治疗寄生原虫感染所致疾病的三嗪酮类化合物的制作方法

专利名称：治疗寄生原虫感染所致疾病的三嗪酮类化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗、特别是预防性治疗导致流产或引起神经性疾病的寄生虫感染的动物的三嗪酮类化合物。本发明尤其涉及适于治疗导致流产或引起神经性疾病的寄生性原虫(例如球虫)病的那些三嗪酮类化合物。本发明特别涉及适于治疗新孢子虫(Neospora)感染的三嗪酮类化合物。

背景技术：
三嗪酮类化合物(如三嗪二酮类，例如地克珠利，以及三嗪三酮类，例如托曲珠利)被用来治疗多种哺乳动物、昆虫和鱼类因多种原虫引发的疾病；参见下列各项美国专利4,631,218；4,933,341；4,935,423；5,114,938；5,141,938；5,188,832；5,196,562；5,256,631和5,464,837或EP A 170316。对这些三嗪酮类化合物敏感的原虫包括感染鸟类、哺乳动物和昆虫内脏的寄生虫，它们引起腹泻、萎靡、恶心和呕吐。一般来说，三嗪酮类化合物的作用方式为攻击肠壁细胞和内脏壁细胞中的寄生虫的中间阶段，从而使寄生虫细胞中围绕着细胞核和线粒体的内质网扩大，这可能干扰了细胞核的分裂能力，使裂殖体和小配子体停留在幼期，仅生成很少的裂殖子和小配子。其结果是后来的寄生阶段虫体失去了穿透新的哺乳类细胞的能力，从而达到有效防止宿主体内寄生虫增殖的目的。
自从70年代以来，某些寄生原虫引起的动物的神经疾患和/或导致的流产仍然是特别重要的。对这些种类的某些原虫进行成功的分离和培养被证明是困难的。例如直到80年代后期才成功地分离了脑或脊液中的寄生虫。感染脑部的寄生虫可以引起神经疾病，感染胎儿的寄生虫可以引起导致流产的疾病一被确认就需要能有效地抗寄生原虫的药物，它们能够穿过血-脑屏障和胎盘屏障而又没有毒副作用。只有极少数的药物能够穿过动物的血-脑屏障和胎盘屏障。许多能够穿过动物的血-脑屏障和/或胎盘屏障从而可以有效治疗寄生虫脑部感染的药物都有毒副作用，因而在使用时要冒很大风险。因此至今还没有一种能够有效地治疗这类神经疾病和导致流产的疾病的有效药物得到批准使用。下面是由寄生虫引起的疾病的简要描述 犬新孢子虫(Neospora caninum)是原虫类的寄生虫新种，由BJERKAS等人于1984年从一只挪威犬中分离到并予描述。除了狗和牛外，绵羊、山羊和马也发现有自然感染(Dubey and Rommel 1992，Dubey and Lindsay 1993)。除了狗和牛，狐狸、猫、绵羊和小鼠也能成功地获得实验感染。犬新孢子虫的终宿主可能是狗(McAllister等1998)，除此之外，对其完整的发育周期尚无详细研究。
许多不同的细胞可以作为犬新孢子虫的宿主细胞，例如巨噬细胞，中性白细胞，成纤维细胞，血管内皮细胞，肌细胞，肾小管上皮细胞，肝细胞和神经细胞。然而，通过速殖体进行繁殖更容易在细胞器(如肌肉和神经细胞)内发生。自然感染后因此优先在这些组织中出现病理症状。自然感染后从5～6周起狗表现出因神经根炎而致的过敏和后足轻瘫加重。神经系统中还可进一步发现组织病理学的异常炎症，并且主要发生在脑和脊髓中。此处主要是延长的非化脓性炎症、神经胶质的增生和血管周的单核细胞(巨噬细胞，淋巴细胞和一些浆质细胞)浸润，某些情况下也包括嗜酸性细胞和中性白细胞的浸润。甚至出现用肉眼都可观察到的肌肉坏死性病变。除了或多或少明显的萎缩外，还可见到纵向的灰色长条纹。这些症状特别容易发生在后腿。从组织学上看，这些病变构成了具有少量坏死性改变的肌细胞炎和非化脓性脉管炎。在前腿、膈和舌的肌肉系统中也可见到不太明显的这些病变。具有这些症状的5～12周龄的狗必须执行安乐死(Dubey等1988)。新孢子虫的感染可通过反复的胎盘传播而传染给下一代。这种病并非必然感染一窝动物中的所有个体。6只在怀孕的第21天实验性地感染了新孢子虫的母狗中，1只母狗生下了3只活的小狗，另5只新孢子虫阳性的母狗所怀胎儿则流产了。3只生下来活着的小狗中没有检出寄生虫(Cole等1995)。
Thilsted & Dubey(1989)首先描述了新墨西哥州一头牛的流产胎儿脑组织中的新孢子虫感染。其后在美国(Conrad等1993，Barr等1993，Marsh等1995)、日本(Yamane等1996)和瑞典(Stenlund等1996)从牛中得到了更多的分离物。在加利福尼亚州和澳大利亚，犬新孢子虫感染被认为是导致母牛胎儿流产的主要原因(Barr等1990)。
绝大多数感染了新孢子虫的小牛似乎都在3～9月龄时流产。在这些胎儿中，首先发现了大量的速殖子。迄今在生下来的小牛中仅证实有囊肿存在。感染的小牛在生下来后至迟3～17天死亡。其病症与在狗中见到的相似。出现共济失调，膝关节反射极度减弱，后肢(某些情况下所有四肢)出现跛行。组织学的观察结果与在狗中见到的相似非化脓性脑膜炎和脊髓炎为主要症状。与在狗和其它动物中的情况一样，可在脑组织中，特别是在血管周区域内发现单核细胞浸润和坏死。尤其是在神经组织，少数情况下也在肌肉细胞中发现有呈病灶样存在的寄生虫，主要是速殖子或带有速殖子的假囊肿，但多数情况下数量较少。值得注意的是，与弓形虫感染形成明显对比，新孢子虫感染可以反复地由母畜传染给子畜，这已在狗和牛中得到了证实(Bjerkas等1984，Dubey and Rommel 1992，Dubey等1988)。
迄今从狗和牛中分离到的犬新孢子虫，无论是形态学的超微结构切片，蛋白质分析，还是接下来的rRNA或ITS1序列的分子生物学序列比较，都没有发现有什么不同(Holmdahl and Mattsson 1996)。流行与经济意义 自从犬新孢子虫于1984年被发现以来，迄今已在世界各地都分离到了这种寄生原虫(综述Dubey/Lindsay)。在加利福尼亚，估计奶牛中因犬新孢子虫感染导致的流产比例特别高。在468例流产胎儿中，45.5％系由于犬新孢子虫感染所致(Dubey and Lindsay 1993)。在瑞士，从29％流产的牛胎儿的脑组织中检出了新孢子虫属特异性DNA；相应地，瑞士的年度经济损失估计为1020万瑞士法郎(Gottstein/Bern)，澳大利亚的年度损失则为1亿澳元(Johnson/Sydney)。在加利福尼亚州，该病的发病高峰出现在冬季的12月至来年2月份，新西兰的调查结果也大致如此(Thornton等1991)。这里因犬新孢子虫感染导致的流产发生在5～7月份。迄今尚无一种治疗(特别是预防性治疗)犬新孢子虫感染的有效方法被公开。
马的原虫性脑脊髓炎(EPM)是一种主要发生在承受巨大压力的年轻马匹(例如良种的赛马和纯种的表演用马)中的神经系统疾病，因而在马匹经济中也是一种具有实质性经济意义的疾病。EPM作为一种疾病是在70年代首次确定的，直到1991年才从一匹患EPM的马中分离培养成功并得名神经肉孢子虫(Sarcocystis neurona)。1997年，从一匹患有EPM的马的脑组织中分离到一种新孢子虫属的原虫-修氏新孢子虫(Neospora hugesi)。相应地，目前认为EPM很可能或仅由这种新鉴定的生物体引起，或仅由神经肉孢子虫引起，或因同时感染这两种原虫而引起。EPM引起的最常见的症状为不对称的共济失调，赢弱和痉挛状态。这种病可以像任何神经疾病状态，可以极急性发作，或表现为慢性病。慢性发作的初始阶段往往是潜伏的，直到疾病晚期前难于诊断并可致死亡。最轻的病例仅有的临床症状可能只是髋肢麻痹或较轻的喘息声。大多数病情严重的马不能吞咽或站立。现在知道，在大多数病情严重的马中，寄生虫(例如神经肉孢子虫)感染了脑组织并造成了脑组织的严重损害。EPM的临床症状是因寄生虫对神经系统(脑和脊髓)造成的直接损害以及由于炎症细胞的浸润、水肿和中枢神经系统(CNS)中伴有裂殖子和分裂体的神经坏死所造成的脑损害引起的。目前还没有控制EPM的有效的预防措施。已应用过人用药物三甲氧苄二氨嘧啶和磺酰胺的联合，但这种疗法太贵，且需多次重复给药。
再一种属于该类球虫的寄生虫，刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)，很久已来就是已知的。刚地弓形虫最初是从猫的内脏和肌肉组织中分离到的。这种寄生虫的终宿主是猫，猫可将弓形虫保存很长时间，其间可将弓形虫的卵囊传播给其它的动物，包括牛、羊、猪和人。羊、牛和人感染了弓形虫可导致引起流产的疾病和主要侵袭中枢神经系统的疾病。最近，弓形虫更与受感染的母畜(在感染之前的怀孕期间血清阴性)胎儿流产和畸形联系了起来。猫以外的宿主，如牛、羊、猪和人不产生卵囊，但速殖子和钝殖子发育，肌肉和脑组织会受到它们的侵害，速殖子和钝殖子引起的这种疾病的临床症状为神经系统综合症和胎儿流产伴以胎儿畸形。据报道60％的猫为弓形虫血清阳性。再有，对弓形虫病尚无治疗办法，特别是没有有效的预防办法。
使用三嗪酮类化合物(例如地克珠利，托曲珠利或托曲珠利-砜(最近得新名称为朋那珠利(ponazuril)))进行治疗，特别是预防性治疗，对处于球虫(特别是肉孢子虫科球虫)感染危险之中的动物没有不可接受的副作用，这在以前的文献(包括开头所提到的文献)中未曾公开或未曾教导过。因此，本发明的目的就是为处于上面提到的寄生虫感染危险之中的动物提供一种有效的治疗方法，特别是预防性的治疗方法。


发明内容
令人惊奇的是，现已发现，通过用三嗪酮类进行治疗，特别是进行预防性治疗，达到了对寄生原虫感染的彻底预防。
相应地，本发明涉及一种治疗，特别是预防性地治疗动物的方法，所述动物处于寄生虫病感染的危险之中，而这类寄生虫病或为神经系统疾病，或可导致胎儿流产的疾病，这个方法的特征是给所述动物施用药学有效剂量的三嗪酮类药物。这些动物包括，但不限于，例如马、牛、猫、狗、猪、绵羊、鸟、昆虫和人。
引起感染或发病的寄生虫为肉孢子虫科的球虫，它们可表现为神经系统疾病，或导致流产的疾病。为了说明，但不限于，可选自肉孢子虫属种类、新孢子虫属种类和弓形虫属种类。典型的是选自神经肉孢子虫、巨大新孢子虫、犬新孢子虫和刚地弓形虫，特别是新孢子虫属的肉孢子虫科。原虫感染或原虫病包括EPM，新孢子虫病和弓形虫病，但并不仅限于此。
在实施本发明时，治疗、特别是预防性地治疗动物由本文所述的原虫引起的寄生虫感染或疾病，导致了对症状和与此相关的疾病的预防。一般说来，这些疾病的症状包括麻痹，共济失调、瘫痪、流产、新生儿赢弱，以及其它相关的症状。典型的疗程大约为1～30天，优选的是1～20天，特别优选的是1～10天，尤其特别优选的是1～6天。当然，这种治疗，特别是预防性治疗的方案，可以是每天一次，每天两次或每天数次，隔天一次或每周一次，可根据情况和病原寄生虫的种类而定。
优选的剂量为每千克被治疗动物的体重1～500mg活性物质，特别优选的剂量为10～200mg/kg，尤其特别优选的剂量是20～150mg/kg。
不想确定发明的特定理论，但认为本文所述的这种治疗、特别是预防性治疗的非预见性的效果是由于三嗪酮类化合物所具有的穿过脑-血屏障或胎盘屏障的能力。我们认为本发明的这些化合物易于通过脑-血屏障并能穿入胎盘中，原位杀死脑中和脊髓的脊髓液中的原虫。
迄今还没有经济、施用简单的用于有效预防这些疾病又没有不可接受的副作用(如对动物的毒性和诱变性)的药物。现在在下文中将描述这些三嗪酮类化合物，特别是托曲珠利化合物类，但并非仅限于此。本项公开和发明的权利要求还包括其它的三嗪酮类化合物，在托曲珠利类化合物的意义上它们是有用的。
按照本发明可以使用的三嗪三酮类-托曲珠利类化合物具有式(I)所示的结构
其中 R1为卤代烷硫基、卤代烷基亚硫酰基或卤代烷基磺酰基， R2为氢、烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烷基巯基、卤素、卤代烷基或任选取代的氨磺酰基，例如二烷基氨磺酰基，以及 R3和R4可以是相同的或不同的，代表氢、烷基、链烯基或炔基，X代表O或S，以及它们的生理学上可应用的盐。
此外，发现特别是下列式(I)的三嗪三酮-托曲珠利类化合物是本发明可用的，其中， R1代表卤代(C1-C4)烷硫基、卤代(C1-C4)烷基亚硫酰基或卤代(C1-C4)烷基磺酰基， R2代表氢、(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤素、(C1-C4)烷氧基(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷基巯基、(C1-C4)二烷基氨基磺酰基或卤代(C1-C4)烷基，以及 R3和R4可以是相同的或不同的，代表氢、(C1-C4)烷基或(C1-C4)链烯基，X代表O或S。
本发明同样可用的三嗪二酮类-地克珠利类化合物具有式(Ia)的结构
其中 R1a、R2a和R3a各自相互独立代表氢、卤素、三氟甲基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷硫基或C1-C6烷基磺酰基， R4a和R5a各自相互独立代表氢、卤素、三氟甲基或C1-C6烷基，以及 R代表氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基或苯基，其可任选带有最多3个独立选自下列的取代基卤素、三氟甲基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷硫基或C1-C6烷基磺酰基。
优选使用这样的式(Ia)化合物，其中 R1a和R2a各自相互独立代表氢、卤素、三氟甲基或C1-C6烷基， R3a代表氢， R代表氢、C1-C6烷基、苯基或卤代苯基，以及 R4a和5a各自相互独立代表氢、卤素、三氟甲基或C1-C6烷基。
特别优选使用这样的式(Ia)化合物，其中 R1a代表4-卤， R2a和R3a代表氢， R代表氢或甲基，以及 R4a和R5a各自相互独立代表氢，卤素或三氟甲基，此处R4a和R5a位于连接它们的苯基的2-位和6-位上。
特别优选使用的化合物尤其是

地克珠利，

托曲珠利和

朋那珠利。
尤其特别优选使用托曲珠利和朋那珠利。
此外还发现 (a)式I化合物可如此制备通过式II化合物
其中 R1、R2、R3和X具有上述含义 与式III取代的羧酸异氰酸酯反应
其中 R5代表卤原子，烷氧基或芳氧基，并且任选分离生成的式IV取代的1，3，5-三嗪衍生物
其中 R1、R2、R3和X具有上述含义 并且任选与式V化合物反应 A-Z(V) 其中 A代表烷基、链烯基或炔基，且 B代表卤素； 或者 (b)如下制备式I化合物式II化合物(其中的R1，R2，R3和X具有上述含义)与式VI的二(氯代甲酰)胺任选在酸接收剂存在下反应
其中 R6代表烷基， 或者 (c)为了获得式I的化合物(其中的取代基R2、R3和R4以及X具有上述含义，并且R1为卤代烷基亚硫酰基或卤代烷基磺酰基)，将式VII化合物与适量的合适的氧化剂反应
其中 R2、R3和R4具有上述含义，以及 R1’为卤代烷硫基。
如果在方法变体(a)中应用N-[3-氯-4-(4’-三氟甲硫基苯氧基)-苯基]-N’-甲基脲和氯甲酸异氰酸酯，反应流程可用下列反应式表示
如果在方法变体(b)中应用N-[3-乙氧基-4-(4’-三氟甲硫基苯氧基)-苯基]-硫脲和N-甲基-双-(氯甲酰)胺为原料，反应流程可用下列反应式表示
按方法(a)或(b)得到的通式I的化合物(其中R1表示卤代烷硫基，X表示0)可以按照方法变体(c)将其氧化为相应的卤代烷基亚硫酰基或卤代烷基磺酰基衍生物。如果用过氧化氢做氧化剂，该方法的流程可用下列反应式表示
在式I、II、IV、V、VI和VII中，R2、R3、R4、R6或A代表的烷基是直链的或支链的烷基，其优选具有1～6个，特别是1～4个碳原子。作为举例可提及的是任选取代的甲基、乙基、正丙基和异丙基以及正丁基、异丁基和叔丁基。
在式I、II、IV、V和VII中，R3、R4或A所代表的链烯基是直链的或支链的链烯基，其优选具有2～6个、特别是2～4个碳原子。作为举例可提及的是任选取代的乙烯基、丙烯-1-基、丙烯-2-基和丁烯-3-基。
在式I、II、IV、V和VII中，R3、R4或A所代表的炔基是直链的或支链的炔基，其优选具有2～6个、特别是2～4个碳原子。作为举例可提及的是任选取代的乙炔基、丙炔-1-基、丙炔-2-基和丁炔-3-基。
在式I、II、III、IV和VII中，R2或R5所代表的烷氧基是直链的或支链的烷氧基，其优选具有1～6个、特别是1～4个碳原子。作为举例可提及的是任选取代的甲氧基、乙氧基、正丙氧基和异丙氧基，以及正丁氧基和异丁氧基。
在式I、II、III、IV、V和VII中，R2、R5或Z所定义的卤素优选的是氟、氯、溴和碘，特别是氯和溴。
在式I、II、IV和VII中，R1所代表的卤代烷硫基优选的是具有1～4个、特别是1或2个碳原子，以及优选具有1～5个、特别是1～3个同一种或不同种的卤原子，其中的卤原子优选为氟、氯和溴，特别是氟和氯。作为举例可提及的是三氟甲硫基、一氯二氟甲硫基、溴代甲硫基、2，2，2-三氟乙硫基和五氟乙硫基。
在式I、II和IV中，R1所代表的卤代烷基亚硫酰基为卤代炔基亚硫酰基，其优选具有1～4个、特别是1或2个碳原子，以及优选具有1～5个，特别是1～3个同一种或不同种的卤原子，其中的卤原子优选为氟、氯和溴，特别是氟和氯。作为举例可提及的是三氟甲基亚硫酰基、一氯二氟甲基亚硫酰基、溴代甲基亚硫酰基、2，2，2-三氟乙基亚硫酰基和五氟乙基亚硫酰基。
在式I、II和IV中，R1所代表的卤代烷基磺酰基为卤代烷基磺酰基，其优选具有1～4个、特别是1～2个碳原子，以及优选具有1～5个，特别是1～3个同一种或不同的种卤原子，其中的卤原子优选为氟、氯和溴，特别是氟和氯。作为举例可提及的是三氟甲基磺酰基、一氯二氟甲基磺酰基、溴代甲基磺酰基、2，2，2-三氟乙基磺酰基和五氟乙基磺酰基。
在式I、II和IV中，R2所代表的任选取代的氨磺酰基优选的是下列基团中的一个 SO2NH2，SO2NH-CH3，SO2N(CH3)2，SO2NH-C2H5，SO2-N(C2H5)2，
在式III中，R5所代表的芳氧基优选表示单环的碳环芳氧基或双环的碳环芳氧基，特别是苯氧基。
在式III中，R5含义中的芳氧基优选表示苯氧基。对于那些用做原料的式II的大多数脲或硫脲迄今尚是未知的，但可通过下列已知的办法很方便地制取，即(a)或者取代的4-氨基二苯醚与相应的取代的异氰酸酯或取代的异硫氰酸酯在一种惰性溶剂中反应，温度控制在0℃～100℃；或者顺序颠倒，(b)将氨或取代的胺与相应取代的异氰酸酯二苯醚或4-异硫氰酸酯二苯醚在相同的条件下反应，或(c)在质子惰性的溶剂(如二甲亚砜，二甲基甲酰胺或六甲基磷酰三胺)中、在碱(如氢化钠、氢氧化钾、碳酸钾等)存在下，温度控制在20℃～150℃，使取代的4-羟基苯基脲或4-羟基苯基硫脲与活性的卤代芳族化合物反应。
在溶剂选择合适的情况下，在溶液冷却时反应产物通常会结晶出来。然而，这些脲类化合物也可按下面参考文献中的方法由胺和异氰酸酯来制取Methoden der Org.Chemie(Houben-Weyl)第IV版，第VIII卷，第157-158页。
某些能够按照本发明用于方法(b)的双(氯甲酰)-胺类是已知的(参见Synthesis 1970，第542～543页的文章)，那些迄今仍未知的化合物可以按类似方式由环二酰基二硫醚类化合物在惰性有机溶剂(优选四氯化碳)中进行氯化来制备。
用于式II的脲类或硫脲类化合物与式III所代表的羧酸异氰酸酯(方法变体(a))或与式VI所代表的双(氯甲酰)胺(方法变体(b))反应的可能的稀释剂以及用于式IV的1，3，5-三嗪衍生物与式A-Z的化合物反应的可能的稀释剂是所有对这些反应表现为惰性的有机溶剂。
除了吡啶，优选的还包括芳烃类化合物，例如苯，甲苯和二甲苯，卤代芳烃类化合物，如氯代苯和二氯代苯，以及醚类如四氢呋喃和二噁烷。
反应中可能生成的盐酸以气体的形式选出，或与有机的或无机的酸接受体结合。优选的这些酸类的接受体包括叔有机碱，如三烷基胺，例如三乙胺，芳族N-杂(单或双)环胺，例如单或双环吡啶氮杂环烷基胺，例如二氮杂双环壬烯，二氮杂双环十一碳烯等等，或无机碱，如碱金属的碳酸盐类，碱金属的氧化物类，碱金属的氢氧化物类，碱土金属的碳酸盐类，碱土金属的氧化物类或碱土金属的氢氧化物类。
上述反应步骤的反应温度可以在很大范围内变化。一般地，反应在约0℃到约150℃的温度下进行，优选的温度范围为约20℃～约100℃。
上述反应步骤可以在大气压下或在升高的压力下进行。一般地是在常压下进行。
按照方法变体(c)对通式(I)的三氟甲硫基化合物(其中Y代表生成相应的亚硫酰基或磺酰基化合物的氧)进行处理所用的氧化剂在各种情况下可以为H2O2/冰乙酸、H2O2/乙酸酐、H2O2/甲醇、过酸如间氯过苯甲酸、以及铬酸、高锰酸钾、高碘酸钠、铈(IV)铵的硝酸盐和硝酸。
式(Ia)化合物的制备方法详见EP A 170 316以及US4,631,278。这些化合物可以通过其中描述的方法来制备。
生成的式(I)或式(Ia)的化合物可例如通过与一种无机的或有机的碱进行反应转换为相应的加成盐。
当实施本发明时，可将三嗪酮类化合物配成所希望的任何一种剂型给动物施用。适于口服的配方为优选的，可以是溶液、悬浮液、片剂、胶囊、胶胨、乳膏、胶块土、或粉剂、颗粒剂或丸剂。其它的给药方式是非肠道途径施用、局部用药、肌内注射、黏膜内施用，或专业人员熟知的其它给药方式。以倾倒形式的局部给药同样是优选的。
治疗寄生原虫，特别是治疗新孢子虫属原虫，特别有效的方法是将式(I)和(Ia)的化合物与活的或死的疫苗联合起来使用。在这种情况下也观察到增效作用。
组合物和制剂是将这些成分在合适的设备(如搅拌器和其它合适的设备)中混合制备而成的。

具体实施例方式 通过下面的实施例对本发明进行更详细的描述，这些实施例是用来做说明的，而不是对本发明的限制。
实施例 犬新孢子虫感染 临床、镜检、免疫组化和分子生物学的参数是犬新孢子虫诊断及与刚地弓形虫鉴别的基础。临床上可见肢端麻痹和反复的经胎盘传染。镜检可从肌肉和神经组织中见到速殖子和包囊。仅在神经组织中可见少数囊壁明显增厚的包囊。在间接免疫荧光试验(IFAT)中检测细胞培养中产生的速殖子，滴度1∶200看作是特异性的。一旦出现临床症状，此滴度可上升到1∶20000。至于犬新孢子虫的分子生物学诊断，可通过I TS 1区(内转录间隔1区)的体外扩增快速而明确地作出判定(Holmdale和Mattsson 1996)。
体外测试体系的描述 VERO宿主细胞的培养 犬新孢子虫是一种专性的细胞内寄生虫。使用VERO细胞(非洲绿长尾猴的肾细胞，ATCC No.CCL 81 Vero)作为助剂能够在可标准化和确定的条件下培养此种寄生虫。Vero细胞生长在下列培养基中87％RPMI 1648(ICN，12-602-54)10％FCS(胎牛血清，ICN，29-101-49)1％200mM L-谷氨酰胺(ICN，15-801-13)1％碳酸氢钠(ICN，16-883-49)1％青霉素/链霉素(ICN，16-700-49)。用25cm2(Falcon，B 769031)和75cm2(Falcon，B 769051)组培瓶保持无菌培养并传代。在CO2孵箱(Heraeus)中使Vero细胞生长在37℃、5％CO2气体条件下，直到生成单一的细胞层。
ED细胞的培养 ED细胞(马皮细胞，ATTC No.CCL 57)生长在下列培养基中87％EMEM(ICN，12-106-54)10％FCS(胎牛血清，ICN，29-101-49)1％200mM L-谷氨酰胺(ICN，15-801-13)，1％NEA(非必须氨基酸，Gibco，11140-035)，1％青霉素/链霉素(ICN，16-700-49)。用25cm2(Falcon，B 769031)和75cm2(Falcon，B 769051)组培瓶保持无菌培养并传代。在孵箱(Hereus)中使ED细胞生长在37℃、无CO2气体的条件下，直到生成单一的细胞层。
细胞传代 当培养物形成了充分融合的细胞层后，将宿主细胞传代，即分布到新的细胞培养皿上。如果培养基含有10％FCS，每周须传代两次。首先将培养基轻轻倒出，用5ml胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)(ICN，16-891-49)洗涤细胞层，再加用5ml胰酶-EDTA，在37℃的CO2孵箱中培养5-10分钟，直到细胞从皿底部分开。将细胞的胰酶-EDTA悬液与1-2ml预热的FCS一起于1500r/min下离心5分钟(Varifuge3.0，Heraeus)。弃去上清液，将沉降物溶于15ml培养基中(92％RPMI1640，5％FCS，1％L-谷氨酰胺，1％碳酸氢钠，1％青霉素/链霉素)。对每一种组织培养都做3个新传代瓶，每个瓶内加5ml细胞悬液，即分配为1∶3。
细胞在液氮中的冷藏 将培养瓶中的细胞冷冻在C541培养基中(50％RPMI 1640，40％胎牛血清(FCS)，10％二甲基亚砜(DMSO，Merck 9578))，或冷冻在C2培养基(86％RPMI 1640，10％DMSO，2％FCS，1％L-谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素)中。事先用胰酶来处理细胞(见上述)，将分离的细胞离心，再悬浮于3ml的C541冷冻培养基或C2培养基中，再转移到2m l的冷冻管中。最终储藏在-196℃的液氮中，在这里细胞可以永久储藏。在最终储藏于液氮中之前，先将冷冻管放在一个壁厚1cm的Styropor盒中，使冷冻管及其内壁的细胞层慢慢地冷冻到-80℃。Styropor盒可使其内容物以每分钟1～2℃的速率持续降温，使细胞因渗透作用而失去了细胞内的水分。这一点对细胞的生命力是至关重要的。
冷冻细胞的解冻 从液氮中取出的冷冻管在37℃水浴上的解冻过程要尽可能地快。将细胞悬液吸到10ml的培养基中，然后分成相等的两份2只50ml组培瓶中。细胞培养条件为温度37℃和CO2浓度5％。24小时后，更换细胞培养基，以除掉存在于冷冻培养基中的DMSO。用犬新孢子虫感染细胞培养物 下列犬新孢子虫分离物用于感染细胞培养物NC-1(犬DUBEY的分离物，(1988))和NC Swe B-1/第9代(牛的分离物，瑞典国家兽医研究所，Uppsala，Sweden)。所用的感染物为液氮储存的感染细胞培养物(见上述)或感染的培养物的纯化的速殖子(见下)。
用Sephadex自细胞培养物中分离速殖子 在无菌条件下从感染的VERO单层细胞或ED单层细胞中纯化犬新孢子虫。首先，用一个小刮勺(Tec No Mara，3010)将感染的细胞培养物从组培瓶底部刮下来，再用一支23标号的套管(Luer 23 Gx1，0.6×25mm)将其吸到一只10ml的一次性注射器中。在此过程中宿主细胞和包含其中的组织包囊受到机械破坏。然后将细胞悬液1500r/min离心7分钟(Varifuge 3.0，Heraeus)，弃去上清液，将沉降物再悬浮于精确的2.5ml生理磷酸盐缓冲液中(PBS1mM PO4，12mMNaCl，0.87mM KCl，pH 7.4)。用Sephadex柱(PD-10TM/SephadexG-25M，Pharmacia Biotech，17-0851)做下一步纯化。先用25ml PBS使Sephadex柱平衡，按2.5ml PBS样品量装柱，然后用5ml PBS洗脱。速殖子在柱中迅速移动通过，并在前3ml洗脱液中发现，而高分子量的细胞碎片和细胞膜则从Sephadex柱中滞后洗脱出来。为除去不需要的细胞器和游离的宿主细胞DNA，将样品1500r/min离心7分钟，弃去上清液，用40ml PBS将沉降物洗涤3次。
用犬新孢子虫细胞培养物检测药物的作用 用96孔平板(Falcon 3872)检测药物的作用，因为该系统仅需要很少量的初始物(约1mg)。首先，在细胞培养平板上培养出细胞培养物的单层宿主细胞(VERO或ED)。为此需要2只50ml组培瓶(总的细胞培养面积为50cm2)，瓶中有长成的未感染的单层细胞。在CO2孵箱中于37℃用5ml胰酶-EDTA(Gibco，45300-019)将培养物的细胞层剥离。培养10分钟后，大部分细胞已经剥离。用一5ml吸管将细胞悬液移到一只预先已加有约1ml预热的胎牛血清的50ml离心管中(Greiner，B769331)。1500r/min(Varifuge 3.0，Heraeus)离心5分钟后，弃去上清液，将细胞饼再悬浮于100ml RPMI培养基中(95％RPMI 1640，2％FCS，1％L-谷氨酰胺，1％碳酸氢钠，1％青霉素/链霉素)。向96孔平板的每个孔中吸入150μl这种细胞悬液。100ml培养基足够填充6块微孔板。将载有细胞培养物的微孔板在37℃孵箱中(CO2浓度5％)培养24小时。然后用纯的犬新孢子虫速殖子以每个孔48000个速殖子的浓度感染培养的细胞，再在37℃孵箱中(CO2浓度5％)培养24小时。将试验药物称重放入1.5ml的Eppendorf反应管中，药物重为0.5-1.5mg。然后，按每mg药物加1ml DMSO的量吸入DMSO，这相当于将药物稀释成1×10-3g/ml。用于其余浓度稀释处理的培养基配方如下87％RPMI 1640，10％FCS，1％L-谷氨酰胺，1％碳酸氢钠，和1％青霉素/链霉素。在初筛时，用10ppm，25ppm和50ppm三个浓度。用犬新孢子虫感染后24小时，将稀释的药物加入细胞培养板中，每孔150μl。在第一排用未处理的培养基，这一排包括了感染的对照和未感染的对照。然后将细胞培养板在37℃和5％CO2环境下培养5天。在此期间，速殖子在宿主细胞内成倍增长，从而使单层细胞结构破坏。如果某种药物充分有效，速殖子被破坏，而单层细胞保留下来。通过蛋白结合试验(活细胞染色)可检测到完整的单层细胞。可用的一种方法是用0.25％结晶紫(Sigma C 3886)染色。染色前要用100μl PBS洗涤试验板，再用100μl甲醇固定。处理开始后4天及感染后5天25×10的放大倍数用倒置显微镜做镜检。按下列评价方案评价 评价可见的表象 0＝无效 单层细胞完全破坏 1＝效果弱单层细胞部分破坏，可见寄生虫群落 2＝充分有效 单层细胞未被破坏，见不到寄生虫的速殖子 T＝细胞毒性 细胞死亡，呈圆球状 表1托曲珠利在VERO细胞中对犬新孢子虫的作用 *100ml溶液中含有2.50g托曲珠利；30.00g三乙醇胺；80.70g聚乙二醇；将这三种成分简单地混合起来。
评价可见的表象 0＝无效 单层细胞完全破坏 1＝效果弱 单层细胞部分破坏，可见寄生虫群落 2＝充分有效 单层细胞未被破坏，见不到寄生虫的速殖子 T＝细胞毒性 细胞死亡，呈圆球状 II在体内的作用 有关药物在体内的作用的资料非常少，这是因为还有待于发展合适的体内试验方法。在实验感染的小鼠中，磺胺嘧啶(通过饮水服药)仅做预防性给药，即在感染之前给药才有效。在这种情况下不会发现寄生虫学的症状，从而预防了临床症状的发生。后期开始的治疗没有成功(Bjerkas等1984，Dubey等1988，Lindsay and Dubey 1989，Lindsay and Dubey 1990)。在犬中，用磺胺嘧啶和氯林肯霉素治疗只有一次是成功的，那次由于观察到神经根炎的临床症状因而治疗开始得及时从而取得成功。
小鼠试验模型描述 伯尔尼大学兽医和医学系寄生虫研究所的Simone Eperon博士和Bruno Gottstein教授受拜耳公司(BAYER AG)的委托设计并做了实验(Eperon等1999，Parasite Immunology 21225-236.) 小鼠 雌性Wt C57BL/6小鼠，处理时的年龄7.5周。
犬新孢子虫速殖子 犬新孢子虫速殖子用VERO细胞传代，通过色谱柱层析纯化，用灭菌的PBS缓冲液按2×106虫体/100μl的浓度制备成若干等份。用锥虫蓝活体染色表明97％的活的速殖子。
用做预防的药物(表2) 将纯净的托曲珠利活性化合物制成50mg/10ml水+100μl聚乙二醇的储备溶液。每次使用时每0.1ml这种溶液含有0.5mg纯的活性化合物。对一只20g重的小鼠，这相当于使用了25mg/kg的浓度。药物通过管饲法连续口服6天，相当于总投药量为150mg/鼠。
用2.5％托曲珠利配制的溶液(100ml溶液含有2.50g托曲珠利，30.00g三乙醇胺，80.70g聚乙二醇；将各种成分简单地混合在一起)用250ml水稀释6.25ml这种2.5％的溶液，其后连续6天通过饮水让实验小鼠服用这些药物。
感染 预防性给药后4小时，对每只小鼠用2×106虫体/100μl灭菌PBS进行感染。
处死实验动物 感染后14天，将实验小鼠用CO2处死。为保证用于评估的是随机序列(盲评)，将被处死小鼠随机编号。为获得血清，从心脏采血。仔细地将脑解剖出来，将其中一半储存于-80℃用于PCR分析。其余的用4％多聚甲醛/PBS固定用于免疫组织学研究(IFAT)。
结果 1.血清IgG(表3) 抗犬新孢子虫的免疫球蛋白G(IgG)总量按Eperon等报道的ELISA方法(Parasite Immunology 1999，21225-236)测定。将处理组与一组未感染的和一组感染的对照组的结果相比较。阳性对照小鼠先接种了犬新孢子虫速殖子的粗提物，再用106个犬新孢子虫速殖子感染。这种小鼠的犬新孢子虫特异性IgG效价特别高。
用托曲珠利(纯净的活性化合物)处理的小鼠比起感染的和未感染的对照组小鼠，其犬新孢子虫特异性IgG浓度降低。在用2.5％配制的托曲珠利溶液处理的小鼠(接近于未感染对照组的小鼠)，这个浓度明显的低。
2.PCR分析(表4) 从感染小鼠的脑组织中分离DNA，按Eperon等报道的方法(Parasite Immunology 1999，21225-236)做犬新孢子虫特异性聚合酶链式反应(PCR)。所有未感染小鼠的犬新孢子虫特异性PCR检测均为阴性。所有感染小鼠的犬新孢子虫特异性PCR检测均为阳性。用托曲珠利纯活性化合物做预防性给药处理的试验组小鼠中，4/7的小鼠表现为PCR检测阴性。用2.5％配制的托曲珠利溶液处理的所有小鼠，其PCR检测均为阴性。
3.免疫荧光试验(IFAT，表4) 将用多聚甲醛固定的脑组织样品包埋在石蜡中并脱水。做三套连续的矢状切片。一套切片用苏木精-曙红染色，另外两套用下列改进的Eperon等报道的方法做免疫荧光标记试验(Parasite Immunology1999，21225-236)第一种抗体为用含1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)按1∶400倍稀释的兔抗犬新孢子虫速殖子全虫多克隆抗体。第二种抗体为用含0.5％BSA的PBS按1∶100倍稀释的羊抗兔FITC标记的抗体。
在所有各组苏木精-曙红染色的切片中未见任何损伤或异常，因此用特异的犬新孢子虫抗体做免疫标记的方法被用来标记脑组织中寄生虫的各个虫期。在评估中研究了所有的切片。计数了寄生虫的所有各虫期，并用下列标准评价 (-)＝无速殖子 (+)＝少于10个速殖子 (++)＝10～200个速殖子 (+++)＝多于200个寄生虫 (+++)的情况仅在阳性对照中发现。阳性对照是剔除的变异体(μMT小鼠)，它不产生抗体，由于感染而在感染后的第31天死亡。所有未感染的小鼠的IFAT试验均为阴性。所有经托曲珠利治疗的试验组在IFAT试验中均为阴性。
表2托曲珠利对小鼠的抗犬新孢子虫的作用 p.i.＝感染后，p.o.＝口服，i.w.＝水溶液 表3单只小鼠血清中的抗犬新孢子虫IgG以及每个处理组血清IgG平均浓度
表4犬新孢子虫特异的PCR和IFAT试验 *小鼠号码是随机分配的以保证做出公正的评价；因此鼠号不是按逻辑顺序排列的。
权利要求
1.托曲珠利和朋那珠利在制备用于预防性治疗动物以抵抗犬新孢子虫的组合物中的用途。
2.托曲珠利和朋那珠利在制备与活疫苗或死疫苗一起使用来治疗动物以抵抗寄生原虫的组合物中的用途。
3.一种组合物，其含有选自托曲珠利和朋那珠利的三嗪酮类活性化合物以及活疫苗或死疫苗作为抵抗寄生原虫的组合产品。
全文摘要
本发明涉及三嗪酮类化合物，例如三嗪二酮和三嗪三酮类化合物，用于制备治疗，特别是预防性治疗动物以抵抗寄生原虫的药物的用途。本发明还涉及所述药物。
文档编号C07D253/06GK101632676SQ20091014269
公开日2010年1月27日 申请日期2000年11月21日 优先权日1999年12月3日
发明者G·格雷夫 申请人:拜尔公司