立的CTL克隆显示出针对同时用全长TTK基因和HLA-A02分子转染的C0S7的高特异CTL活性。另外，制备了用全长TTK而没有用HLA-A02转染的C0S7，用HLA-A02而没有用全长TTK转染的C0S7，和用HLA-A02转染并用TTK-9-547肽冲击的C0S7，作为阴性对照。[图9-1]图9描述了表位肽的筛选结果，其进ー步证明，URLC10-A02-9-206 (SEQ IDNO:271), URLC10-A02-9-212(SEQ ID NO:272)和 URLC10-A02-10-211(SEQ ID NO:288) M示出强的IFN-ga_a产生。〃a〃描述了阴性肽的实例，其虽然可能具有与HLA的结合活性但没有检测出具有CTL-诱导能力。〃b〃描述了 URLC10-A02-9-206(SEQ ID N0:271)的CTL诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定 显示与对照相比 URLC10-A02-9-206 (SEQ ID N0:271)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#7建立的CTL系显示了特异针对用表位肽冲击的靶细胞的响应。〃c〃描述了 URLC10-A02-9-212(SEQ ID NO:272)的CTL诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比 URLC10-A02-9-212 (SEQ ID NO:272)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#3建立的CTL系证明了特异针对用表位肽冲击的靶细胞的响应。〃(!〃描述了 URLC10-A02-10-211(SEQ ID NO:288)的CTL诱导能力。IFN-gamma ELISPOT 测定显示与对照相比 URLC10-A02-10-211 (SEQ IDNO:288)具有强的IFN-gamma产生，并且从画框的孔所示的阳性孔#5建立的CTL系证明了特异针对用表位肽冲击的靶细胞的响应。[图9-2]图9描述了表位肽的筛选结果，其进ー步证明，URLC10-A02-9-206 (SEQ IDNO:271), URLC10-A02-9-212(SEQ ID NO:272)和 URLC10-A02-10-211(SEQ ID NO:288) M示出强的IFN-gamma产生。〃续d〃，所建立的CTL克隆显示出针对同时用全长URLClO基因和HLA-A02分子转染的C0S7、HEK293和293T的高特异CTL活性。另外，制备了用全长URLClO而没有用HLA-A02转染的HEK293或293T，和用HLA-A02转染并用URLC10-10-64冲击的C0S7、HEK293或293T，作为阴性对照。在本附图中，〃+〃表示经肽冲击的靶物，〃-〃表示无肽冲击的祀物，〃R〃表示响应物(Responder), 〃S〃表示刺激物(Stimulator), 〃E〃表示效应物(Effctor), 〃T〃 表示祀物(Target)。发明详细说明除非特别指出，否则本文使用的词语〃一〃、〃 ー个〃和〃该〃的意思是指〃至少ー个”。除非特别定义，否则本文使用的全部科技术语具有与本发明所述领域普通技术人员所共同理解的相同的意思。本发明部分地基于可用于免疫治疗的靶标的发现。新TAA特别是可诱导强力而特异的抗肿瘤免疫响应的TAA的鉴定，为进一步开发肽疫苗策略在各种类型癌症中的临床应用提供了依据(Boon T et al. , (1996) J Exp Medl83:725-9. ;van derBruggen P et al. , (1991)Science 254:1643-7. ;Brichard V etal., (1993)J ExpMed 178:489-95. ;Kawakami Y et al. ,(1994) J Exp Med 180:347-52. ;Shichijo Set al. , (1998) J Exp Med 187:277-88. ; Chen YT et al. , (1997) Proc. Natl. Acd. Sci.USA,94:1914-8. ;Harris CC, (1996)J Natl Cancer Inst88:1442-55. ;ButterfieldLH et al. , (1999) Cancer Res 59:3134-42. ; Vissers JL et al. , (1999) CancerRes 59: 5554-9. ; van der Burg SH et al. , (1996) J. Immunol 156: 3308-14. ; TanakaF et al., (1997)Cancer Res 57:4465-8. ;Fujie T et al. , (1999)IntJ Cancer80:169-72. ;Kikuchi M et al. , (1999)Int J Cancer 81:459-66. ;Oiso M et al. , (1999)Int J Cancer 81:387-94.)。由于TAA往往没有免疫原性，所以发现合适的靶标是极其重要的课题。如上文指出的，CDH3 (GenBank 登录号 NM_001793; SEQ ID Nos. I, 2)，EPHA4 (GenBank 登录号 L36M5; SEQ ID Nos. 3, 4)，ECT2 (GenBank 登录号 AY376439; SEQ ID Nos. 5，6)，HIG2 (GenBank 登录号 NMjn3332; SEQ ID Nos. 7, 8)INHBB (GenBank 登录号 NM_002193; SEQ ID Nos. 9，10)， KIF20A (GenBank 登录号 NM_005733; SEQ ID Nos. 11,12)，KNTC2 (GenBank 登录号 AF017790; SEQ ID Nos. 13，14)，TTK (GenBank 登录号 NM_003318; SEQ ID Nos. 15，16)和URLClO (GenBank 登录号 NM_017527; SEQ ID Nos. 17，18)在先前已经通过 cDNA 微阵列技术被鉴定为在各种癌症中过表达。在本发明中，衍生自CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK 或 URLC10的肽被证明是HLA-A24和HLA-A2限制性的TAA表位，其中HLA-A24和HLA-A2是在日本人和白种人群中普遍发现的HLA等位基因。具体地，利用它们对HLA-A24或HLA-A2的结合亲和性，鉴定出了衍生自 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 或 URLC10 的、可结合HLA-A24或HLA-A2的肽候选物。通过在体外用负载有这些肽的树突细胞(DC)对T细胞进行刺激之后，使用如下的肽成功地建立了 CTL。CDH3-A24-9-513(SEQ ID NO:19)，CDH3-A24-9-406(SEQ ID NO:22)，CDH3-A24-10-807(SEQ ID NO :30),CDH3-A24-10-332(SEQ ID NO :34),CDH3-A24-10-655(SEQ ID NO :344),CDH3-A24-10-470(SEQ ID NO :358),EphA4-A24-9-453(SEQ ID N0:41),EphA4-A24-9-5(SEQ ID NO :44),EphA4-A24-9-869(SEQ ID NO :46),EphA4-A24-9-420(SEQ ID NO :48),EphA4-A24-10-24(SEQ ID NO :78),EphA4-A02-9-501(SEQ ID NO :376),EphA4-A02-9-165(SEQ ID NO :379),ECT2-A24-9-515(SEQ ID NO :80),ECT2-A24-10-40(SEQ ID NO:100)，ECT2-A24-10-101(SEQ ID NO:101)，HIG2-A24-9-19(SEQ ID NO:110)，HIG2-A24-9-22(SEQ ID NO:111)，HIG2-A24-9-8(SEQ ID NO :387),
HIG2-A24-10-7(SEQ ID NO:112)，HIG2-A24-10-18(SEQ ID NO :394),HIG2-A02-9-8(SEQ ID NO:114)，HIG2-A02-9-15(SEQ ID NO:116)，HIG2-A02-9-4(SEQ ID NO:117)，HIG2-A02-10-8(SEQ ID NO:121)，INHBB-A24-9-180(SEQ ID NO :395),INHBB-A24-10-180(SEQ ID NO:133)，INHBB-A24-10-305(SEQ ID NO:135)，INHBB-A24-10-7(SEQ ID NO:137)，INHBB-A24-10-212(SEQ ID NO :426),KIF20A-A24-9-305(SEQ ID NO:174)，
KIF20A-A24-9-383(SEQ ID NO:178)，KIF20A-A24-10-304(SEQ ID NO:186)，KIF20A-A24-10-66(SEQ ID NO:194)，KNTC2-A24-9-309(SEQ ID NO:196)，KNTC2-A24-9-124(SEQ ID NO :202),KNTC2-A24-9-154(SEQ ID NO:210)，KNTC2-A24-9-150(SEQ ID NO:213)，KNTC2-A24-10-452(SEQ ID NO:214)，KNTC2-A24-10-227(SEQ ID NO:217)，KNTC2-A24-10-273(SEQ ID NO :223),TTK-A02-9-462(SEQ ID NO :227),TTK-A02-9-547(SEQ ID NO :228),TTK-A02-9-719(SEQ ID NO :233),TTK-A02-10-462(SEQ ID NO :254),URLC-A02-9-206(SEQ ID NO:271)，URLC-A02-9-212(SEQ ID NO :272)和URLC-A02-10-211(SEQ ID NO :288)这些肽是每种HLA-A24或HLA-A2限制性TTA的表位肽。因为这些抗原在大多数癌症中过表达并且与肿瘤细胞增殖相关，因此它们可以用作针对癌症的免疫治疗靶标。癌症实例包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宮内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。因此，本发明进ー步提供了治疗或预防受试者体内与⑶H3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLClO过表达相关的疾病例如癌症的方法，这些方法包括向受试者施用小于大约40个氨基酸的免疫原性肽的步骤，其经常小于大约20个氨基酸，通常小于大约15个氨基酸，并且具有如下的氨基酸序列SEQ ID N0:19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271,272 或 288。或者，免疫原性肽可以具有如下提出的氨基酸序列，SEQ ID NO: 19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272或288，且其中有I个、2个或数个(例如最多5个)氨基酸被替换、删除或添加，只要所得的变体肽保留免疫原活性即可(也就是可诱导特异针对表达CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 和/或 URLClO 的细胞例如癌细胞的 CTL 的能力)。被替换、删除或添加的残基的数目一般为5个氨基酸或者更少，优选地4个氨基酸或更少，更优选地3个氨基酸或者更少，再更加优选地I个或2个氨基酸。预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宮内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组 织肿瘤和睾丸肿瘤。而且，本发明提供了用于防止上述这些疾病的手术后复发的方法。
已知变体肽(即通过向原始氨基酸序列替换、删除或添加I个、2个或多个氨基酸残基修饰使氨基酸序列而得的肽)可以保持原来的生物活性(Mark DF et al.，(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81:5662-6. ;Zoller MJ and Smith Μ, (1982)Nucleic AcidsRes 10:6487-500. ;Dalbadie-McFarland G et al. , (1982)Proc Natl Acad Sci USA79:6409-13.)。在本发明的语境中，优选地，氨基酸修饰的结果是保留原始氨基酸侧链的性质(该过程被称作保守氨基酸替换)。氨基酸侧链性质的实例包括疏水氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)，亲水氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，和具有如下共有功能基团或特征的侧链脂肪族侧链(G、A、V、L、I、P);含有羟基的侧链(S、T、Y);含有硫原子的侧链(C、M)；含有羧酸和氨基的侧链(D、N、E、Q);含有碱基的侧链(R、K、H);和含有芳香基的侧链(H、F、Y、W)。注意，插入字母表示的是氨基酸的单字母编码。在优选实施方案中，免疫原性肽是九肽(9聚体)或十肽(10聚体)。本发明进ー步提供在受试者体内诱导针对与CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB,KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLClO的过表达相关的疾病(例如癌症)的抗肿瘤免疫的方法，这样的方法包括向需要的受试者施用本发明免疫原性肽，即具有SEQ ID NO: 19,22,30,34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272或288的氨基酸序列的肽或其变体(即包含I个、2个或数个(例如最多5个)氨基酸的替换、删除或添加)的步骤。预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宫内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。在本发明的语境中，受试者优选是哺乳动物。哺乳动物的实例包括，但不限于，例如人、非人灵长动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛。在本发明中，肽可以通过体内或离体(ex vivo)程序施用给受试者。而且，本发明还提供了九肽或十肽用于制造用于治疗或预防与CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、
的过表达相关的疾病(例如癌症)的免疫原性组合物的应用，所述九肽或十肽从具有如下氨基酸序列的肽中选出SEQ ID N0:19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272 或288(以及其变体)。预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宮内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。下列肽的同源性分析证明，它们与来源于任何已知人类基因产物的肽均没有显著的同源性。CDH3-A24-9-513(SEQ ID NO:19)，CDH3-A24-9-406(SEQ ID NO:22)，CDH3-A24-10-807(SEQ ID NO :30), CDH3-A24-10-332(SEQ ID NO :34),CDH3-A24-10-655(SEQ ID NO :344),CDH3-A24-10-470(SEQ ID NO :358),EphA4-A24-9-453(SEQ ID NO :41),EphA4-A24-9-5(SEQ ID NO :44),EphA4-A24-9-869(SEQ ID NO :46),EphA4-A24-9-420(SEQ ID NO :48),EphA4-A24-10-24(SEQ ID NO :78),EphA4-A02-9-501(SEQ ID NO :376),EphA4-A02-9-165(SEQ ID NO :379),ECT2-A24-9-515(SEQ ID NO:80)，ECT2-A24-10-40(SEQ ID NO:100)，ECT2-A24-10-101(SEQ ID NO:101)，HIG2-A24-9-19(SEQ ID NO:110)，HIG2-A24-9-22(SEQ ID NO:111)，HIG2-A24-9-8(SEQ ID NO :387),HIG2-A24-10-7(SEQ ID NO:112)，HIG2-A24-10-18(SEQ ID NO :394),HIG2-A02-9-8(SEQ ID NO:114)，HIG2-A02-9-15(SEQ ID NO:116)，HIG2-A02-9-4(SEQ ID NO:117)，HIG2-A02-10-8(SEQ ID NO:121)，INHBB-A24-9-180(SEQ ID NO :395),INHBB-A24-10-180(SEQ ID NO:133)，INHBB-A24-10-305(SEQ ID NO:135)，INHBB-A24-10-7(SEQ ID NO:137)，INHBB-A24-10-212(SEQ ID NO :426),KIF20A-A24-9-305(SEQ ID NO:174)，KIF20A-A24-9-383(SEQ ID NO:178)，
KIF20A-A24-10-304(SEQ ID NO:186)，KIF20A-A24-10-66(SEQ ID NO:194)，KNTC2-A24-9-309(SEQ ID NO:196)，KNTC2-A24-9-124(SEQ ID NO :202),KNTC2-A24-9-154(SEQ ID NO:210)，KNTC2-A24-9-150(SEQ ID NO:213)，KNTC2-A24-10-452(SEQ ID NO:214)，KNTC2-A24-10-227(SEQ ID NO:217)，
KNTC2-A24-10-273(SEQ ID NO :223),TTK-A02-9-462(SEQ ID NO :227),TTK-A02-9-547(SEQ ID NO :228),TTK-A02-9-719(SEQ ID NO :233),TTK-A02-10-462(SEQ ID NO :254),URLC-A02-9-206(SEQ ID NO:271)，URLC-A02-9-212(SEQ ID NO :272)和URLC-A02-10-211(SEQ ID NO :288)因此，针对这些分子的免疫治疗导致未知或不良免疫响应的可能性显著降低。关于HLA抗原，这里提供的数据显示，A-24型或A-2型抗原(它们据称在日本人中高表达)有利于获得有效的結果。更加优选使用A-2402和A-0201等亚型。典型地，在临床上，预先对需要治疗的患者的HLA抗原类型进行检查，这样就有可能选择具有针对患者抗原的高水平的结合亲和性，或者具有通过抗原呈递诱导细胞毒T细胞(CTL)的能力的合适的肽。而且，为了获得具有高的结合亲和性和CTL诱导能力的肽，可以在天然存在的 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 和 URLClO 的部分肽的氨基酸序列的基础上进行I个、2个或数个(例如最多5个)氨基酸的替换、删除或添加。这里，术语“数个”是指5个或者更少，更优选地3个或者更少。而且，除了自然被展示的肽之外，由于通过与HLA抗原结合而展示的肽的序列的规则性已经知晓(Kubo RT, et al.，(1994)J. Immunol. , 152, 3913-24. ; Rammensee HG, et al. , (199t>; Immunogenetics. 41:178-228. ;Kondo A, et al. , (1995) J. Immunol. 155:4307-12.)，所以可以根据这些规则性对本发明的免疫原性肽进行修饰。例如，可以优选地使用N端第二个氨基酸被苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸替换的、具有高HLA-24结合亲和性的肽。类似地，也可以有利地使用C端氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸替换的肽。另一方面，可以有利地使用N端第二个氨基酸被亮氨酸或甲硫氨酸替换，或者C端氨基酸被缬氨酸或亮氨酸替换的、具有高HLA-A2结合亲和性的肽。替换不仅可以在末端氨基酸上进行，也可以在肽的潜在TCR识别位点处进行。许多研究已经证明，肽内氨基酸替换可以等同于或者优于原来的肽，例如 CAP1, p53(264_272), Her-2/neu(369-377)or gplOO(209_217) (Zarembaet al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) FebI;168 (3):1338-47. , S. 0. Dionne et al. Cancer Tmmunol immunother. (2003)52:199-206和 S. 0. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53，307-314)。而且，可以向肽的N端和/或C端添加I到2个氨基酸。
然而，当肽序列与具有不同功能的内源或外源蛋白质的氨基酸序列的一部分相同时，可能会诱发副作用，例如自身免疫紊乱或者针对特定物质的过敏综合症。因此，优选地要避免免疫原序列与已知蛋白的氨基酸序列匹配的情況。这种情况可以通过用可获得的数据库进行同源性检索加以避免。如果同源性检索确认，其中有I个、2个或数个不同氨基酸被替换的肽在自然界不存在，那么为了例如增加与HLA抗原的结合亲和性和/或增加CTL诱导性进行的上述氨基酸序列的修饰的危险就能够避免。尽管与上述HLA抗原具有高结合亲和性的肽被预期可高度有效地作为癌症疫苗，但是必须对根据以高结合亲和性的存在为指标选出的候选肽进行检验，考察其CTL诱导能力的实际存在。CTL诱导能力可以通过下述方式常规地加以确认诱导携帯有人MHC抗原的抗原呈递细胞(例如B淋巴细胞、巨噬细胞和树突细胞)，或者更具体地，衍生自人外周血单核白细胞的树突细胞，在用目标肽刺激之后，与CD8阳性细胞进行混合，并测量针对靶细胞的细胞毒活性。作为反应系统，可以使用可表达人HLA抗原的转基因动物(例如在下列文献中介绍的，BenMohamed L, et al. , (2000)Hum. Immunol. ;61 (8) :764-79 相关文献、书籍、链接)。例如，可以用51Cr等放射性同位素标记靶细胞，并且可以根据靶细胞释放的放 射性计算细胞毒活性。或者，可以通过測量在携帯有固定化肽的抗原呈递细胞的存在下由CTL产生并释放的IFN-ga_a,并用抗_IFN_ga_a单克隆抗体使培养基上的抑制区可视化来加以检验。作为检查上述肽CTL诱导能力的结果，发现与HLA抗原具有高结合亲和性的肽不一定具有高诱导能力。然而，从具有由下列肽表示的氨基酸序列的肽构成的群组中选择的九肽或十肽则显示出特别高的CTL诱导能力。CDH3-A24-9-513(SEQ ID NO:19)，CDH3-A24-9-406(SEQ ID NO:22)，CDH3-A24-10-807(SEQ ID NO :30),CDH3-A24-10-332(SEQ ID NO :34),CDH3-A24-10-655(SEQ ID NO :344),CDH3-A24-10-470(SEQ ID NO :358),EphA4-A24-9-453(SEQ ID NO :41),EphA4-A24-9-5(SEQ ID NO :44),EphA4-A24-9-869(SEQ ID NO :46),EphA4-A24-9-420(SEQ ID NO :48),EphA4-A24-10-24(SEQ ID NO :78),EphA4-A02-9-501(SEQ ID NO :376),EphA4-A02-9-165(SEQ ID NO :379),ECT2-A24-9-515(SEQ ID NO :80),ECT2-A24-10-40(SEQ ID NO:100)，ECT2-A24-10-101(SEQ ID NO:101)，HIG2-A24-9-19(SEQ ID NO:110)，HIG2-A24-9-22(SEQ ID NO:111)，HIG2-A24-9-8(SEQ ID NO :387),
HIG2-A24-10-7(SEQ ID NO:112)，HIG2-A24-10-18(SEQ ID NO :394),HIG2-A02-9-8(SEQ ID NO:114)，HIG2-A02-9-15(SEQ ID NO:116)，HIG2-A02-9-4(SEQ ID NO:117)，HIG2-A02-10-8(SEQ ID NO:121)，INHBB-A24-9-180(SEQ ID NO :395),INHBB-A24-10-180(SEQ ID NO:133)，
INHBB-A24-10-305(SEQ ID NO:135)，INHBB-A24-10-7(SEQ ID NO:137)，INHBB-A24-10-212(SEQ ID NO :426),KIF20A-A24-9-305(SEQ ID NO:174)，KIF20A-A24-9-383(SEQ ID NO:178)，KIF20A-A24-10-304(SEQ ID NO:186)，KIF20A-A24-10-66(SEQ ID NO:194)，KNTC2-A24-9-309(SEQ ID NO:196)，KNTC2-A24-9-124(SEQ ID NO :202),KNTC2-A24-9-154(SEQ ID NO:210)，KNTC2-A24-9-150(SEQ ID NO:213)，KNTC2-A24-10-452(SEQ ID NO:214)，KNTC2-A24-10-227(SEQ ID NO:217)，KNTC2-A24-10-273(SEQ ID NO :223),TTK-A02-9-462(SEQ ID NO :227),TTK-A02-9-547(SEQ ID NO :228),TTK-A02-9-719(SEQ ID NO :233),TTK-A02-10-462(SEQ ID NO :254),URLC-A02-9-206(SEQ ID NO:271)，URLC-A02-9-212(SEQ ID NO :272)和URLC-A02-10-211(SEQ ID NO :288)如上文指出的，本发明提供了具有细胞毒T细胞诱导能力的肽，S卩，具有SEQ IDN0:19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、lll、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272或288的氨基酸序列的肽或其变体(即有I个、2个或数个
氨基酸被替换、删除或添加的那些)。优选地，由在下列序列中表示的9个或10个氨基酸所构成的氨基酸序列或它们的变体不与任何其它内源蛋白质相关的氨基酸序列相匹配SEQ IDN0:19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272 或 288。
特别地，从N端起第二个氨基酸处变为亮氨酸或甲硫氨酸的氨基酸替换，C端氨基酸变为缬氨酸或亮氨酸的氨基酸替换，和N端和/或C端处I到2个氨基酸的氨基酸添加，是优选变体的实例。本领域的技术人员会认识到，除了氨基酸替换和添加之外，肽的免疫学活性片段也可以在本发明的方法中使用。用于确定活性片段的方法是本领域众所周知的。用经过修饰的肽刺激获得的CTL克隆能够识别原来的肽，并对表达原来的肽的细胞造成损伤。本发明的肽可以用众所周知的技术制备。例如，肽可以合成制备，使用重组DNA技术或者化学合成。本发明的肽可以単独合成，或者作为包含2个或更个肽的较长多肽合成。本发明的肽优选地是分离的，即，基本上没有其它的天然存在的宿主细胞蛋白质及其片段。本发明的肽可以含有修饰，例如糖基化、侧链氧化或磷酸化；只要该修饰不破坏本文所述的肽的生物活性即结合HLA抗原并诱导CTL的能力即可。其它的修饰包括掺入D氨基酸或其它氨基酸模拟物，它们可以例如用来增加肽的血清半衰期。
而且，本发明可以包含筛选有I个、2个或数个氨基酸被替换的肽的方法，其中所述肽包含选自下组的氨基酸序列，SEQ ID N0:SEQ ID NO: 19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、80、100、101、110、111、387、112、394、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217或223，所述方法包括如下步骤(a)确认对含有I个、2个或数个氨基酸的替换物的整个序列没有显著的序列同源性；(b)測量候选替换物肽的CTL诱导能力；和(c)选择CTL诱导能力等于或者高于原始肽的肽。例如，在优选实施方案中，本发明提供了ー种方法用于鉴定能够诱导针对表达至少ー种肿瘤相关抗原的细胞的CTL的肽，其中该肿瘤相关抗原是选自下组的抗原CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK 和 URLC10，所述方法包括如下步骤(i)提供或产生至少ー个候选序列，其包含通过向原始氨基酸序列替换、删除或添加I个、2个或数个氨基酸残基而被修饰的氨基酸序列，其中该原始氨基酸序列选自下组SEQ ID N0:19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、80、100、101、110、lll、387、112、394、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217 或 223 ；(ii)选择与衍生自除所述肿瘤相关抗原之外的任何已知人基因产物的肽均无实质显著同源性的候选序列；(iii)使由从步骤(ii)中选出的候选序列组成的肽与抗原呈递细胞接触；(iv)使步骤(C)中的抗原呈递细胞与T细胞接触，以评估肽刺激T细胞的能力；和(V)鉴定CTL诱导能力等于或高于由原始氨基酸序列组成的肽的肽。优选地，氨基酸被替换为保守该氨基酸侧链性质的不同氨基酸(该过程称作保守氨基酸替换)。氨基酸侧链性质的实例有疏水氨基酸(ム、1、し1^、？、1、￥、￥)，亲水氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，和具有如下共有功能基团或特征的侧链脂肪族侧链(G、A、V、L、I、P);含有羟基的侧链(S、T、Y);含有硫原子的侧链(C、M);含有羧酸和氨基的侧链(D、N、E、Q);含有碱基的侧链(R、K、H);和含有芳香基的侧链(H、F、Y、W)。注意，插入字母表示的是氨基酸的单字母编码。在本发明中，实质显著的同源性是，例如，与所比较的已知人基因产物有超过90%，优选地95%，更优选地99%或100%的同一性。
本发明的肽可以制备为包括本发明的2个或数个肽的组合，用作与⑶H3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLClO的过表达相关的疾病(例如癌症)的疫苗，这种疫苗可体内诱导CTL。预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宮内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软 组织肿瘤和睾丸肿瘤。这些肽可以构成合剂(cocktail)，或者可以通过标准技术彼此偶联。例如，这些肽可以表达成单个多肽序列。组合中的肽可以是相同的也可以是不同的。通过施用本发明的肽，肽被高密度地呈递在抗原呈递细胞的HLA抗原上，其进ー步诱导可特异地与在所展示肽和HLA抗原之间形成的复合体进行反应的CTL。或者，可以用本发明的肽刺激在细胞表面上具有本发明固定化肽的抗原呈递细胞。将这些细胞再次施用给相应受试者可诱导CTL，结果，可以提高针对靶细胞的攻击性。更具体地，本发明提供了用于治疗和/或预防与CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLClO过表达相关疾病(例如癌症)的増殖、转移等的药物，其包括一种或多种本发明的肽或者编码这些肽的多核苷酸。本发明的肽或多核苷酸特别有用于治疗 CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK 和/或 URLClO 相关疾病，例如癌症。预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宫内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。本发明的肽可以作为用传统制剂方法配制的药物组合物直接施用给受试者。在这种情况下，除了本发明的肽之外，还可以视情况包含通常用于药物的载体、赋形剂等，但没有特殊的限制。本发明的免疫原性组合物可以用于治疗和预防与⑶H3，EPHA4, ECT2, HIG2,INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK和/或URLClO的过表达相关的疾病，例如癌症。预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宮内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。包含一种或多种本发明的肽作为活性成分的用于治疗和/或预防与⑶H3，EPHA4,ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK和/或URLClO的过表达相关的疾病(例如癌症)的免疫原性组合物，还可以进ー步包含佐剂，以便有效地建立细胞免疫。或者，它们可以和其它活性成分例如抗癌剂一起施用。预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宮内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。合适的制剂包括颗粒(granules)。合适的佐剂在文献中有介绍(Johnson AG. (1994) Clin. Microbiol. Rev. , 7:277-89.) 佐剂实例包括，但不限干，磷酸铝、氢氧化铝和明矾。而且，可以方便地使用脂质体制剂、药物结合于数mcm直径球珠的颗粒制剂、和脂质与肽结合的制剂。施用的方法可以是ロ服、皮内、皮下、静脉内注射等，并可以包括系统施用或针对靶肿瘤附近的局部施用。本发明肽的剂量可以根据所治疗的疾病、患者的年龄、体重、施用方法等进行合适的调节。尽管剂量一般为0. OOlmg-IOOOmg,优选地0. Olmg-IOOmg,更优选地0. Img-IOmg,优选地从数天到数月施用一次，本领域的技术人员可以容易地选择合适的剂量和施用方法，这些參数的选择和优化完全在本领域的常规技术范围之内。本发明进一歩提供了称作外来体(exosomes)的细胞外囊泡，其在表面上呈递由本发明肽和HLA抗原之间形成的复合体。外来体可以通过使用，例如，在已公开的国际申请日文翻译特表平11-510507号和特表2000-512161中详细介绍的方法来制备，更优选地，用从治疗和/或预防所针对的受试者获得的抗原呈递细胞来制备。与本发明的肽相似，本发明的外来体可以作为癌症疫苗进行预防注射。所用HLA抗原的类型必须与需要治疗和/或预防的受试者的类型相匹配。例如，在日本人群中，HLA-A24或HLA-A2，特别是HLA-A2402或HLA-A0201，经常是合适的。在一些实施方案中，本发明的药剂包括可初始化(prime)细胞毒T淋巴细胞的成分。脂质已被确认为是能够在体内针对病毒抗原初始化CTL的作用剂。例如，可以将棕榈酸残基附接到赖氨酸残基的ε-和α-氨基，然后连接到本发明的免疫原性肽上。然后可以将脂质化的肽或是直接在胶束或颗粒中施用，或者掺入到脂质体中施用，或者在佐剂中乳化后施用。作为CTL应答的脂质初始化的另ー个实例，大肠杆菌脂蛋白，例如三棕榈酰-S-甘 油酰半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)，在共价附接到合适的肽后，可以用来初始化CTL (见例如 Deres et al. , Nature 342:561,1989)。本发明的免疫原性组合物还可以包括编码本文公开的ー种或多种免疫原性肽的核酸。见例如 Wolff JA et al. , (1990) Science 247:1465-8;美国专利 Nos. 5，580，859; 5，589，466; 5，804，566; 5，739，118; 5，736，524; 5，679，647;和 W098/04720。基于 DNA的输送技术的实例包括“裸DNA”,辅助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介导)输送，阳离子脂质体复合体，和颗粒介导的(基因枪)或压カ介导的输送(见例如美国专利No. 5，922，687)。本发明的肽还可以用病毒或细菌载体表达。合适的表达载体的实例包括减毒的病毒宿主，例如痘苗(vaccinia)或禽痘(fowlpox)。这种方法涉及使用例如痘苗病毒作为载体来表达编码该肽的核苷酸序列。一旦引入到宿主内，重组的痘苗病毒表达免疫原性肽，借此引发免疫应答。在免疫方案中有用的痘苗载体和方法在下列文献中有介绍，例如美国专利4，722，848。另一种载体是BCG(卡介苗)。BCG载体在Stover et al. , Nature351:456-60, 1991中有介绍。很多其他的可用于治疗性给药或免疫的载体，例如腺病毒和腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、脱毒的炭疽毒素载体等，是本领域中已知的。见例如 Shata et al. , Mol Med Today 6:66-71，2000; Shedlocket al. J Leukoc Biol 68:793-806，2000;Hipp et al. , In Vivo 14:571-85,2000。本发明还提供了使用一种或多种本发明的肽诱导抗原呈递细胞的方法。抗原呈递细胞的诱导可以通过下述方式实现从外周血单核细胞诱导树突细胞，然后在体外、离体或体内使本发明的ー种或多种肽接触(刺激)它们。当向受试者施用本发明的肽时，在受试者体内诱导出固定有本发明肽的抗原呈递细胞。或者，可以在将本发明的肽固定到抗原呈递细胞之后，将细胞作为疫苗施用给受试者。例如，离体施用可以包括如下步骤a :从受试者收集抗原呈递细胞，和b :使步骤a的抗原呈递细胞与本发明的肽接触。或者，根据本发明，提供了本发明的肽在制造可诱导抗原呈递细胞的药物组合物中的应用。进ー步，本发明还提供了用于诱导抗原呈递细胞的本发明的肽。通过步骤b获得的抗原呈递细胞可以作为疫苗施用给受试者。本发明还提供了用于诱导具有高水平的细胞毒T细胞诱导能力的抗原呈递细胞的方法，其中该方法包括在体外向抗原呈递细胞转化基因的步骤，该基因包括编码本发明一种或多种肽的多核苷酸。所引入的基因可以是DNA或RNA的形式。关于引入的方法，没有特殊的限制，可以恰当地使用本领域通常进行的各种方法，例如脂质体转染、电穿孔和磷酸钙方法。更具体地，转染可以按照下列文献中的描述来实施Reeves ME, et al.，(1996)Cancer Res.，56:5672-7. ;Butterfield LH, et al.，(1998)J.Immunol.，161:5607-13.
;Boczkowski D, et al. , (1996) J. Exp. Med. , 184:465-72.;已公开国际申请的日文翻译No. 2000-509281。通过将基因转化到抗原呈递细胞，基因在细胞内经历转录、翻译等，然后所得的蛋白质被MHC-I或-II类加工，并通过呈递途径呈递部分肽。本发明进一歩提供了使用本发明的ー种或多种肽来诱导CTL的方法。当向受试者施用本发明的肽时，在受试者体内诱导出CTL，藉此提高免疫系统靶定肿瘤组织中表达CDH3，EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK 和/或 URLClO 的细胞(例如癌细胞)的强度。预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宮内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。或者，本发明的肽可以用于离体治疗方法的语境中，其中在体外使本发明的ー种或多种肽接触(刺激)从受试者来源的抗原呈递细胞和CD8阳性细胞或外周血单核白细胞，诱导CTL之后，将细胞返回到受试者体内。例如，该方法可以包括如下步骤a :从受试者收集抗原呈递细胞，b :使步骤a的抗原呈递细胞与本发明的肽接触，c :将步骤b的抗原呈递细胞与CD8+T细胞混合并共培养，从而诱导细胞毒T细胞；和d :从步骤c的共培养物中收集OT8+T细胞。或者，根据本发明，提供了本发明的肽在制造可诱导CTL的药物组合物中的应用。进ー步，本发明还提供了用于诱导CTL的本发明的肽。通过步骤d获得的具有细胞毒活性的CD8+T细胞可以作为疫苗施用给受试者。本发明进一歩提供了用本发明的肽诱导的分离的细胞毒T细胞。通过用呈递有ー种或多种本发明的肽的抗原呈递细胞进行刺激而诱导出的细胞毒T细胞优选地来源于作为治疗和/或预防对象的受试者，这些细胞毒T细胞能够单独地施用，或与其它药物，包括本发明的一种或多种肽或具有抗肿瘤活性的外来体，组合施用。所得的细胞毒T细胞特异针对呈递有本发明肽，或者优选地，呈递有与用于诱导的肽相同的肽，的靶细胞发挥作用。靶细胞可以是内源表达 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK 和/或 URLClO的细胞，或者是被 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 和/或 URLClO 基因转染的细胞。由于受本发明的肽的刺激而在细胞表面上呈递这些肽的细胞也可以成为攻击的靶标。本发明还提供了可呈递由HLA抗原和本发明ー种或多种肽之间形成的复合物的抗原呈递细胞。该抗原呈递细胞通过与本发明的肽或编码这些肽的核苷酸接触而获得，其优选地来源于治疗和/或预防所针对的受试者，并能够作为疫苗单独地施用或与其它药物包括本发明的肽、外来体或细胞毒T细胞组合施用。本发明还提供了包含编码能够形成T细胞受体(TCR)的亚单位的多肽的核酸的组合物，并提供了其使用方法。TCR亚单位具有形成TCR的能力，所述TCR为T细胞提供针对呈递 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 或 URLClO 的肿瘤细胞的特异性。通过使用本领域已知的方法，可以鉴定被一种或多种本发明的肽诱导的CTL的TCR亚单位的 α-和 β-链核酸(W02007/032255 和 Morgan et al.、J Immunol、171、3288 (2003))。衍生的 TCR 优选地结合以高亲合力展示 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK或URLClO的靶细胞，且任选地在体内或体外介导对呈递⑶H3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB,KIF20A、KNTC2、TTK或URLClO肽的靶细胞的有效杀伤。编码TCR亚单位的核酸可以被整合到合适的载体内，例如逆转录病毒载体。这些 载体是本领域众所周知的。核酸或含有它们的载体可以被有用地转染进T细胞，该T细胞优选地来自患者。有利地，本发明提供了制成的(off-the-shelf)组合物，其允许对患者自身的T细胞(或者其它哺乳动物的T细胞)进行快速的修饰，从而快速而容易地产生具有优异的癌细胞杀伤性质的修饰T细胞。另外，本发明提供了这样的CTL，它们是通过用编码TCR亚单位多肽的核酸进行转导而制备的，所述TCR亚单位多肽可以在HLA-A24或HLA-A2的背景下结合⑶H3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 或 URLClO 肽，例如 SEQ ID NO: 19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272或288。转染的CTL能够在体内归巢到(homing to)癌细胞，并能通过众所周知的体外培养方法(例如，Kawakami et al. , J Immunol.，142，3452-3461 (1989))进行扩增。本发明的T细胞可用于形成免疫组合物，用于治疗或预防需要治疗或保护的受试者体内的癌症(W02006/031221)。在本发明的语境中，术语“疫苗”(也称作免疫原性组合物)是指在接种到动物体内时可诱导抗肿瘤免疫或抑制癌症的物质。根据本发明，具有SEQ IDNO: 19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、80、100、101、110、111、387、112、394、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217或223氨基酸序列多肽被提议是HLA-A24限制性表位肽，而具有 SEQ ID N0:376、379、114、116、117、121、227、228、233、254、271、272 或 288的氨基酸序列的多肽被提议是HLA-A2限制性表位肽，其可以诱导针对表达CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK 和 / 或 URLC10 的细胞，例如表达 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLC10的癌细胞，的强而特异的免疫响应。预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宫内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。因此，本发明还包括用具有SEQ ID NO: 19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272 或 288 的氨
基酸序列的多肽或其变体(即包含I个、2个或数个(例如最多5个)氨基酸替换、删除或添加)诱导抗肿瘤免疫的方法。一般地，抗肿瘤免疫包括如下的免疫响应-针对含有表达CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK 和 / 或 URLClO的细胞的肿瘤的细胞毒淋巴细胞的诱导，-可识别含有表达CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK 和 / 或URLClO的细胞的肿瘤的抗体的诱导，和-抗肿瘤细胞因子的产生的诱导。 因此，当某种肽在接种到动物体内时可诱导这些免疫响应中的任何一种时，则可以确定该肽具有诱导抗肿瘤免疫的效果。肽的抗肿瘤免疫诱导作用可以通过在体内或体外观察宿主免疫系统针对该肽的响应来检测。例如，用于检测细胞毒T淋巴细胞的诱导的方法是众所周知的。进入活体的外来物质通过抗原呈递细胞(APC)的作用被呈递给T细胞和B细胞。由于受抗原的刺激，以抗原特异性的方式响应由APC呈递的抗原的T细胞分化成细胞毒T细胞(也称作细胞毒T淋巴细胞或CTL)，然后增殖；这个过程在本文中称作T细胞的“激活”。因此，由特定的肽所致的CTL诱导作用可以通过由APC向T细胞呈递该肽然后检测CTL的诱导来加以评估。而且，APC具有激活CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和NK细胞的作用。因为⑶4+T细胞在抗肿瘤免疫中也是重要的，所以肽的抗肿瘤免疫诱导作用可以用这些细胞的激活效应作为指标来进行评估。使用树突细胞(DC)作为APC用于评估CTL诱导作用的方法是本领域众所周知的。DC是一种代表性的APC，在APC中具有最强的CTL诱导作用。在本方法中，最初使测试多肽与DC接触，然后使该DC与T细胞接触。在与DC接触之后，如果检测到具有针对目标细胞的细胞毒作用的T细胞，则显示测试多肽具有诱导细胞毒T细胞的活性。CTL针对肿瘤的活性可以用例如51Cr标记的肿瘤细胞的裂解作为指标进行检测。或者，众所周知可以使用3H-胸苷摄取活性或LDH (乳糖脱氢酶)释放作为指标来评估肿瘤细胞破坏的程度。而且，还可以通过测量在携带有固定化肽的抗原呈递细胞的存在下由CTL产生和释放的IFN-ga_a来进行检查，其中利用抗IFN-ga_a抗体使IFN_ga_a可视化,例如ELISP0T测定。除了 DC，还可以使用外周血单核细胞(PBMC)作为APC。已有报道，通过在GM-CSF和IL-4的存在下培养PBMC可以提高CTL的诱导。类似地，已显示通过在钥孔戚血蓝蛋白(KLH)和IL-7的存在下培养PBMC可以诱导CTL。通过这些方法确认具有CTL诱导活性的测试多肽是具有DC激活效应和随后的CTL诱导活性的多肽。因此,可诱导针对表达CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLClO的细胞的CTL的多肽可以用作针对与CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB,KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLClO相关的疾病(例如癌症)的疫苗。而且，通过与所述多肽接触而获得了诱导针对 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK 和 / 或 URLClO的过表达相关的疾病(例如癌症)的CTL的能力的APC，也可用作针对该疾病的疫苗。而且，由于APC呈递多肽抗原而获得了细胞毒性的CTL也可用作针对⑶H3、EPHA4、ECT2、HIG2、1順88、1(正2(^、謂1^2、1'1'1(和/或^1^(10相关疾病(例如癌症)的疫苗。这些利用由APC和 CTL 导致的抗肿瘤免疫来治疗 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 和 /或URLClO相关疾病(例如癌症)的方法被称作细胞免疫治疗。预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宫内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。一般地，当使用多肽进行细胞免疫治疗时，通过组合多种具有不同结构的多肽并使它们与DC接触可以提高诱导CTL的效力。因此，当用蛋白片段刺激DC时，使用多种类型片段的混合物是有利的。多肽对抗肿瘤免疫的诱导可以进一步通过观察针对肿瘤的抗体产生的诱导来加以确认。例如，当在用某种多肽免疫的实验动物体内诱导出针对该多肽的抗体时，并且当肿瘤细胞的生长、增殖和/或转移被那些抗体抑制时，则可以确定该多肽可诱导抗肿瘤免疫。通过施用本发明的疫苗可以诱导抗肿瘤免疫，而抗肿瘤免疫的诱导有为治疗和预防与 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 和 / 或 URLClO 过表达相关的疾病，例如癌症提供了可能。针对与 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 和/或URLClO的过表达相关的疾病(例如癌症)的治疗或者其发生的预防可以包括抑制表达 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 和 / 或 URLClO 的细胞(例如癌细 胞)的生长，使这些细胞退化(involution),和抑制这些细胞(例如癌细胞)的出现,在疾病(例如癌症)的治疗或预防还包括降低患有CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLClO相关疾病(例如癌症)的个体的死亡率，减少血液中的疾病标志，减轻与该疾病相伴的可检测症状等。这些治疗和预防效果优选地是统计学显著的，例如以5%或更低的显著水平观察，其中将疫苗针对与CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLClO相关的疾病(例如癌症)的治疗或预防效果与没有疫苗施用的对照进行比较。例如，可以使用Student’ s t_检验、Mann-Whitney U-检验或ANOVA来确定统计学显著性。由于本发明提供了用于治疗或预防与CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLClO的过表达相关的疾病(例如癌症)的方法，可以向患有疾病或具有发生该疾病的危险(或者易于发生疾病)的受试者预防性或治疗性地施用治疗化合物或组合物。这些受试者可以用标准的临床方法加以鉴定。在本发明的语境中，预防性施用发生在表现出明显的疾病症状之前，从而使疾病或疾患被防止，或者其进程被延迟。在医学领域中，术语“预防”包括任何可减轻由疾病造成的死亡率或发病率负荷的活动。预防可以在一级、二级和三级预防水平上发生。一级预防可以避免疾病的发展，而二级和三级水平的预防包括旨在防止疾病发展和症状出现、以及通过恢复功能和减少疾病相关并发症来减轻已经确立的疾病的负面影响的活动。在癌症治疗中，术语“有效的”是指治疗可以导致受试者体内癌症的大小(size)、广泛性(prevalence)或转移潜力降低。当预防性地进行处理时，“有效”的意思是该处理可延缓或防止癌症的出现或者减轻癌症的临床症状。癌症的评价可以用标准临床规程进行。而且，可以结合任何用于诊断或治疗癌症的已知方法来确定治疗的有效性。例如，可以通过组织病理学诊断或者通过鉴定症状上的异常(symptomatic anomalies)来诊断癌症。上述具有免疫活性的肽或者编码这样的肽的多核苷酸或载体可以和佐剂组合。佐剂是指在与具有免疫活性的肽一起(或者顺次)施用时能够提高针对该肽的免疫响应的化合物。合适的佐剂的实例包括霍乱毒素、沙门氏菌毒素、明矾等，但并不仅限于此。而且，本发明的疫苗可以适当地与药学可接受的载体组合。这些载体的实例有灭菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养液等。而且，疫苗可以根据需要含有稳定剂、悬浮剂、防腐剂、表面活性剂等。疫苗可以系统或局部给药。疫苗施用可以是单次施用或者通过多次施用进行加强。在使用APC或CTL作为本发明的疫苗时，可以通过例如离体方法治疗或预防与CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK 和 / 或 URLClO 的过表达相关的疾病(例如癌症)。更具体地，收集接受治疗或预防的受试者的PBMC，在离体条件下使之与本发明的肽接触。在APC或CTL诱导之后，可以将细胞施用给受试者。APC还可以通过离体地将编码该肽的载体引入到PBMC中进行诱导。体内诱导的APC或CTL可以在施用之前被克隆。通过克隆和培养具有高靶细胞损伤活性的细胞，可以更有效地进行细胞免疫治疗。而且，以这种方式分离的APC和CTL不仅可以用于针对细胞所来源的个体进行细胞免疫治疗，还可以针对其它个体中相似类型的疾病进行细胞免疫治疗。下列实施例描述了本发明的各个方面。提供这些实施例仅仅是为了举例说明本发明并帮助普通技术人员制作和使用它们。这些实施例不以任何方式对本发明的范围构成限 制。尽管在实践或测试本发明时可以使用与本文所介绍的相似或等价的方法和材料，但是下文介绍了合适的方法和材料。
实施例下文中，通过下面的实施例对本发明进行举例说明，但本发明不受这些实施例的限制。然而，这里描述的材料和方法等仅仅是用来例证本发明的不同方面，并不意图以任何方式对本发明的范围构成限制。因此，在实践或测试本发明时可以使用与本文描述的相似或等价的材料、方法等。材料和方法细胞系A24-LCL细胞(HLA-A24)，人B成淋巴细胞系是通过用Epstain_bar病毒转化建立的。T2 细胞，C0S7, A498, Caki-2 和 HEK 293 从 ATCC 购得。Caki-I 和 MIAPaca-2 购于 JCRB。PK-45P, PK-59, TE-5 和 TE-6 购于 TKG。293T 购于 GenHunter。CDH3, EPHA4, ECT2, HIG2, INHBB, KIF20A, KNTC2, TTK 和 URLClO 衍牛肽的候诜物筛选使用结合预测软件〃BIMAS〃 (http://bimas. dcrt. nih. gov/cgi_bin/molbio/ken_parker_comboform)(Parker KC, et al., (1994)J Immunol. ;152 (I):163-75. ;KuzushimaK, et al. , (2001) Blood. ; 98 (6) : 1872-81.)预测了衍生自 CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK 或 URLClO 的可结合 HLA_A*2402 或 HLA_A*0201 分子的 9 聚体和 10 聚体肽。这些肽由Sigma(日本札幌)根据标准固相合成方法合成，并用反相HPLC纯化。肽的纯度(>90%)和身份分别用分析HPLC和质谱分析确定。肽溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，浓度为20mg/ml，并存储于-80摄氏度。体外CTL诱导使用单核细胞衍生的树突细胞(DC)作为抗原呈递细胞(APC)，诱导针对被呈递在HLA上的肽的CTL响应。DC是根据别处介绍的方法(Nukaya I et al.，(1999) Int.J. Cancer 80, 92-7. , Tsai V et al. , (1997) J. Immunol 158:1796-802.)在体外产生的。简而言之，将外周血单个核细胞(PBMC)[它们是使用Fic0Il-Paque(Pharmacia)溶液从正常志愿者(HLA-A*2402和/或HLA-A*0201)分离的]通过附着到塑料组织培养瓶(BectonDickinson)进行分离，从而富集单核细胞组分。将富集了单核细胞的群体在含有2%热失活自体同源血清(AS)的 AIM-V(Invitrogen)中、在 1000U/ml GM-CSF(Genzyme)和 IOOOU/ml IL-4 (Genzyme)的存在下进行培养。培养7天后,在3 μ g/ml的β2_微球蛋白的存在下，用20 μ g/ml本发明的合成肽在20°C的AM-V中对这些细胞因子产生的DC冲击4个小时。然后用MMCGOyg/mldOmin)使这些经肽冲击的DC失活，并将它们以1:20的比例与自体同源CD8+T细胞混合，其中自体同源CD8+T细胞是通过用Dynabeads M-450CD8 (Dynal)和DETACHa BEAD (D ynal)进行阳性筛选获得的。将这些培养物置于在48孔板(Corning)中；每个孔含有I. 5xl04个经过肽冲击的DC，3xl05CD8+个T细胞和10ng/mlIL_7 (Genzyme)，溶于O. 5ml AIM-V/2%AS中。3天后，向这些培养物补充IL_2 (CHIRON)至终浓度为20IU/ml。在第7天和第14天，用经过自体同源肽冲击的DC再次刺激T细胞。每次通过与上述相同的方法制备DC。在第21天，经过第3轮的肽刺激后，针对经肽冲击的A24-LCL细胞或T2细胞检验CTL。CTL扩增稈序使用与RiddellSR等所介绍的相似方法(Walter EA et al. , (1995)N Engl J Med333:1038-44. ; Riddel SR, et al. , (1996) Nature Med. 2:216-23.)在培养物中扩增 CTL。在40ng/ml抗-0)3单克隆抗体(Pharmingen)的存在下,将总共5xl04个CTL与已利用MMC使之失活的两种人B成淋巴细胞系一起重新悬浮在25mlAM-V/5%AS中。开始培养I天之后，向培养物添加120IU/mlIL-2。在第5、8和11天，向培养物添加含有30IU/ml IL-2的新鲜AIM-V/5%ASoCTL克降的津立在96孔圆底微滴定板(Nalge Nunc International)上进行稀释,使每孔含有O. 3个、I个、和3个CTL。在总共150 μ I/孔的含有5%AS的AIM-V中，将CTL与7xl04个细胞/孔的两种人B成淋巴细胞系、30ng/ml的抗-⑶3抗体和125U/ml的IL-2共培养。10天后，向培养基添加50微升/孔的IL-2，使IL-2的终浓度为125U/ml。在第14天，对CTL的CTL活性进行检验，用和上述相同的方法进行CTL克隆的扩增。特异CTL活件为了检验特异CTL 活性，进行了 IFN-gamma ELI SPOT 测定和 IFN-gamma ELISA 测定。简而言之，制备了经肽冲击的A24-LCL或T2细胞(IxlO4个/孔)作为刺激细胞。将在48孔板中培养后的细胞或经过有限稀释后的CTL克隆作为响应细胞。IFN-gamma ELI SPOT测定和ELISA测定按照制造商的程序进行。强制表汰靶基因和HLA-A02或HLA-A24中之一或二者的细胞的津立通过PCR扩增编码靶基因或HLA-A02或HLA-A24的开放阅读框的cDNA。将该PCR扩增产物克隆到 pcDNA3. Imyc-His 载体(Invitrogen)中。用 LlPOFECTAMINE(Invitrogen)根据制造商推荐的程序将这些质粒转染进入没有靶基因、HLA-A02和HLA-A24的正常人细胞系C0S7或293T中。或者，利用GenePulserII (Biorad)通过电穿孔将含有靶基因的质粒转染进入A24-LCL中。简而言之，在140V和1000 μ F下，用IOmcg质粒冲击2. 5χ106个A24-LCL细胞。转染2天后，用细胞裂解液处理被转染的细胞，并用作CTL活性测定的靶细胞。细胞毒测定通过4小时51Cr释放测定评估细胞毒活性。用浓度为20 μ g/mL的肽过夜冲击靶细胞。在37°C用100 μ Ci的Na251CrO4标记靶细胞I小时，然后用RPMI1640冲洗3次。将靶细胞(IxlO4个/100 μ L)和100 μ L的不同数目的效应细胞置于圆底96孔微滴定板(Corning)中，总体积为200 μ L，在37°C CO2培养箱中培养4小时。培养后，从每孔收集100微升上清，用gamma计数器测量放射性。自发释放是指在没有效应细胞时培养基中的靶细胞的放射性，最大释放是用IM HCl处理情况下的靶细胞的放射性。百分比特异放射性是根据如下的公式计算确定的
%特异性溶解=[(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)]xl00。结果癌症中被提高的CDH3, EPHA4. ECT2. HIG2. INHBB. KIF20A. KNTC2. TTK 和 URLClO 的用cDNA-微阵列从各种癌症中获得的全基因表达谱数据显示，如下基因的表达被提闻。CDH3 (GenBank 登录号 NM_001793; SEQ ID Nos. I, 2)，EPHA4 (GenBank 登录号 L36645; SEQ ID Nos. 3，4)，ECT2 (GenBank 登录号 AY376439; SEQ ID Nos. 5，6)，HIG2 (GenBank 登录号 NM_013332; SEQ ID Nos. 7,8)，INHBB (GenBank 登录号 NM_002193; SEQ ID Nos. 9，10)，KIF20A (GenBank 登录号 NM_005733; SEQ ID Nos. 11,12)，KNTC2 (GenBank 登录号 AF017790; SEQ ID Nos. 13，14)，TTK (GenBank 登录号 NM_003318; SEQ ID Nos. 15，16)和URLClO (GenBank 登录号 NM_017527; SEQ ID Nos. 17，18)与相应的正常组织相比，⑶H3的表达在如下的癌症中确实被提高。34例膀胱癌中的26例，19例宫颈癌中的17例，19例胆管细胞癌中的19例，34例结直肠癌中的30例，21例子宫内膜异位中的20例，20例胃癌中的13例，8例弥散型胃癌中的7例，37 例 NSCLC 中的 36 例，16例胰腺癌中的16例，21例软组织肿瘤中的21例，和10例睾丸肿瘤中的10例。与相应的正常组织相比，EPHA4的表达在如下的癌症中确实被提高。34例膀胱癌中的14例，14例宫颈癌中的8例，
25例胆管细胞癌中的10例、15例子宫内膜异位中的5例，8例弥散型胃癌中的5例，5例卵巢癌中的5例，
14例胰腺癌中的14例，51例前列腺癌中的20例，和23例软组织肿瘤中的14例。与相应的正常组织相比，ECT2的表达在如下的癌症中确实被提高。19例膀胱癌中的17例，21例乳腺癌中的5例，14例宫颈癌中的14例，13例胆管细胞癌中的13例，5例CML中的5例，8例结直肠癌中的7例，16例食道癌中的12例，16 例 NSCLC 中的 6 例，IO例淋巴瘤中的8例，I例胰腺癌中的I例，13例前列腺癌中的IO例，6例肾癌中的3例，和13例SCLC癌肿的12例。与相应的正常组织相比，HIG2的表达在20例肾癌中的19例，和9例软组织肿瘤中的7例中确实被提高。与相应的正常组织相比，INHBB的表达在如下癌症中确实被提高。21例胆管细胞癌中的10例，12例食道癌中的12例，13 例 NSCLC 中的 10 例，24例肾癌中的22例，14例SCLC癌肿的8例，和49例软组织肿瘤中的45例。与相应的正常组织相比，KIF20A的表达在如下癌症中确实被提高。31例膀胱癌中的31例，61例乳腺癌中的38例，11例胆管细胞癌中的10例，19例食道癌中的7例，22 例 NSCLC 中的 21 例，6例卵巢癌中的6例，36例前列腺癌中的17例，11例肾癌中的6例，和
15 例 SCLC 中的 15 例。与相应的正常组织相比，KNTC2的表达在如下癌症中确实被提高。32例膀胱癌中的30例，56例乳腺癌中的47例，10例宫颈癌中的10例，22例胆管细胞癌中的16例，37 例 CML 中的 17 例，10例结直肠癌中的3例， 46例食道癌中的11例，19 例 NSCLC 中的 15 例，8例淋巴瘤中的7例，24例骨肉瘤中的20例，5例卵巢癌中的3例，2例胰腺癌中的2例，37例前列腺癌中的15例，19例肾癌中的14例，15例SCLC中的15例，和59例软组织肿瘤中的40例。与相应的正常组织相比，TTK的表达在如下癌症中确实被提高。27例膀胱癌中的27例，30例乳腺癌中的25例，16例宫颈癌中的15例，10例胆管细胞癌中的10例，7例CML中的5例，10例结直肠癌中的6例，44例食道癌中的24例，15例肝癌中的8例，12 例 NSCLC 中的 12 例，6例淋巴瘤中的6例，16例骨肉瘤中的13例，17例前列腺癌中的12例，15例SCLC中的15例，和33例软组织肿瘤中的16例。与相应的正常组织相比，URLClO的表达在如下癌症中确实被提高。29例膀胱癌中的29例，16例宫颈癌中的15例，7例胆管细胞癌中的7例，19例食道癌中的7例，3例胃癌中的3例，
27 例 NSCLC 中的 24 例，19例骨肉瘤中的15例，5例胰腺癌中的4例，43例软组织肿瘤中的33例。
[表I]与相应的正常组织相比，在癌组织中观察到的CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、
INHBB, KIF20A、KNTC2、TTK或URLClO被上调的病例的比率
_ CDH3 EPHA4 ECT2 HIG2 INHBB
膀貌癌~~2&34 14/34 117/19 丨 -■
乳腺癌:— -—5/12 - ~ -
￥1 癌 ... ................................~7/19 8/14 14/14 --
胆管细胞癌.........19/19—'—"mi25~ 13/13 — - 10/21"
CML- 5/5 <*-
Ikimi——— ~1θ/34~ ' - .................7/8 -—
子宫内暖异位..................20/21 5/15 ~~ --
食道癌........~~-~ - 12/16.......................-..........~~........12/12
W#. . ~ 13/20 - -—. ......-...............-—弥散在!宵癌_____________7/8__________________________.................- ___________________-__________一
H'f"丽—■.垂—
非小细胸■肺癌..........................................................................................36/3~ ——■-............................6/16.........................-..........................10/13
..................— - ...... -.......~......8/1:0........ - .........................-................
骨肉瘤__-__-__--__-
#l-#s....................................— - 5/5 -................ -
~ Μβ~......14/14............ 1/1 - ~ -
前列線癌.-__________ 20/51____________'10/13 - —_________________________________-_______________________
肾癌 _.......................-____~ ____________________-______________________________ 3/6 19/20—______________22/24_____
胞肺癌......................................................................—-- 12/13 - 8/14
HIr 肿瘤..........................................................~τ ηΓ 14/23 -..................7/9— 4 獅
睾丸 Bt 瘤__10/10 -__-__-__-
KIF20A K3yrC2 TTK URLC1Q
Il貌癌 ..............................________31/3Γ]—30/32 127/271 29/2F"
Illii................................................................................................................................................Μ6Γ 47/56 25B0 .................-...........—
宫賴癌'- IWlF'15/16—15/16—'
胆管 _胞H—10/11 "" 16/22 ~10/ 0 ^^/7^
Q-1L·-.一- 17/37 5/7 -—
直肠癌 ......................................................:——3/10 6/10 -—
子宫内1 异位-__-__--
jrit#—— ........ ~7/19 11/46— 24/44^—...7/19~
胃癌__；____-__3/3
弥散4!胃癌---
—―奸癌........................................... — - ~-~ 8/15 一…-
~非小細胸肺癌 .............................21/22— ~ 57 9" 12/12 ~24/27
淋巴癌I 7/8 6/6 -
骨肉瘤 ........................................................................................................................................................-20/24 13/16 15/19~
薇癌署·__3/5__二__"
ft腺癌6/6—_——.瓦―4/5 哪
IF列線癌15/37____________12/17_________________________________^______~—
肾 M6/11 14/19__--
小细fe難癌^ ^isns ——ImT isns —-
软组织胂瘤__- 40/59 16/33 33/43
睾九肿瘤__:__二__-__~
衍牛自CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK 或 URLClO 的 HLA-A24或HLA-A2结合肽的预测表2按照结合亲和性顺序给出了⑶H3的HLA_A*2402结合肽。表2A给出了衍生自⑶H3的9聚体，表2B给出了衍生自⑶H3的10聚体。表3按照结合亲和性顺序给出了 EPHA4的HLA_A*2402结合肽和HLA_A*0201结合肽。表3A给出了衍生自EPHA4的9聚体的HLA_A*2402结合肽，表3B显示了衍生自EPHA4的10聚体的HLA-A*2402结合肽。表3C显示了衍生自EPHA4的9聚体的HLA_A*0201结合肽。表4按照结合亲和性顺序给出了 ECT2的HLA_A*2402结合肽。表4A给出了衍生自ECT2的9聚体肽，表4B显示了衍生自ECT2的10聚体肽。
表5给出了 HIG2的HLA_A*2402结合肽和HLA_A*0201结合肽。表5A给出了衍生自HIG2的9聚体HLA-A*2402结合肽，表5B给出了衍生自HIG2的10聚体HLA_A*2402结合肽，表5C显示了衍生自HIG2的9聚体HLA-A*0201结合肽，表显示了衍生自HIG2的10聚体HLA-A*0201结合肽。表6给出了 INHBB的HLA_A*2402结合肽和HLA_A*0201结合肽。表6A显示了衍生自INHBB的9聚体HLA-A*2402结合肽，表6B给出了衍生自INHBB的10聚体HLA_A*2402结合肽，表6C显示了衍生自INHBB的9聚体HLA-A*0201结合肽，表6D显示了衍生自INHBB的10聚体HLA-A*0201结合肽。表7按照结合亲和性顺序给出了 KIF20A的HLA_A*2402结合肽。表7A给出了衍生自KIF20A的9聚体肽，表7B显示了衍生自KIF20A的10聚体肽。表8按照结合亲和性顺序给出了 KNTC2的HLA_A*2402结合肽。表8A给出了衍生自KNTC2的9聚体肽，表8B给出了衍生自KNTC2的10聚体肽。表9按照结合亲和性顺序给出了 TTK的HLA_A*0201结合肽。表9A给出了衍生自TTK的9聚体肽，表9B给出了衍生自TTK的10聚体肽。表10按照结合亲和性顺序给出了 URLClO的HLA_A*0201结合肽。表IOA给出了衍生自URLClO的9聚体肽，表IOB给出了衍生自URLClO的10聚体肽。关于表中术语的解释和定义起始位置(Start position),是指从N端起算的氨基酸编号。结合得分(Binding score),来源于“材料和方法”中介绍的〃BIMAS〃。阳性供体数(Positive donor number),是指其Q)8+_T细胞可以通过用抗原呈递细胞的离体刺激被诱导成为特异CTL的供体的数目。这表示为(阳性供体数/全部供体数)。阳性孔数(Positivewell number),是指通过 IFN-gamma ELISP0T 测定可以检测出特异IFN-ga_a产生的孔的数目。从一个供体可以制备4_8个孔。这显示为(阳性孔数/IFN-gamma ELI SPOT测定所检测的孔数)。阳性CTL系，是指从阳性孔建立的CTL系的数目。CTL的产生通过ELISA确定。这显示为(已建立的CTL系数/IFN-gamma ELISP0T测定检测的阳性孔数)。无阳性供体，不是指没有可检测的阳性孔，而是指没有建成的CTL系。表中用粗体字显示的肽具有T细胞刺激活性。
在阳性供体编号、阳性孔编号和阳性CTL系中用表示无数据，意思是出于任何原因导致这些肽不能被合成。[表2A-1]衍生自CDH3的HLA_A*2402结合9聚体肽
权利要求
1.ー种少于大约15个氨基酸的分离的肽，其选自由包含SEQ ID N0:19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、80、100、101、110、111、387、112、394、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217或223的氨基酸序列的肽所组成的群组。
2.ー种具有细胞毒T细胞诱导能力的肽，其中所述肽包含选自SEQ IDN0:19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、80、100、101、110、111、387、112、394、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217或223的氨基酸序列，其中替换、删除或添加了 I个、2个或数个氨基酸。
3.权利要求2的肽，其中自N端起的第二个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸。
4.权利要求2或3的肽，其中C端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。
5.ー种少于大约15个氨基酸的分离的肽，其选自由包含SEQ ID N0:376、379、114、116、117、121、227、228、233、254、271、272或288的氨基酸序列的肽所组成的群组。
6.ー种具有细胞毒T细胞诱导能力的肽，其中所述肽包含选自SEQ IDN0:376、379、114、116、117、121、227、228、233、254、271、272或288的氨基酸序列，其中替换、删除或添加了 I个、2个或数个氨基酸。
7.权利要求6的肽，其中自N端起的第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸。
8.权利要求6或7的肽，其中C端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸。
9.一种用于治疗或预防与SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15和/或17的基因的过表达相关的疾病的药物组合物，所述组合物包含权利要求1-8的一种或多种肽或编码所述肽的多核苷酸。
10.权利要求9的药物组合物，其中与SEQID ΝΟ:1、3、5、7、9、11、13、15和/或17的基因相关的疾病包括癌症。
11.权利要求10的药物组合物，其中所述癌症包括膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宮内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。
12.—种外来体，该外来体在其表面上呈递包含权利要求1-4的肽和HLA抗原的复合体。
13.权利要求12的外来体，其中该HLA抗原是HLA-A24。
14.权利要求13的外来体，其中该HLA抗原是HLA-A2402。
15.—种外来体,该外来体在其表面上呈递包含权利要求5-8的肽和HLA抗原的复合体。
16.权利要求15的外来体，其中该HLA抗原是HLA-A2。
17.权利要求16的外来体，其中该HLA抗原是HLA-A0201。
18.一种诱导具有高的细胞毒T细胞诱导能力的抗原呈递细胞的方法，包括使抗原呈递细胞与权利要求1-8的肽相接触的步骤。
19.通过使T细胞与权利要求1-8的肽接触来诱导细胞毒T细胞的方法。
20.一种诱导具有高的细胞毒T细胞诱导能力的抗原呈递细胞的方法，所述方法包括将包含编码权利要求1-8的肽的多核苷酸的基因转移至抗原呈递细胞的步骤。
21.一种分离的细胞毒T细胞，其通过使T细胞与权利要求1-8的肽接触而被诱导，或者被编码TCR亚单位多肽的核酸转导，其中所述TCR亚单位多肽在HLA-A24或HLA-A2的背景下与权利要求1-8中任ー项的肽结合。
22.ー种抗原呈递细胞，其包含HLA抗原与权利要求1-8的肽之间形成的复合体。
23.通过权利要求18-20的方法诱导的抗原呈递细胞。
24.一种用于抑制表达SEQ ID ΝΟ:1、3、5、7、9、11、13、15和/或17的基因的细胞的增殖的疫苗，其中该疫苗包含权利要求1-8的肽作为活性成分。
25.权利要求24的疫苗，其中表达SEQID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15和/或17的基因的细胞包括癌症。
26.权利要求25的疫苗，其中所述癌症包括膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宮内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。
27.权利要求26的疫苗，其被配制用于施用给HLA抗原为HLA-A24或HLA-A2的受试者。
28.一种治疗或预防受试者中与SEQ ID ΝΟ:1、3、5、7、9、11、13、15和/或17的基因的过表达相关疾病的方法，包括向所述受试者施用疫苗，该疫苗包含权利要求1-8的肽、其免疫学活性片段、或编码所述肽或免疫学活性片段的多核苷酸。
29.权利要求28的方法，其中与SEQID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15和/或17的基因的过表达相关的疾病包括癌症。
30.权利要求29的用于治疗或预防癌症的方法，其中癌细胞包括膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宮内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。
31.一种用于筛选有I个、2个或数个氨基酸被替换的肽的方法，其中所述肽包括选自SEQ ID N0:19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、80、100、101、110、lll、387、112、394、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217 或 223 的氨基酸序列，所述方法包括如下步骤 (a)确认对于I个、2个或数个氨基酸的替换物的整个序列没有显著的序列同源性； (b)測量候选替换物肽的CTL诱导能力；和 (c)选择CTL诱导能力等于或高于原始肽的肽。
全文摘要
本发明涉及用于表达肿瘤相关抗原的癌症的肽疫苗。本发明提供具有如SEQ ID NO:19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272或288所示的氨基酸序列的肽，以及具有上述氨基酸序列并且其中替换、删除或添加了1个、2个或多个(例如最多5个)氨基酸的肽，这些肽具有细胞毒T细胞诱导能力。本发明还提供了用于治疗或预防与CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLC10的过表达相关的疾病(例如癌症)的药物，其含有一种或多种这样的肽作为活性成分。本发明的肽还可以用作疫苗。
文档编号C12N5/10GK102863514SQ20121035262
公开日2013年1月9日 申请日期2008年2月21日 优先权日2007年2月21日
发明者角田卓也, 大泽龙司 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司