专利名称：一种新孢子虫特异pcr检测试剂盒及制备方法
技术领域：
本发明提供一种 新孢子虫特异nest-PCR检测试剂盒，用于不同动物新孢子虫虫感染速殖子、组织包囊和卵囊的检测，本发明还公开了上述nest-PCR检测试剂盒的制备方法，属于分子生物学检测技术领域。
背景技术：
新孢子虫作为一种顶复门寄生虫,经系统发育学分析核糖体DNA表明其与弓形虫heydorni在亲缘关系上比较近,在一般的实验检测方法主要以血清学方法为主，包括IFAT，ELISA，PCR等，由于不同于抗原在寄生虫不同阶段的表达和抗体的产生不同，因此ELISA和IFTA不能检测到寄生虫生活史的所有阶段感染，特别是在终宿主和有性增殖阶段。基因组DNA是十分稳定的，贯穿于寄生虫整个生活史，但是目前的新孢子虫PCR检测方法在低丰度样本中存在灵敏度低、特异性差的特点。因此找到新孢子虫特异基因并建立特异的分子生物学诊断方法对寄生虫诊断是有利的。Nest-PCR方法是这些方法中特异性最强、敏感性最高。国内外对于新孢子虫病的检疫诊断还相对比较落后，国内很多实验室建设仍然还是空白，对该病的检测仍然采用ELISA、IFTA和PCR，远不能满足实际需要。因此，开发简便易行、快速、灵敏、特异的分子生物学技术已成为主要的发展趋势。
发明内容
本发明的目的是公开一种新孢子虫特异nest-PCR (简称PCR)检测试剂盒，用于检测新孢子虫感染不同动物形成的组织包囊及终宿主排出的卵囊。本发明还提供上述检测试剂盒的制备方法，适用于工业化生产。本发明公开了新孢子虫特异基因序列，见SEQ no. I。本发明公开了新孢子虫特异nest-PCR引物，用于扩增新孢子虫基因。引物序列如下
第一轮PCR引物
OF :5’ _ AAACCAGGAAAACAAATGA _3’
0R:5’ - TTGACGGTGTCTGAAAATC-3’ ；
第二轮PCR引物
IF :5’- ACGGTCACATTGTTCATCTA -3’
IR :5’- AAGTCCTGGGTATTGTTATTG-3 ；
本发明还公开一种新孢子虫nest-PCR检测试剂盒,用于诊断新孢子虫病,试剂盒内含=1OXPCR反应液，权利要求1中的引物0F、0R和IF、IR用于nest-PCR特异扩增，含SEQno. 1基因的阳性对照作为检测的阳性指示和ddH20。本发明新孢子虫病nest-PCR检测试剂盒的制备方法如下
1.IOXPCR反应液300mM的dNTPs (购自日本TAKARA公司)20 μ 1，Tris (购自美国Pragma 公司)2. 42mg, KCl (购自美国 Sigma 公司)7. 45mg, MgCl2 (购自美国 Sigma 公司)O. 258mg, 200 U 的 Taq 酶(购自日本 TAKARA 公司)20 μ 1，加入 150 μ I ddH20，用 HCl 调 pH至8. 5，用ddH20定容至200 μ I ;
2.阳性对照DNA的制备阳性对照DNA为新孢子虫基因组DNA，将培养的新孢子虫用细胞计数板计数，将IO6个新孢子虫提取基因组DNA，然后稀释为100 μ I。3.试剂盒的组装每个试剂盒为检测100个样品，按下列内容组装试剂盒(整个操作要求无菌环境)
10XPCR 反应液:200μ I,
IOmM 引物 0F: 50μ I ；
IOmM 引物 0R: 50μ I ；
IOmM 引物 IF: 50μ I ；
IOmM 引物 IF: 50μ I ；
阳性对照DNA: 100μ I ； ddH20: 2ml。本发明试剂盒的使用方法如下
I)、第一轮PCR扩增
取待检样品提取基因组DNA后，用本试剂盒内试剂进行第一轮PCR扩增。PCR反应加样体系如下，总反应体系为20 μ I (标本DNA的用量根据提取基因组DNA浓度决定，最后用ddH20补足20 μ I ;阳性对照用量为I μ I):
10XPCR 反应液2μ I ；
根据提取DNA量决定标本DNA
引物 OF (IOmM) 1μ I ；
引物 OR (IOmM) 1μ I ；ddH20 :补足至 20 μ I。将阴性和阳性对照分别加入标记好的管中，然后把样品依次加入并标记好，置于PCR仪中；第一轮PCR条件为95°C预变性5min、94°C变性30s、56°C退火40s、72°C延伸60s，共30个循环，后72°C延伸IOmin ；
第二轮PCR扩增
以第一轮PCR产物为模板，用本试剂盒内试剂进行第二轮PCR扩增；PCR反应加样体系如下，总反应体系为20 μ I ;
10XPCR 反应液2μ I ；
第一轮PCR产物1μ I ;
引物 IF (IOmM) 1μ I ；
引物 IR (IOmM) 1μ I ；ddH20 15μ I ；
第二轮PCR反应条件为95°C预变性5min、94°C变性30s、56°C退火40s、72°C延伸30s，共30个循环，后72°C延伸IOmin ；
PCR产物观察
称取琼脂糖，用电泳液混匀后(O. 8%-1. 0%)在微波炉中加热三分钟。等胶冷却后在加样孔中分别加样，IOOV电压下电泳10分钟，之后在紫外灯下观察实验结果，如果出现421bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果。本发明的积极效果在于nest-PCR扩增新孢子虫基因某一特异分子片段，用于新孢子虫病的诊断；本发明涉及的新孢子虫和弓形抑制性杂交消减文库筛选到的新孢子虫特异基因SEQ no. I为新孢子虫特有基因，因此用nest-PCR法扩增动物组织及粪便样品的SEQno. I基因部分片段可以用于新孢子虫的分子检测，可以用来诊断新孢子虫急性、慢性及隐性感染。根据新孢子虫基因组设计特异扩增引物，并构建新孢子虫nest-PCR检测试剂盒，并拟应用于临床检测，可准确、快速母畜流产是否由新孢子虫侵染所致，本试剂盒也可用于新孢子虫的分子鉴定。本试剂盒为临床诊断及新孢子虫病流行预测预报提供依据，具有重大的社会意义和广阔的应用前景。具有先进性、特异性和高准确率，而且在测定时简便和易于操作的特点。
图I、本发明试剂盒对新孢子不同生活史阶段的新孢子虫扩增
图2、本发明试剂盒检测灵敏度；
图3、本发明试剂盒特异性。
具体实施例方式下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解至IJ，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。实施例I
本发明根据nest-PCR扩增原理，设计并合成了一组特异扩增新孢子虫基因的nest-PCR引物，并委托上海生物工程有限公司合成引物。引物合成后用灭菌蒸馏水制成IOOmM原液(储藏液)，然后再用ddH20稀释到IOmM做为工作液。引物序列如下
第一轮PCR引物
OF :5’ _ AAACCAGGAAAACAAATGA _3’
0R:5’ - TTGACGGTGTCTGAAAATC -3’
第二轮PCR引物
IF :5’- ACGGTCACATTGTTCATCTA -3’
IR :5’- AAGTCCTGGGTATTGTTATTG-3实施例2试剂盒组装
I) 10XPCR反应液300mM的dNTPs (购自日本TAKARA公司)20 μ 1，Tris (购自美国Pragma 公司)2. 42mg, KCl (购自美国 Sigma 公司)7. 45mg, MgCl2 (购自美国 Sigma 公司)O. 258mg, 200 U 的 Taq 酶(购自日本 TAKARA 公司)20 μ 1，加入 150 μ I ddH20，用 HCl 调 pH至8. 5，用ddH20定容至200 μ I ;
2)阳性对照DNA的制备阳性对照DNA为新孢子虫基因组DNA，将培养的新孢子虫用细胞计数板计数，将IO6个新孢子虫提取基因组DNA，然后稀释为100 μ I。3)试剂盒的组装每个试剂盒为检测100个样品
按下列内容组装试剂盒
每个试剂盒为检测100个样品，按下列内容组装试剂盒(整个操作要求无菌环境) 10XPCR 反应液 200 μ 1，
IOmM 引物 OF 50μ I ；
IOmM 引物 OR 50μ I ;
IOmM 引物 IF 50μ I ；
IOmM 引物 IF 50μ I ；
阳性对照DNA 100μ I ； ddH20 2ml。
实施例3
本发明试剂盒的使用方法如下
I)、第一轮PCR扩增
取待检样品提取基因组DNA后，用本试剂盒内试剂进行第一轮PCR扩增。PCR反应加样体系如下，总反应体系为20 μ I (标本DNA的用量根据提取基因组DNA浓度决定，最后用ddH20补足20 μ I ;阳性对照用量为I μ I):
10XPCR 反应液2μ I ；
根据提取DNA量决定标本DNA
引物 OF (IOmM) 1μ I ；
引物 OR (IOmM) 1μ I ；ddH20 :补足至 20 μ I0将阴性和阳性对照分别加入标记好的管中，然后把样品依次加入并标记好，置于PCR仪中；第一轮PCR条件为95°C预变性5min、94°C变性30s、56°C退火40s、72°C延伸60s，共30个循环，后72°C延伸IOmin ；
第二轮PCR扩增
以第一轮PCR产物为模板，用本试剂盒内试剂进行第二轮PCR扩增；PCR反应加样体系如下，总反应体系为20 μ I ;
10XPCR 反应液2μ I ；
第一轮PCR产物1μ I ;
引物 IF (IOmM) 1μ I ；
引物 IR (IOmM) 1μ I ；ddH20 15μ I ；
第二轮PCR反应条件为95°C预变性5min、94°C变性30s、56°C退火40s、72°C延伸30s，共30个循环，后72°C延伸IOmin ；
PCR产物观察
称取琼脂糖，用电泳液混匀后(O. 8%-1. 0%)在微波炉中加热三分钟。等胶冷却后在加样孔中分别加样，100V电压下电泳10分钟，之后在紫外灯下观察实验结果，如果出现421bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果。
试验例I
制备的试剂盒对不同生活史阶段的新孢子虫扩增 I)、第一轮PCR扩增
选取新孢子虫速殖子，新孢子虫感染鼠脑组织DNA及新孢子虫卵囊DNA，用本试剂盒内试剂进行第一轮PCR扩增。PCR反应加样体系如下
10XPCR 反应液2μ I ；
样品I μ I
引物 OF (IOmM) 1μ I ；
引物 OR (IOmM) 1μ I ；ddH20:15 μ I
将阴性对照加入标记好的管中，然后把样品依次加入并标记好，置于PCR仪中；第一轮PCR条件为95°C预变性5min、94°C变性30s、56°C退火40s、72°C延伸60s，共30个循环，后 72°C延伸 IOmin ；
第二轮PCR扩增
以第一轮PCR产物为模板，用本试剂盒内试剂进行第二轮PCR扩增；PCR反应加样体系如下，总反应体系为20 μ I ;
10XPCR 反应液2μ I ；
第一轮PCR产物1μ I ;
引物 IF (IOmM) 1μ I ；
引物 IR (IOmM) 1μ I ；ddH20 15μ I ；
第二轮PCR反应条件为95°C预变性5min、94°C变性30s、56°C退火40s、72°C延伸30s，共30个循环，后72°C延伸IOmin ；
PCR产物观察
称取琼脂糖，用电泳液混匀后(O. 8%-1. 0%)在微波炉中加热三分钟。等胶冷却后在加样孔中分别加样，100V电压下电泳10分钟，之后在紫外灯下观察实验结果，如果出现421bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果(见图I):图中，M:DL2000 DNA Maker ；1: Ne速殖子DNA ；2 =Nc感染鼠脑组织DNA ；3 :含Ne卵囊粪便基因组DNA ；4:阴性对照。试验例2
制备的试剂盒灵敏度
5X105,5X10\5X10\5X102,5,5X10-\5X10-2 个新孢子虫 DNA，用本试剂盒内试剂进行第一轮PCR扩增。PCR反应加样体系如下
10XPCR 反应液2μ I ；
样品I μ I
引物 OF (IOmM) 1μ I ；
引物 OR (IOmM) 1μ I ；ddH20:15 μ I
将阴性对照加入标记好的管中，然后把样品依次加入并标记好，置于PCR仪中；第一轮PCR条件为95°C预变性5min、94°C变性30s、56°C退火40s、72°C延伸60s，共30个循环，后 72°C延伸 IOmin ；
第二轮PCR扩增
以第一轮PCR产物为模板，用本试剂盒内试剂进行第二轮PCR扩增；PCR反应加样体系如下，总反应体系为20 μ I ;
10XPCR 反应液2μ I ；
第一轮PCR产物1μ I ;
引物 IF (IOmM) 1μ I ；
引物 IR (IOmM) 1μ I ；ddH20 15μ I ；
第二轮PCR反应条件为95°C预变性5min、94°C变性30s、56°C退火40s、72°C延伸30s，共30个循环，后72°C延伸IOmin ；
PCR产物观察
称取琼脂糖，用电泳液混匀后(O. 8%-1. 0%)在微波炉中加热三分钟。等胶冷却后在加样孔中分别加样，100V电压下电泳10分钟，之后在紫外灯下观察实验结果，如果出现421bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果，最终确定nest-PCR试剂盒可检测到O. 5个新孢子虫DNA (见附图2):图中，DL2000 DNA Maker ;I-8:新孢子虫基因组DNA梯度从5X105-5X10-2 个；9 :阴性对照。
试验例3试剂盒特异性
以新孢子虫速殖子，新孢子虫感染鼠脑组织DNA及新孢子虫卵囊DNA，弓形虫速殖子DNA, JS3-JS4鉴定的Hammnndia, heydorni卵囊DNA及犬囊等抱球虫DNA 6个样本DNA为模板，用本试剂盒内试剂进行第一轮PCR扩增。PCR反应加样体系如下
10XPCR 反应液2μ I ；
样品I μ I
引物 OF (IOmM) 1μ I ；
引物 OR (IOmM) 1μ I ；ddH20:15 μ I
把样品依次加入并标记好，置于PCR仪中；第一轮PCR条件为95°C预变性5min、94°C变性30s、56°C退火40s、72°C延伸60s,共30个循环，后72°C延伸IOmin;
第二轮PCR扩增
以第一轮PCR产物为模板，用本试剂盒内试剂进行第二轮PCR扩增；PCR反应加样体系如下，总反应体系为20 μ I ;
10XPCR 反应液2μ I ；
第一轮PCR产物1μ I ;
引物 IF (IOmM) 1μ I ；
引物 IR (IOmM) 1μ I ；ddH20 15μ I ；
第二轮PCR反应条件为95°C预变性5min、94°C变性30s、56°C退火40s、72°C延伸30s，共30个循环，后72°C延伸IOmin ；
PCR产物观察
称取琼脂糖，用电泳液混匀后(O. 8%-1. 0%)在微波炉中加热三分钟。等胶冷却后在加样孔中分别加样，100V电压下电泳10分钟，之后在紫外灯下观察实验结果，如果出现421bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果，最终确定nest-PCR试剂盒为新孢子虫特异检测试剂盒(见附图3);图中，DL2000 DNA Maker ；1: Ne速殖子DNA 2 :Nc感染鼠脑组织DNA ;3 :含Ne卵囊粪便基因组DNA ；4 ^Hammondia heydorni卵囊粪便基因组DNA ；5 :弓形虫基因组DNA ；6 :犬囊等孢球虫基因 组DNA。实施例5 实际样品检测
采集沈阳地区犬粪样200份，试剂盒对样品进行检测。I) 粪便样本处理称取O. 5克粪样于灭菌后的I. 5ml离心管,用美国QIAGEN公司QIAamp DNA Stool Mini Kit (货号51504)提取粪便基因组DNA，按操作手册操作。3)样品扩增
以提取好的样本DNA为模板，用本试剂盒内试剂进行第一轮PCR扩增。PCR反应加样体系如下
10XPCR 反应液2μ I ；
样品2 μ I
引物 OF (IOmM) 1μ I ；
引物 OR (IOmM) 1μ I ；ddH20 14 μ I
将阴性和阳性对照分别加入标记好的管中，然后把样品依次加入并标记好，置于PCR仪中；第一轮PCR条件为95°C预变性5min、94°C变性30s、56°C退火40s、72°C延伸60s，共30个循环，后72 °C延伸IOmin ；
第二轮PCR扩增
以第一轮PCR产物为模板，用本试剂盒内试剂进行第二轮PCR扩增；PCR反应加样体系如下，总反应体系为20 μ I ;
10XPCR 反应液2μ I ；
第一轮PCR产物1μ I ;
引物 IF (IOmM) 1μ I ；
引物 IR (IOmM) 1μ I ；ddH20 15μ I ；
第二轮PCR反应条件为95°C预变性5min、94°C变性30s、56°C退火40s、72°C延伸30s，共30个循环，后72°C延伸IOmin ；
PCR产物观察
称取琼脂糖，用电泳液混匀后(O. 8%-1. 0%)在微波炉中加热三分钟。等胶冷却后在加样孔中分别加样，100V电压下电泳10分钟，之后在紫外灯下观察实验结果，如果出现421bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果。3) PCR产物测序在紫外灯下将出现的扩增条带用洁净的手术刀切下，放入灭菌I. 5ml离心管，使用上海生物工程公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(货号SK8132)回收目的片段，将回收产物送上海生物工程公司测序。经nest-P CR诊断共有57个阳性结果，对阳性结果进行序列测定，正确率为100%。
权利要求
1.新孢子虫特异基因序列，其特征在于如SEQno. I所示。
2.用于扩增新孢子虫基因的nest-PCR扩增引物，具有以下序列 第一轮PCR引物OF :5’ _ AAACCAGGAAAACAAATGA _3’0R:5’ - TTGACGGTGTCTGAAAATC-3’ ； 第二轮PCR引物IF :5’- ACGGTCACATTGTTCATCTA -3’IR :5’- AAGTCCTGGGTATTGTTATTG-3。
3.一种新孢子虫特异PCR检测试剂盒，包含=IOXPCR反应液，权利要求2中的引物0F、OR和IF、IR用于nest-PCR特异扩增，含SEQ no. I基因的阳性对照作为检测的阳性指示。
4.权利要求3所述的试剂盒制备方法如下1)10XPCR 反应液300mM 的 dNTPs 20 μ I, Tris 2. 42mg, KCl 7. 45mg, MgCl2O.258mg, 200 U 的 Taq 酶 20 μ 1，加入 150 μ I ddH20，用 HCl 调 pH 至 8· 5，用 ddH20 定容至200 μ I ； 2)阳性对照DNA的制备阳性对照DNA为新孢子虫基因组DNA，将培养的新孢子虫用细胞计数板计数，将IO6个新孢子虫提取基因组DNA，然后稀释为100μ I ; 3)试剂盒的组装每个试剂盒为检测100个样品 按下列内容组装试剂盒 每个试剂盒为检测100个样品，按下列内容组装试剂盒(整个操作要求无菌环境)10XPCR 反应液 200 μ 1，IOmM 引物 OF 50μ I ；IOmM 引物 OR 50μ I ;IOmM 引物 IF 50μ I ；IOmM 引物 IF 50μ I ； 阳性对照DNA 100μ I ； ddH20 2ml。
全文摘要
本发明提供一种新孢子虫特异nest-PCR检测试剂盒，用于不同动物新孢子虫虫感染速殖子、组织包囊和卵囊的检测，本发明还公开了上述nest-PCR检测试剂盒的制备方法，nest-PCR扩增新孢子虫基因某一特异分子片段，用于新孢子虫病的诊断；本发明涉及的新孢子虫和弓形抑制性杂交消减文库筛选到的新孢子虫特异基因SEQno.1为新孢子虫特有基因，因此用nest-PCR法扩增动物组织及粪便样品的SEQno.1基因部分片段可以用于新孢子虫的分子检测，可以用来诊断新孢子虫急性、慢性及隐性感染。
文档编号C12N15/11GK102888412SQ201210353870
公开日2013年1月23日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者李建华, 张西臣, 贺鹏飞, 宫鹏涛, 吕强, 李 赫, 杨举, 王伟利, 张国才, 任文陟 申请人:吉林大学