含有天然薯蓣甾醇的阳离子脂质体、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及合成脂质体基因输送功能载体材料领域，特别涉及一种含有天然薯蓣 甾醇的阳离子脂质体、制备方法及其作为小分子干扰基因 Bcl-2SiRNA转染试剂的应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，基于小分子干扰RNA(SiRNA)技术的基因治疗方法引起了人们的极大兴 趣。由于SiRNA可直接在胞浆内进行表达，具有起效快速且给药的时间间隔灵活可控的优 点。因此，通过SiRNA输送进行基因治疗相关的生物医学技术得到了迅速的发展，该技术可 单独使用或与其它治疗手段联用以治疗系列基因缺陷型疾病，如遗传型疾病、病毒感染性 疾病、以及肿瘤等。在肿瘤治疗方面，近来研宄较多的小分子干扰RNA为Bcl-2 SiRNA (正 义链 GUA CAU CCA UUA UAA GCU Gdtdt，反义链 CAG CUU AUA AUG GAU GUA Cdtdt)，其可以 通过抑制bcl-2抗凋亡基因的表达有效抑制Bcl-2蛋白的合成，从而恢复细胞的正常凋亡 调控能力，最终达到抑制肿瘤生长的目的。实现SiRNA输送基因治疗的关键在于以下两个 方面：其一为SiRNA基因序列的选择，其须对靶mRNA基因产生高度序列特异性的结合；其 二是SiRNA须在递送过程中保持稳定，不被体液、细胞内外基质中的酶降解，亦须避免其与 环境中的生物活性物种产生特异性的结合。因此，目前作为SiRNA基因输送的载体大多为 合成阳离子有机功能分子、高分子，其实现基因负载与输送的原理为利用载体阳离子功能 分子、高分子中质子化氨基官能团的正电荷（+)与SiRNA基因序列中磷酸基团所携带的负 电荷（_)的静电相互作用，结合组装形成稳定的聚集体纳米复合物粒子（Polyplex)，保护 所负载的SiRNA不易被细胞内外的核酸酶降解，同时可提高聚集复合体粒子在体内的稳定 性，从而实现提高SiRNA基因转染的效率。上述因素使SiRNA基因高效输送的相关功能载 体材料的研宄成为生命科学和材料科学交叉领域最为活跃的研宄方向之一。
[0003] 然而，到目前为止，虽然国内外已经开发报道了多种阳离子功能分子如阳离子聚 合物、阳离子脂质体等，并作为载体应用于体外或体内细胞/组织水平的SiRNA输送与转染 研宄，但在实际应用中，大多数脂质阳离子功能分子在血液循环中不稳定，容易被网状内皮 系统吞噬后清除而导致其失活。且许多阳离子载体具有免疫原性，可刺激、诱导细胞的免疫 应激反应，进而导致毒副作用。以上这些因素限制了阳离子功能分子在SiRNA基因治疗中 的进一步应用。因此，如何改善合成基因载体的生物相容性、减低毒性及增强SiRNA基因的 转染效果，具有重要的研宄和实用价值。
[0004] 近年来，人们发现，研宄采用具有生物相容性的脂质化合物构建新型阳离子生物 载体成为合成功能脂质分子研宄开发应用的重要方向之一。许多具有重要生理活性的天 然甾体化合物，具有较强的疏水性和良好的生物相容性，可合成制备新型脂质阳离子有机 功能分子，降低合成脂质阳离子的细胞毒性，有可能应用作为新型生物相容性基因载体。近 年来，国内外合成报道了多种由天然留体衍生的阳离子脂质，如胆固醇阳离子氨基脂质，胆 固醇阳离子多肽（Int. J. Pharm. 2014, 468, 83, J. Control. Release, 2013, 172, 159, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2012, 22, 3837)等，它们表现出了良好的药物和基因负载、可控缓释以及 基因输送与细胞内转染效果（Mol. Pharm. 2012, 9, 3579)。在此基础上，人们又继续合成 了其它天然留体衍生的阳离子脂质，以图发展更为有效可控的基因输送载体体系。在相 关前期的工作中，申请者发明了系列基于二硫键的胆固醇脂质基因载体（Biomaterials 2011，11,3507 ;中国专利：ZL201010182428. 4)，发现二硫化学键的引入对降低合成脂质载 体的细胞毒性具有重要作用。进一步制备了系列基于天然生物相容性胆固醇的类脂质阳离 子有机功能分子作为基因转染试剂（中国专利申请号201110040189. 3)应用于质粒DNA的 高效细胞转染。随后发展了系列精氨酸修饰的动物固醇阳离子脂质体其表现出了非常高的 DNA转染效率（中国专利申请号201410060042. 4)。然而，上述作为基因输送载体的合成甾 体类脂质大多集中应用于质粒DNA的细胞转染方面，用于SiRNA转染的甾体类脂质还较少。 因此，研宄和开发生物相容性好、转染效率高的留体类脂质阳离子有机功能分子，进一步拓 展其作为小分子干扰SiRNA功能载体的应用，对于开发具有我国自主知识产权的生物功能 载体材料具有重要意义，其也是本发明所致力解决的目标。
[0005] 发明的内容
[0006] 本发明的目的之一是提供一种含有天然薯蓣留醇的阳离子脂质体。
[0007] 本发明的目的之二是提供上述一种含有天然薯蓣留醇的阳离子脂质体的制备方 法。
[0008] 本发明的目的之三是提供一种含有天然薯蓣留醇的阳离子脂质体作为SiRNA基 因输送载体功能材料的用途。
[0009] 根据本发明所提供的一种含有天然薯蓣留醇的阳离子脂质体，其由下列两组分构 成：
[0010]
[0011] 其中，天然薯蓣留醇精氨酸阳离子脂质（Dios-Arg)和辅助脂质二油酰磷脂酰乙 醇胺（DOPE)的摩尔比为1:0.1~5.0,优先摩尔比为1:0. 5~2。
[0012] 本发明的上述含有天然薯蓣留醇的阳离子脂质体是一种50~500纳米的阳离子 脂质体，优选为100~200纳米的阳离子脂质体。
[0013] 本发明的上述含有天然薯蓣留醇的阳离子脂质体具有10~50毫伏的表面电位， 优选20~40晕伏的表面电位。
[0014] 依据本发明中所述的一种含有天然薯蓣留醇的阳离子脂质体的制备方法，主要为 以下步骤：
[0015] 将一定配比的天然薯蓣留醇精氨酸阳离子脂质Dios-Arg和辅助脂质二油酰磷脂 酰乙醇胺DOPE溶于充分脱水干燥的色谱级有机溶剂中，随后加入少量醇进行增溶，在室 温~90°C下蒸除去有机溶剂，如采用旋转蒸发仪中蒸除去有机溶剂，待瓶底形成一层均匀 的脂质薄膜后；加入一定量的去离子水，超声水化2~4h后得到一种含有天然薯蓣留醇的 阳离子脂质体。
[0016] 根据本发明中所提供的一种含有天然薯蓣留醇的阳离子脂质体的制备方法中， 所述的天然薯蓣留醇精氨酸阳离子脂质和辅助脂质二油酰磷脂酰乙醇胺的摩尔比为 1:0. 1~5. 0,优先摩尔比为1:0. 5~2。
[0017] 根据本发明中所提供的一种含有天然薯蓣留醇的阳离子脂质体的制备方法中， 所述的天然薯蓣留醇精氨酸阳离子脂质，有机溶剂，醇和去离子水的毫摩尔和体积比为 Immol :80 ~150ml :0· 5 ~2ml :80 ~120ml ;优先选择 lmmol :100ml :1ml :100ml。
[0018] 根据本发明中所提供的一种含有天然薯蓣留醇的阳离子脂质体的制备方法中，所 述的有机溶剂包括乙酸乙醋、四氢呋喃、1，4_二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、乙腈、丙 酮或它们的混合有机溶剂。
[0019] 根据本发明中所提供的一种含有天然薯蓣留醇的阳离子脂质体的制备方法中，所 述的醇包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇、叔戊醇或 它们的混合醇溶剂。
[0020] 根据本发明提供的一种含有天然薯蓣留醇的阳离子脂质体，可以进一步应 用作为新型高效低毒的类脂质SiRNA基因转染试剂。与已有的相关报道相比（Mol. Pharmaceutics. 2008,5,128)以及本发明人先前的工作（Biomaterials2011, 11，3507 ;中 国专利申请号201010182428. 4,201110040189. 3)相比，具有如下的优点：（1)本发明中所 提供的一种含有天然薯蓣留醇的阳离子脂质体其组分之一 Dios-Arg来源于具有我国特色 的天然产物薯蓣留醇和天然精氨酸，易于大量规模化制备。另一组分为商品化的二油酰磷 脂酰乙醇胺（DOPE)，原料易得。对比可知，采用上述系列脂质体作为SiRNA基因载体，在人 神经胶质瘤细胞株U-87中的基因转染效率评价结果表明其具有较高的SiRNA转染效率，可 开发作为新型高效低毒的类脂质SiRNA基因转染试剂得到应用。
【附图说明】
[0021] 图1、本发明实施例1-3中所述的一种含有天然薯蓣留醇的阳离子脂质体 Dios-DOPE 2/1、Dios-DOPE 1/1、Dios-DOPE 1/2 在人肺癌细胞 H1299 中的体外细胞毒性 评价。实验对照组采用市售基因转染试剂bPEI-25K，从图中结果可以发现依据该发明所 制备的类脂质阳离子有机功能分子及其脂质体在相同质量浓度下的细胞毒性远低于参照