专利名称：使用简并引物检测海水中细菌过氧化氢酶多样性的方法
技术领域：
本发明属于海洋微生物生态学领域，特别是涉及使用简并引物检测海水中细菌过氧化氢酶多样性的方法。
背景技术：
生命活动中，特别是有氧代谢过程中会产生过氧化氢。过氧化氢是ー种活性氧，氧化性强，危害性大。过氧化氢酶能迅速分解过氧化氢，保护生物分子免受氧化损伤；过氧化氢酶是嗜氧微生物生命活动中一直保持活性的重要持家蛋白。海洋中广泛存在低温环境，低温条件下氧气溶解度増大，氧浓度提高使低温微生物更容易受到活性氧的影响。过氧化氢酶是嗜氧低温生物代谢必需的抗氧化酶。完成基因组测序的海洋低温细菌都有过氧化氢酶基因，如Desulfotalea psychrophila, Colwellia psychrerythraea和Pseudoalteromonas haloplanktis等。过氧化氢酶研究对于认识海洋微生物在低温下有氧代谢活动规律有重要意义。海水表层过氧化氢含量受到太阳紫外线辐射和降水的影响，某些地区表层海水中过氧化氢浓度可达I. 45 μ mol/L。生活在含高过氧化氢的表层海水中的细菌面临氧化胁迫，推测这些细菌只有具备较高活性的过氧化氢酶才能維持代谢活动正常进行。表层海水中的微生物过氧化氢酶分解紫外辐射产生的过氧化氢，这ー过程放热促进海冰融化，具有重要的生态影响。为了深入认识海洋微生物过氧化氢酶的生态作用，有必要建立研究微生物过氧化氢酶多样性的方法。目前可以直接检测海水中过氧化氢酶活性，但直接测活的方法无法研究过氧化氢酶的种类和含量，因此无法获得多祥性的信息；构建宏基因组文库并测序，可以获得环境中过氧化氢酶基因的信息，但价格昂贵耗时太长，因此无相关报道；使用特异的保守引物扩增环境样品DNA中的目的基因，是研究环境基因多祥性的理想方法。目前尚无用于扩增环境中过氧化氢酶基因的保守引物，因此也没有发展出相应的过氧化氢酶多样性检测方法。
发明内容
本发明目的在于克服上述现有技术中存在不足，经发明人长期从事海洋微生物领域的开发研究和生产实践，从而开发提供一种精确、可靠、快速的使用简并引物检测海水中细菌过氧化氢酶多样性的方法，本发明提供的使用简并引物检测海水中细菌过氧化氢酶多样性的方法，包括下述步骤I)、从GenBank搜集各类已知的细菌过氧化氢酶蛋白序列，进行多序列比对后，找出保守的氨基酸序列，由此获得合适的四种简并引物，四种简并引物均根据过氧化氢酶蛋白序列的保守区设计，四种简并引物序列包括两种正向简并引物序列(5’至3’)为C3+:TTTYAAYCGAGARMGRGTNCCNGARMGNG ；
CA:GTACCTGAAMGRGTRGTSCAYGCNMRRGG ；和两种反向简并引物序列(5’至3’)为CB:GAATATGCAAAAAGGCGNCCYTGNARNAKYTTRTC ；C3-:AATCTTTATGAGGCCAAACTTTTGTNANRTCR;2)使用步骤I)中四种简并引物任ー组合，以聚合酶链式反应(以下简称PCR)扩增过氧化氢酶基因片段，PCR扩增使用12. 5微升反应体系所述反应体系为2. 5mM脱氧核糖核苷三磷酸(以下简称dNTP) I微升，IOX水生栖热菌(Taq) DNA聚合酶(以下简称Taq酶)PCR缓冲液I. 25微升，50 μ M的两种简并引物各O. I至O. 2微升，Taq DNA聚合酶O. 5至O. 7U，海水DNA I微升，加水至总体积12. 5微升；制备过氧化氢酶基因片段时每次使用4至8个12. 5微升PCR扩增体系；PCR扩增条件94°C I至2分；94°C 20至40 秒，600C- 51°C 50至80秒，72°C I分30秒，10至15个循环，每循环降低退火温度1°C ；94 °C 20至40秒，50 0C 50至80秒，72°C I分，20循环；72°C 3分。反应后合并各管PCR扩增产物，纯化分子量在500bp至IOOObP的单ー PCR扩增产物；；3)使用T载体试剂盒(宝生物公司产品)连接步骤2)的PCR扩增产物，转化大肠杆菌感受态细胞构建过氧化氢酶的基因片段的T载体文库，蓝白斑筛选；挑取所有菌落扩增，使用相应的过氧化氢酶简并引物进行菌落PCR扩增寻找阳性克隆；琼脂糖凝胶电泳确认目标PCR扩增产物即过氧化氢酶基因片段；4)向步骤3)的所有目的PCR扩增产物中加入限制性核酸内切酶MboI及其缓冲液，酶切后使用琼脂糖凝胶电泳检测所有酶切反应液中的核酸片段，每ー种特异的不重复的电泳条带类型对应着一种过氧化氢酶基因。确定过氧化氢酶基因的种类数以及每种基因的数目；5)对于步骤4)确定的每种过氧化氢酶基因，选择ー个对应的步骤2)中的PCR扩增产物进行DNA测序，获得所有种类的过氧化氢酶基因的序列；这些序列和过氧化氢酶基因种类及数目构成了海水中细菌过氧化氢酶多样性的信息。本发明提供的使用简并引物检测海水中细菌过氧化氢酶多样性的方法中，所述简并引物序列通过以下方式获得从GenBank搜集各类已知的细菌过氧化氢酶的蛋白序列，进行多序列比对后，找出保守的氨基酸序列，由此获得合适的简并引物。扩增过氧化氢酶基因的简并引物，共有四种，其中正向引物和反向引物各两种，正向引物序列(5’至3’ )为C3+:TTTYAAYCGAGARMGRGTNCCNGARMGNG ；CA:GTACCTGAAMGRGTRGTSCAYGCNMRRGG ；反向引物序列(5’至3’)为CB:GAATATGCAAAAAGGCGNCCYTGNARNAKYTTRTC ；C3-: AATCTTTATGAGGCCAAACTTTTGTNANRTCRAA。本发明提供的使用简并引物检测海水中细菌过氧化氢酶多样性的方法中，使用的海水DNA通过以下方式提取采样获得的海水4°C暂存，送回实验室后立即通过8微米滤膜，再通过O. 22微米滤膜，将细菌截留在膜上。将膜剪成小于Imm2的碎片，加入2mL裂解缓冲液(50mmol/L三羟甲基氨基甲烷-20mmol/Lこニ胺四こ酸_400mmol/L氯化钠_750mmol/L鹿糖_2mg/mL溶菌酶),37°C 30min,加入十二烷基硫酸钠(终浓度1%)和蛋白酶K (终浓度100 μ g/mL), 55°C静置2小吋，离心弃去碎膜片，加入等体积苯酹/氯仿/异戍醇混合液(体积比25:24:1)震荡混勻，IOOOOg离心15min,取上清加入等体积氯仿/异戍醇混合液(体积比24:1)震荡混勻，IOOOOg离心15min,取上清加入十分之一体积3mol/Lこ酸钠和等体积异丙醇，-20°C静置I小时或过夜，IOOOOg离心15min弃上清,加入500 μ L 70%こ醇，IOOOOg离心5min弃上清,干燥后加水复溶。本发明提供的使用简并引物的方法的特点该方法精确、可靠、快速，是ー种使用简并引物检测海水中细菌过氧化氢酶多样性的新一代的检测方法。可方便使用检测海水中细菌过氧化氢酶的多祥性。适用于各种海洋环境的海水过氧化氢酶检测，所能检测的最小海水体积为200mL。
图I为四种简并引物扩增海水DNA得到的过氧化氢酶基因片段的琼脂糖凝胶电泳图·M :分子量标准品；1 :CAC3-引物对扩增产物，2: CACB弓I物对扩增产物，3: C3+CB弓I物对扩增产物，4: C3+C3-弓I物对扩增产物
具体实施例方式本发明用下列实施例来进ー步说明本发明，但本发明保护范围并非限于下列实施例。实施例II)、简并引物的确定从GenBank搜集各类已知的细菌过氧化氢酶的蛋白序列，进行多序列比对后，找出保守的氨基酸序列，由此获得合适的PCR扩增过氧化氢酶基因的简并引物，共有四种，正向引物和反向引物各两种，正向引物序列(5’至3’)为C3+:TTTYAAYCGAGARMGRGTNCCNGARMGNG ；CA:GTACCTGAAMGRGTRGTSCAYGCNMRRGG ；反向引物序列(5’至3’)为CB:GAATATGCAAAAAGGCGNCCYTGNARNAKYTTRTC ；C3-:AATCTTTATGAGGCCAAACTTTTGTNANRTCRAA。、2 )使用正向简并引物CA: CCNGARMGNGTNGTNCAYGCN和反向简并引物C3-:AATCTTTATGAGGCCAAACTTTTGTNANRTCRAA,PCR扩增过氧化氢酶基因片段。PCR扩增使用12. 5微升反应体系2. 5mM dNTP I微升，IOXTaq PCR扩增缓冲液I. 25微升，50 μ M的两种简并引物各O. 15微升，Taq DNA聚合酶O. 625U，海水DNA I微升，加水至总体积12. 5微升。制备每种过氧化氢酶基因片段时毎次使用6个12. 5微升PCR扩增体系。PCR条件940C 2min;94°C 30s, 60°C— 51 °C lmin, 72°C Imin 30s, 10 循环，每循环降低退火温度 1°C ；94°C 30s, 50°C lmin, 72°C lmin, 20 循环；72°C 3min。反应后合并 6 管 PCR 产物，使用胶回收试剂盒纯化分子量在500bp至IOOObp的单ー PCR扩增产物。3)、使用T载体试剂盒连接步骤2)的PCR产物，转化大肠杆菌感受态细胞构建过氧化氢酶的基因片段的T载体文库。蓝白斑筛选，挑取所有白色菌落，使用CA和C3-引物进行菌落PCR寻找阳性克隆。琼脂糖凝胶电泳确认目标PCR产物即过氧化氢酶基因片段。
4)、向步骤3)的所有目的PCR产物中加入限制性核酸内切酶MboI及其缓冲液，酶切后使用琼脂糖凝胶电泳检测所有酶切反应液中的核酸片段，每ー种特异的不重复的电泳条带类型对应着一种过氧化氢酶基因。确定过氧化氢酶基因的种类数以及每种基因的数目。5)、对于步骤4)确定的每种过氧化氢酶基因，选择ー个对应的步骤3)中的PCR产物进行DNA测序，获得所有种类的过氧化氢酶基因的序列。这些序列和过氧化氢酶基因种类及数目构成了海水中细菌过氧化氢酶多样性的信息。实施例2I)使用正向简并引物CA: CCNGARMGNGTNGTNCAYGCN和反向简并引物CB:AAATGTTCGGCCYTGNARNADYTTRTC，PCR扩增过氧化氢酶基因片段。PCR使用12. 5微升反应体系2.5mM dNTP I微升，IOXTaq PCR缓冲液I. 25微升，50 μ M的两种简并引物各O. 15微升，Taq DNA聚合酶O. 625U，海水DNA I微升，加水至总体积12. 5微升。制备每种过氧化氢 酶基因片段时每次使用6个12. 5微升PCR体系。PCR条件94°C 2min; 94°C 30s，60°C —51°C Imin, 72°C lmin 30s, 10循环，每循环降低退火温度 1°C ;94°C 30s, 50°C lmin, 72°C lmin, 20循环；72°C 3min。反应后合并6管PCR产物，使用胶回收试剂盒纯化分子量在500bp至IOOObp的单ー PCR产物。2)使用T载体试剂盒连接步骤I)的PCR产物，转化大肠杆菌感受态细胞构建过氧化氢酶的基因片段的T载体文库。蓝白斑筛选，挑取所有白色菌落，使用CA和CB引物进行菌落PCR寻找阳性克隆。琼脂糖凝胶电泳确认目标PCR产物即过氧化氢酶基因片段。3)向步骤2)的所有目的PCR产物中加入限制性核酸内切酶MboI及其缓冲液，酶切后使用琼脂糖凝胶电泳检测所有酶切反应液中的核酸片段，每ー种特异的不重复的电泳条带类型对应着一种过氧化氢酶基因。确定过氧化氢酶基因的种类数以及每种基因的数目。4)对于步骤3)确定的每种过氧化氢酶基因，选择ー个对应的步骤2)中的PCR产物进行DNA测序，获得所有种类的过氧化氢酶基因的序列。这些序列和过氧化氢酶基因种类及数目构成了海水中细菌过氧化氢酶多样性的信息。实施例3I)使用正向简并引物C3+:TTTYAAYCGAGARMGRGTNCCNGA和反向简并引物CB:AAATGTTCGGCCYTGNARNADYTTRTC，扩增过氧化氢酶基因片段。PCR使用12. 5微升反应体系2. 5mM dNTP I微升，IOXTaq PCR缓冲液I. 25微升，50 μ M的两种简并引物各O. 15微升，Taq DNA聚合酶O. 625U，海水DNA I微升，加水至总体积12. 5微升。制备每种过氧化氢酶基因片段时每次使用6个12. 5微升PCR体系。PCR条件94°C 2min; 94°C 30s，60°C —51°C Imin, 72°C lmin 30s, 10循环，每循环降低退火温度 1°C ;94°C 30s, 50°C lmin, 72°C lmin, 20循环；72°C 3min。反应后合并6管PCR产物，使用胶回收试剂盒纯化分子量在500bp至IOOObp的单ー PCR产物。2)使用T载体试剂盒连接步骤I)的PCR产物，转化大肠杆菌感受态细胞构建过氧化氢酶的基因片段的T载体文库。蓝白斑筛选，挑取所有白色菌落，使用C3+和CB引物进行菌落PCR寻找阳性克隆。琼脂糖凝胶电泳确认目标PCR产物即过氧化氢酶基因片段。3)向步骤2)的所有目的PCR产物中加入限制性核酸内切酶MboI及其缓冲液，酶切后使用琼脂糖凝胶电泳检测所有酶切反应液中的核酸片段，每ー种特异的不重复的电泳条带类型对应着一种过氧化氢酶基因。确定过氧化氢酶基因的种类数以及每种基因的数目。4)对于步骤3)确定的每种过氧化氢酶基因，选择ー个对应的步骤2)中的PCR产物进行DNA测序，获得所有种类的过氧化氢酶基因的序列。这些序列和过氧化氢酶基因种类及数目构成了海水中细菌过氧化氢酶多样性的信息。实施例4I)使用正向简并引物C3+: TTTYAAYCGAGARMGRGTNCCNGA和反向简并引物C3-: AATCTTTATGAGGCCAAACTTTTGTNANRTCRAA，扩增过氧化氢酶基因片段。PCR使用12. 5微升反应体系2. 5mM dNTP I微升，10 X TaqPCR缓冲液I. 25微升，50 μ M的两种简并引物各O. 15微升，Taq DNA聚合酶O. 625U，海水DNA I微升，加水至总体积12. 5微升。制备每种过氧化氢酶基因片段时每次使用6个12. 5微升PCR体系。PCR条件94°C 2min;94°C 30s, 60°C — 51°C Imin, 72°C lmin 30s, 10 循环，每循环降低退火温度 1°C ；94°C 30s, 50°C lmin, 72°C lmin, 20· 循环；72°C 3min。反应后合并6管PCR产物，使用胶回收试剂盒纯化分子量在500bp至IOOObp的单ー PCR产物。2)、使用T载体试剂盒连接步骤I)的PCR产物，转化大肠杆菌感受态细胞构建过氧化氢酶的基因片段的T载体文库。蓝白斑筛选，挑取所有白色菌落，使用C3+和C3-引物进行菌落PCR寻找阳性克隆。琼脂糖凝胶电泳确认目标PCR产物即过氧化氢酶基因片段。3)、向步骤2)的所有目的PCR产物中加入限制性核酸内切酶MboI及其缓冲液，酶切后使用琼脂糖凝胶电泳检测所有酶切反应液中的核酸片段，每ー种特异的不重复的电泳条带类型对应着一种过氧化氢酶基因。确定过氧化氢酶基因的种类数以及每种基因的数目。4)、对于步骤3)确定的每种过氧化氢酶基因，选择ー个对应的步骤2)中的PCR产物进行DNA测序，获得所有种类的过氧化氢酶基因的序列。这些序列和过氧化氢酶基因种类及数目构成了海水中细菌过氧化氢酶多样性的信息。
权利要求
1.一种使用简并引物检测海水中细菌过氧化氢酶多样性的方法，其特征在于包括下述步骤 1)、从GenBank搜集各类已知的细菌过氧化氢酶蛋白序列，进行多序列比对后，找出保守的氨基酸序列，由此获得合适的四种简并引物，四种简并引物均根据过氧化氢酶蛋白序列的保守区设计，四种简并引物序列包括两种正向简并引物序列(5’至3’)为C3+:TTTYAAYCGAGARMGRGTNCCNGARMGNG ；CA:GTACCTGAAMGRGTRGTSCAYGCNMRRGG ； 和两种反向简并引物序列(5’至3’)为CB:GAATATGCAAAAAGGCGNCCYTGNARNAKYTTRTC ； C3-:AATCTTTATGAGGCCAAACTTTTGTNANRTCR; 2)使用步骤I)中四种简并引物任一组合，聚合酶链式反应扩增过氧化氢酶基因片段，PCR扩增使用12. 5微升反应体系所述反应体系为2. 5mM脱氧核糖核苷三磷酸I微升，IOX水生栖热菌DNA聚合酶PCR缓冲液I. 25微升，50 u M的两种简并引物各0. I至0. 2微升，水生栖热菌DNA聚合酶0. 5至0. 7U，海水DNA I微升，加水至总体积12. 5微升；制备过氧化氢酶基因片段时每次使用4至8个12. 5微升PCR扩增体系；PCR扩增条件94°C I至2分；940C 20至40秒，60°C— 51°C 50至80秒，72°C I分30秒，10至15个循环，每循环降低退火温度1°C -MV 20至40秒，500C 50至80秒，72°C I分，20循环；72°C 3分。反应后合并各管PCR扩增产物，纯化分子量在500bp至IOOObp的单一 PCR扩增产物； 3)使用T载体试剂盒连接步骤2)的PCR扩增产物，转化大肠杆菌感受态细胞构建过氧化氢酶的基因片段的T载体文库，蓝白斑筛选；挑取所有菌落扩增，使用相应的过氧化氢酶简并引物进行菌落PCR扩增寻找阳性克隆；琼脂糖凝胶电泳确认目标PCR扩增产物即过氧化氢酶基因片段； 4)向步骤3)的所有目的PCR扩增产物中加入限制性核酸内切酶MboI及其缓冲液，酶切后使用琼脂糖凝胶电泳检测所有酶切反应液中的核酸片段，每一种特异的不重复的电泳条带类型对应着一种过氧化氢酶基因，确定过氧化氢酶基因的种类数以及每种基因的数目； 5)对于步骤4)确定的每种过氧化氢酶基因，选择一个对应的步骤3)中的PCR扩增产物进行DNA测序，获得所有种类的过氧化氢酶基因的序列；这些序列和过氧化氢酶基因种类及数目构成了海水中细菌过氧化氢酶多样性的信息。
全文摘要
本发明涉及使用简并引物检测海水中细菌过氧化氢酶多样性的方法，以细菌过氧化氢酶保守区设计四种简并引物的组合，以聚合酶链式反应扩增海水总DNA中的过氧化氢酶基因片段，再以大肠杆菌构建酶基因片段的文库，使用限制性内切酶对文库中的酶基因进行酶切，电泳检测片段的分子量分布，确定不同的电泳条带类型，最后对不同类型的过氧化氢酶基因分别进行测序，可获得过氧化氢酶基因多样性的信息。该方法是一种精确、可靠、快速、使用简并引物检测海水中细菌过氧化氢酶多样性的新方法,可用于检测海水中细菌过氧化氢酶多样性。
文档编号C12Q1/68GK102851380SQ20121035214
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月20日 优先权日2012年9月20日
发明者王伟, 孙谧, 纪晓峰, 袁翠 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所