专利名称：肉孢子虫属、新孢子虫属(Neospora)和弓形虫属引起的疾病治疗用三嗪酮化合物的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及感染了会引起致流产性疾病或神经病学疾病的寄生虫的动物治疗用三嗪酮化合物。更具体地说，本发明涉及可用于治疗会引起致流产性疾病或神经病学疾病的球虫目等寄生性原生动物的三嗪酮化合物。
先有技术简述三嗪酮化合物例如三嗪二酮类如地克珠利化合物，和三嗪三酮类如托曲珠利化合物，已经用于处理和保护各种哺乳动物、昆虫和鱼类，以免患范围广泛的原生动物引起的疾病。见美国专利4,933,341；4,935,423；5,114,938；5,141,938；5,188,832；5,196,562；5,256,631和5,464,837。对这些化合物敏感的原生动物包括那些会感染鸟类、哺乳动物和昆虫的肠道并表现为腹泻、消瘦、恶心和呕吐的寄生虫。一般来说，三嗪酮的作用方式是攻击在内脏和肠壁细胞中发现的中间寄生阶段，引起该寄生虫的内质网、核周空间和线粒体溶胀。这有意地干扰了核分解能力，使Shinzonts和小配子母体依然很小，分别只能形成少数几个裂殖子和小配子。据报告，其最终结果是该寄生虫的这些稍后阶段丧失了穿透新哺乳动物细胞的能力，有效阻止了该寄生虫在宿主体内的复制。
这里特别关注的是，某些原生动物从1970年代以来就被怀疑会引起动物的神经病学疾病和/或致流产性疾病。其中一些原生动物的成功分离和离体培养证明是困难的。例如，直至1980年代后期，才实现从大脑或脑髓液中的成功分离。曾经有人认定感染大脑的寄生虫可能产生神经病学疾病，而感染胎儿则可能产生致流产性疾病，因而需要能穿透血-脑屏障和胎盘屏障又不产生有害副作用的有效抗原生动物药物。只有很少几种药物能通过动物的血-脑屏障或胎盘屏障。然而，能穿越血-脑屏障和/或胎盘屏障从而能有效治疗大脑的寄生虫感染的技术上已知药物中多数都有有害副作用，以致它们因风险大而无法使用。因此，迄今为止，尚无能为这样的神经病学疾病或致流产性疾病提供有效治疗的有效药物获得批准。以下是寄生虫性疾病的扼要描述。
马原生动物脑髓炎(EPM)是马的一种神经病学疾病，那些处于紧张状态的幼马(例如纯种赛马和纯种表演马)尤易患病，因而是一种对马行业有显著金钱冲击的疾病。1970年代首次承认为一种疾病的EPM，直到1991年才从患EPM的马培养出来，而且在此前一直起名为神经元肉孢子虫(Sarcocystis neurona)。1997年，从患EPM的马的大脑中分离出一个新孢子虫种(Neospora spp.)，现在定名为Neosporehugesi。因此，现在有人提出EPM可能是这种新认识的生物单独引起、神经元肉孢子虫单独引起或这两者组合引起的。EPM最通常导致不对称性运动失调(ataxia)、虚弱、和痉挛状态。这种疾病可能酷似几乎任何一种神经病学症状。它可能表现为极急性症状，也可能表现为慢性症状。慢性病形态往往发病时是隐蔽的，直至病程晚期都难以诊断，而且会导致死亡。在最轻微的情况下，唯一的临床征兆可能是不明显的下肢跛行或微不足道的呼吸噪音。在最严重的情况下，马不能吞咽或站立。现在已经知道，在最严重的情况下，神经元肉孢子虫等寄生虫会感染大脑并在那里产生显著损害。EPM的临床征兆是由寄生虫的直接神经元(大脑和脊髓)损害以及由中枢神经系统(CNS)中炎性细胞浸润、浮肿、和与裂殖子及子粘变体有关的神经元死亡造成的大脑损害引起的。当前，尚无任何经批准的有效处理或预防可用于EPM控制。已有人使用人类药物甲氧苄啶-磺酰胺合剂。然而，处理是昂贵的而且需要为数众多的重复剂量。
另一种球虫目寄生虫鼠弓形体(Toxoplasma gondii)已经知道了一段时间，而且首先是从猫的肠和肌肉组织中分离出来的。这种寄生虫的终局宿主是猫，猫能长时间隐匿该生物，把卵囊传播给其它动物，包括牛、羊、猪和人类。羊、牛和人类的感染是与流产和先天获得性疾病相联系的，主要影响中枢神经系统。最近，也已经把它同妊娠期间感染前呈血清阴性的受感染母猫的流产和所产小猫仔畸形相联系。非猫宿主例如牛、羊、猪和人类不产生卵囊，但会发展并可能蒙受速殖子和缓发性殖对肌肉与大脑的入侵，从而产生疾病的临床征兆-神经病学症状和流产与胎儿缺损。已有人报告说，60％的猫对鼠弓形体(T.gondii)是血清阳性的。对弓形体病来说，同样尚无经批准的治疗或预防药物。
还有另一种球虫目寄生虫犬新孢子虫(Neospora caninum)，会在动物中同时产生神经病学疾病的致流产性疾病。它是在1988年首次从狗分离出来的。人们以前曾把它同鼠弓形体(T.gondii)混为一谈。这种寄生虫引起的疾病在经胎盘感染的小狗中发生得最严重，其特征在于小狗、尤其其后肢的进行性上升性麻痹；多肌炎和肝炎也可能发生。最近，已经承认这种疾病是流产和新生幼仔中与神经病学相联系的肢体缺陷的一个主要原因。流产胎儿中非化脓性脑炎和心肌炎的微观损伤，可以在大脑、脊髓和心脏中看到。犬新孢子虫(N.caninum)的终局宿主，最近已确认是狗。目前，对于无论狗还是牛的犬新孢子虫或者马的Neospora hugesi，都还没有经批准的治疗或预防药物。
技术上已知的参考文献，包括以上引用的参考文献，都没有建议或教导三嗪酮化合物例如托曲珠利或托曲珠利砜(最近重新定名为泊那珠利“Ponazuril”)在感染了引起致流产性疾病或神经病学疾病的球虫目特别是肉孢子虫科球虫目的动物的治疗而不引起不可忍受的副作用方面的用途。因此，对于受表现为神经病学疾病或致流产性疾病的寄生虫病折磨的动物来说，需要一种改进的和完全的治疗。
发明概要1.按照以上所述，本发明涵盖一种患有对用三嗪酮化合物处理敏感的寄生虫性神经病学或致流产性疾病的患病动物的治疗性处理方法，包含对该动物给药某一医药上有效量的该化合物，其先决条件是当该疾病是神经元肉孢子虫病(S.neurona)时该化合物不是地克珠利或托曲珠利。这里使用的“医药上有效量”这一术语，系指三嗪酮的给药量高到足以抑制会产生神经病学疾病和/或流产的寄生性原生动物、典型地是球虫目的生物体内生长或离体生长。该药物上有效量能控制受感染组织中的寄生虫；结果，该动物的健康得到改善。
进而，本发明还涵盖一种感染了对用三嗪酮化合物处理敏感的、会引起神经病学疾病或致流产性疾病的寄生虫的动物的准预防性处理方法。该准预防性处理包含利用一种准预防性有效处理方案对该动物给药三嗪酮化合物。“准预防性有效处理方案”这一术语系指长期给药预定间歇剂量的三嗪酮化合物，直至所述动物能通过(例如)发展一种保护性免疫反应或以其它方式清除该寄生虫来克服入侵性寄生虫。典型地说，该处理方案就是能有效地控制该寄生虫和防止临床疾病征兆的方案。该准预防性有效剂量也可以在长达5年的长时期内或该动物的寿命期内给药，在该寄生虫难以控制的情况下尤其如此。对于准预防性处理来说，较好的三嗪酮化合物是三嗪三酮，包括但不限于托曲珠利，和泊那珠利。
此外，本发明也涵盖这些动物的单一高剂量处理。这种方法包含对患有对用三嗪酮处理敏感的寄生虫性神经病学疾病或致流产性疾病的患病动物给药-单一高剂量的医药上有效量三嗪酮化合物。“单一高剂量”这一术语系指只给药一次的数量。这一数量显著高于治疗性或准预防性处理采用的剂量数量；能有效地控制该致病寄生虫，而且这样也不会导致毒性等有害作用。因此，三嗪酮的单一高剂量大于10mg/kg。本发明的这一方面及其它方面在以下有更充分的描述。
本发明的详细说明如同以上所提出的，本发明涉及一种患有表现为对用三嗪酮化合物处理敏感的神经病学疾病或致流产性疾病的寄生虫病的受感染或患病动物的处理方法，包含对其给药医药上有效量的所述化合物。这些动物的说明性而非限制性实例可以是马、牛、猫、狗、猪、羊、鸟、昆虫和人类。感染或引起疾病的寄生虫是能表现为神经病学疾病或致流产性疾病的肉孢子虫科球虫目。其说明性而非限制性实例可以选自肉孢子虫种(Sarcocystis spp.)、新孢子虫种(Neospora spp.)和弓形虫种(Toxoplasms spp.)组成的一组。肉孢子虫科典型地选自神经元肉孢子虫(S.neurona)、N.hugesi、犬新孢子虫(N.caninum)和鼠弓形体(T.gondii)组成的一组。原生动物感染或疾病包括但不限于EPM、新孢子虫病、和弓形体病。
在本发明的实践中，这里所述的原生动物所引起的寄生虫感染或疾病的处理导致该神经病学疾病和致流产性疾病症状的缓解。一般来说，症状包括跛行、运动失调、麻痹、流产、新生儿虚弱及其它相关失调。对于治疗性处理来说，已经出现以上疾病征兆的动物要用该三嗪酮化合物处理。典型地说，处理持续时间是约28天～90天、较好约28天～60天。要理解的是，对于治疗性处理来说，处理方案可以是一天一次、一天两次或更多次、每隔一天一次或甚至每周一次，这取决于疾病的严重性和产生疾病的寄生虫类型等因素。然而，在一些情况下，处理方案可以无限地持续，有时要持续该动物的剩余生命期。在一种动物有更具抗性的寄生虫菌株感染的情况下，就会需要后一种处理。然而，该处理必要时可以延长更长的时期，直至该疾病征兆消除为止。较好的处理是在约28天内每天一次。
对于准预防性处理来说，受感染的动物要进行处理，以保护它们免于疾病的临床表现。这种处理最终导致该动物获得控制该寄生虫的能力，比方说，建立一种有效免疫反应使之能防护未来感染，而无需进一步给药三嗪酮化合物。按照本发明，该准预防活动系指按一种预定间歇式处理方案(准预防上有效的处理方案)使用该三嗪酮化合物来控制自以前处理以来可能已经感染该动物的原生动物。因此，实施准预防上有效的处理方案，是为了通过诸如杀死它们或减少其数目来降低其引起疾病的能力。实质上，该准预防上有效的处理方案可以在该动物的寿命期内大约每月实施一次，或实施直至该动物体内发展了一种固有清除机制例如一种有效免疫反应，以保护它免于未来感染。后一种情况会在5年或更短时间内发生。为了能够实现，要把该准预防性处理建立在如下认识基础之上当动物感染了这里所描述的原生动物时，直至经过了一段显著时间(例如感染后2～6个月)，它们才会出现临床征兆例如神经病学征兆或流产。成鲜明对照的是，肠道原生动物感染在感染后很快就会自我表现出来。按照本发明，准预防性处理防止该寄生虫自我建群和引起临床疾病。处理方案是按照大约每月一次、每两个月一次或每两周一次的间歇式时间表，以等效于约1.0～100mg/kg、较好约1.0～25mg/kg、更好约2.5～10mg/kg的剂量实施的。在特别抗性情况下(例如当一种动物感染了一种抗性菌株时)会需要高的剂量范围。所需要的剂量水平和处理持续时间，是有本门技术一般技能的人员的认识能力所及的。患有EPM的马或患有新孢子虫病的牛的较好处理方案是每28天约1.0～25mg/kg、更好约2.5～10mg/kg的三嗪三酮。
对于单一高剂量处理来说，三嗪酮是以10mg/kg以上且可高达约100mg/kg的医药上有效量给药的。本发明的一个独特特色是，本发明的化合物可以是无毒的，因而它们能以高剂量水平给药。高剂量给药的优点寓于如下事实不需要重复剂量，而且有一些三嗪酮化合物当以非常高剂量水平给药时会引起有害副作用。特别好的是泊那珠利(Ponazuril)，已经发现它以高达100mg/kg体重的剂量给药时是既安全又有效的。
无需受本发明的任何一种特定理论约束，相信这里所述处理的意外成功是由于该三嗪酮化合物穿越血-脑屏障或胎盘屏障的能力的结果。相信本发明化合物容易穿越血-脑屏障，而且也能穿透胎盘，并将大脑和脑髓液/脊髓中的原生动物就地杀灭。已经进一步发现，即使在这里所描述的单一高剂量处理方案所需要的高剂量时，这一类化合物也是无毒的和非致突变的。
此前，尚无成本有效的、容易给药的药物可用于有效地处理和防护这些疾病又不在动物中产生不可接受的副作用例如毒性或致突变性。以下是有特性的三嗪酮化合物的描述，但不限于托曲珠利(Toltrazuril)化合物。这一公开和提出了权利要求的专利也涵盖可以按照托曲珠利化合物的方式使用的其它三嗪酮化合物。这里可以使用的托曲珠利化合物有式(I) 式中R1代表卤代烷硫基、卤代烷亚磺酰基或卤代烷磺酰基，R2代表氢、烷基、烷氧基、烷氧烷基、烷基巯基、卤素、卤代烷基、或也可以有取代的氨磺酰基例如二烷基氨磺酰基，R3和R4可以相同或不同，代表氢、烷基、链烯基或链炔基，X是O或S，及其生理上可接受的盐。
进而，已经发现，具体地说，以下式Ia化合物及其生理上可接受的盐也可在此使用 式中RI代表卤代烷(C1-C4)硫基、卤代烷(C1-C4)亚磺酰基或卤代烷(C1-C4)磺酰基，RII代表氢、烷(C1-C4)基、烷(C1-C4)氧基、卤素、烷(C1-C4)氧烷(C1-C4)基、烷(C1-C4)基巯基、二烷(C1-C4)氨基磺酰基或卤代烷(C1-C4)基，和RIII和RIV可以相同或不同，代表氢、烷(C1-C4)基或链烯(C1-C4)基，且X是O或S。
最后，已发现(a)式(I)的1-(4-苯氧基苯基)-1，3，5-三嗪是当式(II)的化合物 式中R1、R2、R3和X的含义同上述，与式(III)的有取代羰基异氰酸酯 式中R5代表卤原子、烷氧基或芳氧基，反应，且这一程序期间所生成的式(IV)的有取代1，3，5-三嗪衍生物 式中R1、R2、R3和X的含义同上述，任选地进行分离和任选地与式(V)的化合物A—Z (V)式中A代表烷基、链烯基或链炔基，且Z代表卤素，反应时得到的；或(b)通式(I)的1-(4-苯氧基苯基)-1，3，5-三嗪衍生物是当式(II)的化合物，式中R1、R2、R3和X的含义同上述，与式(VI)的二(氯羰基)胺 式中R6代表烷基，任选地在酸受体的存在下反应时得到的；或(c)为了得到式(I)的化合物，式中取代基R2、R3和R4以及X的含义同上述，且R1代表卤代烷亚磺酰基或卤代烷磺酰基，使式(VII)的化合物 式中R2、R3和R4的含义同上述，且R1′代表卤代烷硫基，与适量的适用氧化剂反应。
如果在工艺变种(a)中使用N-〔3-氯-4-(4′-三氟甲硫基苯氧基)苯基〕-N′-甲基脲和氯羰基异氰酸酯，则反应进程可以用以下方程表示 如果在工艺变种(b)中使用N-〔3-乙氧基-4-(4′-三氟甲硫基苯氧基)苯基〕硫脲和N-甲基二(氯羰基)胺作为起始原料，则反应进程可以用以下方程表示 按照工艺变种(a)或(b)得到的通式(I)的化合物〔式中R1＝卤代烷硫基，X＝O〕可以按照工艺变种(c)氧化成卤代烷亚磺酰基或卤代烷磺酰基衍生物。如果使用过氧化氢作为氧化剂，则反应进程可以用以下方程表示 在式I、II、IV、V、VI和VII中，R2、R3、R4、R6或A中定义的烷基是较好有1～6个、尤其1～4个碳原子的直链或支链烷基。可以提到的实例是也可以有取代的甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基。
在式I、II、IV、V和VI中，R3、R4或A中定义的链烯基是较好有2～6个、尤其2～4个碳原子的直链或支链链烯基。可以提到的实例是也可以有取代的乙烯基、丙烯-1-基和丁烯-3-基。
在式I、II、IV、V和VII中，R3、R4或A中定义的链炔基是较好有2～6个、尤其2～4个碳原子的直链或支链链炔基。可以提到的实例是也可以有取代的乙炔基、丙炔-1-基和丁炔-3-基。
在式I、II、III、IV和VII中，R2或R5中定义的烷氧基是较好有1～6个、尤其1～4个碳原子的直链或支链烷氧基。可以提到的实例是也可以有取代的甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基和异丁氧基。
在式I、II、III、IV、V和VII中，R2、R5或Z中定义的卤素较好是氟、氯、溴和碘，特别是氯和溴。
在式I、II、IV和VII中，R1中定义的卤代烷硫基是较好有1～4个、尤其1或2个碳原子且较好有1～5个、尤其1～3个相同或不同卤素原子的卤代烷硫基，卤素原子较好是氟、氯和溴，特别是氟和氯。可以提到的实例是三氟甲硫基、氯二氟甲硫基、溴甲硫基、2，2，2-三氟乙硫基和五氟乙硫基。
在式I、II和IV中，R1中定义的卤代烷亚磺酰基是较好有1～4个、尤其1或2个碳原子且较好有1～5个、尤其1～3个相同或不同卤素原子的卤代烷亚磺酰基，卤素原子较好是氟、氯和溴，特别是氟和氯。可以提到的实例是三氟甲基亚磺酰基、氯二氟甲基亚磺酰基、溴甲基亚磺酰基、2，2，2-三氟乙基亚磺酰基和五氟乙基亚磺酰基。
在式I、II和IV中，R1中定义的卤代烷磺酰基是较好有1～4个、尤其1或2个碳原子且较好有1～5个、尤其1～3个相同或不同卤素原子的卤代烷磺酰基，卤素原子较好是氟、氯和溴、特别是氟和氯。可以提到的实例是三氟甲基磺酰基、氯二氟甲基磺酰基、溴甲基磺酰基、2，2，2-三氟乙基磺酰基和五氟乙基磺酰基。
在式I、II和IV中，R2中定义的也可以有取代的氨基磺酰基较好是下列基团之一SO2NH2，SO2NH—CH3，SO2N(CH3)2，SO2NH—C2H5，SO2—N(C2H5)2， 在式III中，R5中定义的芳氧基较好是单环型碳环芳氧基或双环型碳环芳氧基，尤其是苯氧基。
在式III中，芳氧基R5较好是苯氧基。
用来作为起始原料的式II的有取代脲或硫脲大多数是此前尚不知道的，但它们可以用本身已知的方法容易地制备，即(a)要么使有取代的4-氨基苯基醚与对应有取代异氰酸酯或异硫氰酸酯在惰性溶剂中0℃～100℃之间的温度反应，要么把顺序颠倒过来；(b)使氨或有取代的胺与对应有取代异氰酸酯根合或4-异硫氰酸根合二苯醚在相同条件下互相反应；或(c)使有取代的4-羟基苯基-脲或硫脲与活化卤代芳香族化合物在对质子惰性的溶剂例如二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或六甲基磷三酰胺中，在碱例如氢化钠、氢氧化钾、碳酸钾z.a.m.的存在下，在20℃～150℃之间的温度，发生缩合反应。
当适当选择溶剂量时，反应产物一般都在溶液冷却时结晶出来。从胺和异氰酸酯进行的脲的备选制备文献是Methoden der Org.Chemie(有机化学方法)(Houben-Weyl)，第四版第8卷第157-158页。
按照本发明可用于工艺(b)中的通式(VI)的二(氯羰基)胺有一些是已经知道的(比较《合成1970》第542-543页的文章)。而且如果它们是尚未知道的，则它们可以以类似方式从环状二酰基二硫化物和在惰性有机溶剂较好四氯化碳中氯化来制备。
式II的脲或硫脲与式III的羰基异氰酸酯的反应(工艺变种a)和与式VI的二(氯羰基)胺的反应(工艺变种b)以及式IV的1，3，5-三嗪衍生物与式A-Z的化合物的反应的可能稀释剂，都是在这些反应中惰性的有机溶剂。
这些除吡啶外较好还包括芳烃例如苯、甲苯和二甲苯，卤代芳烃例如氯苯和二氯苯，和醚例如四氢呋喃和二噁烷。
反应期间可能生成的盐酸可以作为气体逸出，也可以用有机的或无机的酸受体结合。该酸受体较好包括三级有机碱例如三烷胺如三乙胺，N-杂单环型或双环型芳香族胺例如吡啶，单环型或双环型氮杂环烷基胺例如二氮杂双环壬烯、二氮杂双环十一烯和很多其它有机碱，或无机碱例如碱金属碳酸盐、氧化物或氢氧化物，或者碱土金属碳酸盐、氧化物或氢氧化物。
上述各反应阶段的反应温度可以在广阔范围内变化。一般来说，反应是在约0℃～约150℃之间、较好在约20℃～约100℃之间进行的。
在上述各反应阶段，反应可以在常压下也可以在高压下进行。一般来说，反应是在常压下进行的。
通式(I)的三氟甲硫基化合物〔式中Y代表氧〕按照工艺变种(c)向对应亚磺酰基或磺酰基化合物转化的可能氧化剂，适当地是H2O2/冰乙酸；H2O2/乙酸酐；H2O2/甲醇；过酸，例如间氯过苯甲酸、和铬酸；高锰酸钾；过碘酸钠，硝酸铈铵；和硝酸。
所得到的化合物可以诸如通过使之与一种无机碱或有机碱反应而转化成一种对应的加成盐。
在本发明的实践中，该三嗪酮化合物可以以任何一种方便对动物给药的方式制成配方。这里较好的、适用于经口给药的配方可以是悬浮液剂、片剂、胶囊剂、凝胶剂、膏剂、大丸剂、或呈粉末、造粒、或切粒形式的制剂。较好的经口给药配方呈膏状物或饲料添加剂形式。可以采用的其它给药方式包括非经肠给药、局部给药、经肌内给药、经粘膜内给药或经熟悉本门技术的人员已知的其它途径给药。呈灌注(pour-on)形式的局部给药也是较好的。
典型地说，这些配方中采用了医药上可接受的载体和佐药。其实例可以是一种从下列组成的一组中选择的增稠剂Carbopol，无机增稠剂例如硅酸盐、膨润土或胶体状二氧化硅，和有机增稠剂例如脂肪醇或脂肪酸酯；且润湿剂选自聚乙二醇和有Carbopol的硫酸月桂酯钠组成的一组，更具体地说，Carbopol 974P是这里较好的膏状配方的最好增稠剂。这里也采用的是从对羟基苯甲酸酯(parabens)、醇类和醛类组成的一组中选择的防腐剂。这些可以是液态、固态或气态材料，要不然是惰性或医药上可接受的而且是与有效成分兼容的。
令人惊讶的是，按照本发明的膏剂当用于处理寄生虫时是有效的。更具体地说，令人惊讶的是，本发明的膏剂能有效地输送该三嗪酮类尤其托曲珠利和泊那珠利穿透血-脑屏障或胎盘屏障，并攻击已经入侵大脑或感染妊娠动物的胎儿的寄生虫。为便于理解，这里提供了关于这里较好的膏剂的一个具体实施方案及其如何制备的描述。按照本发明，一种较好膏剂含有三嗪三酮(例如泊那珠利)、丙二醇、增稠剂(例如Carbopol)、防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)和水的超微细化悬浮液。它可以通过合并水(典型地是纯化水)和丙二醇、把该组合物加热到约70℃并在此温度添加防腐剂来制作。所得到的混合物冷却到室温，然后添加Carbopol，较好呈Carbopol974P形式。最后添加该三嗪三酮。充分混合后，用氢氧化钠把pH调整到大约6.0。最好的膏剂包括15％(重量)泊那珠利、20％(重量)丙二醇、0.5％(重量)Carbopol 974P、0.14％(重量)对羟基苯甲酸甲酯、0.02％(重量)对羟基苯甲酸丙酯、0.1％(重量)氢氧化钠、其余是纯化水。可以添加增甜剂，包括右旋糖、蔗糖、乳糖、果糖、山梨糖醇、木糖醇、人造增甜剂和糖蜜，以改善适口性。此外，为了相同目的，还可以添加酵母或肝调味剂。
以下说明性但非限制性实施例进一步说明本发明。
实施例实施例1用马进行了药物动力学研究，比较了托曲珠利单一剂量给药后不同时间托曲珠利、泊那珠利和托曲珠利亚砜的血液水平。所有马匹都接受了10mg/kg的单一剂量，这是以悬浮液剂形式经口给药的。血样是在处理时间(0)和处理后0.25、0.5、1、2、4、6、12、24、48和72小时抽取的。采样结果列于表1中。令人惊讶的是注意到，接受托曲珠利的马匹显示其血清中相对高水平的泊那珠利。此外，在其血流中发现显著水平的托曲珠利亚矾。这表明，泊那珠利单独就会产生预期能通过血-脑屏障的可接受血液水平，即处理神经病学疾病例如神经元肉孢子虫(S.neurona)、鼠弓形体(T.gondii)、犬新孢子虫(N，caninum)和N.heugesi引起的疾病所需要的一个特征。表1马中托曲珠利单一剂量药物动力学
实施例2泊那珠利，即1-甲基-3-〔4-对(三氟甲基磺酰基)苯氧基〕间甲苯基-s-三嗪-2，4，6-(1H，3H，5H)三酮—一种代表性三嗪三酮，配制成一种对马给药的膏剂配方。将表2中所列成分用于制备配方如下。
表2泊那珠利马用膏剂成分
NF＝美国国家药典这些配方用工艺(A)和(B)配制如下。第一工艺(A)包含1)部分水与丙二醇混合；2)加防腐剂(对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)；3)徐徐添加Carbopol 974P，直至制成均匀悬浮液；4)添加微细粉末形式的泊那珠利；5)添加氢氧化钠，使该悬浮液达到约6.0的pH；和6)添加其余水至足量体积。最终悬浮液呈可以对马经口输送的膏剂形式。
第二工艺(B)包含1)部分水与丙二醇混合；2)加热到70℃；3)在该溶液保持在70℃的同时添加防腐剂(对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)；4)把该溶液冷却到室温；5)徐徐添加Carbopol 974P直至制成均匀悬浮液；6)添加微细粉末形式的泊那珠利；7)添加氢氧化钠，使该悬浮液达到约6.0的pH；和8)添加其余水至足量体积。最终悬浮液也呈可以对马经口输送的膏剂形式。
所得到的膏剂对马给药，并发现是爽口的和容易接受的。
实施例3泊那珠利，即1-甲基-3-〔4-对(三氟甲基磺酰基)苯氧基〕间甲苯基-s-三嗪-2，4，6-(1H，3H，5H)三酮—一种代表性三嗪三酮进行了其处理已经显示出马原生动物脑髓炎(EPM)征兆的马匹的能力试验。像实施例1中那样，把该化合物配制成一种以泊那珠利作为15％有效成分(a.i.)的膏剂。在28天内一天一次以2.5～10mg/kg之间的剂量率，将其对已经诊断患有EPM的马匹给药。
通过征兆与实验室诊断，很好地表征了自然存在的EPM临床案例。用来将EPM-阳性马并入这一试验的诊断如下证实用标准化神经病学考察所确定的不对称神经病学缺陷，包括放射照相法，EPM提示；神经元肉孢子虫IgG的阳性Western斑点；红血细胞计数低于500细胞/mL；CSF指数-总蛋白质＜90，IgG指数＞0.3，AQ商＜2.2。
进一步要求是这些马匹不患有除EPM外的疾病。因此，它们必须符合下列基准对EHV-1的阴性CSF(＜1∶4)；维生素E的正常血清值(2.0μg/mL)；无癫痫发作病症；无行为失调。
经诊断的马匹随机分组。第1组马每日以5mg/kg的剂量率接受该膏状配方，而第2组马每日以10mg/kg的剂量率接受该膏状配方。处理剂量是以体重为基准的。为了确定处理是确实有效的，在为期90天(处理中断后约60天)内评估了这些马。对处理的响应用以下体系评分1)0＝完全成功，临床正常，CSF阴性；2)1＝刚能检测出缺陷，步态正常；3)2＝容易检测出缺陷，并因后退、转弯、摇摆、颌腰压和伸颈而加剧；4)3＝步行、面部扭转、腰压或伸颈时缺陷非常显著；5)4＝自发地蹒跚、颠踬和跌倒；6)5＝斜卧时起不来。分数上-(1)个单位的改善就认为是显著改善。
这项研究的结果列于表3中。处理了28天的10mg/kg组的马匹全部(100％)到泊那珠利处理开始(第0天)后第90天显示临床分数显著改善。以5mg/kg剂量处理的9匹马中有8匹(88.9％)显示出可接受的改善。当把每个处理日每一组的分数全部加和时，得到一个总分。第1组马和第2组马所显示的总分改善均大约相当。因此，结论是，泊那珠利无论以5mg/kg还是10mg/kg剂量率对于马中EPM的积极处理都是有效的。
表3感染了EPM的马对用托曲珠利砜处理的响应
实施例4为了确定泊那珠利所提供的保护范围，进行了离体试验。下列寄生虫菌株进行了它们对这种化合物的敏感性评估神经元肉孢子虫的SN3株；镰状肉孢子虫的SF1株；鼠弓形虫的RH株；和犬新孢子虫的NC-1株。泊那珠利是以2个浓度(1μg/mL和10μg/mL)试验的。
牛鼻甲骨(BT)细胞用于进行所有离体研究。细胞在25cm2烧瓶中用RMPI1640培养基生长到合生，该培养基补加了10％(体积)胎牛血清(FBS)、100单位青霉素(G/mL)、100mg链霉素/mL和5×10-2mM 2-巯基乙醇。得到细胞合生后，把细胞保持在有较少FBS(2％体积)的相同培养基中。细胞培养物在含有5％二氧化碳和95％空气的增湿气氛中于37℃温育。
为了寄生虫的生长，让BT细胞单层感染寄生虫，并采用反向显微镜考察病灶(细胞致病作用“CPE”)的发展和很多细胞内裂殖子的存在。一旦观察到病灶、或有很多细胞内寄生虫存在，就用一支5mL移液管的尖端摩擦该单层，并将1～3滴含有裂殖子的流体转移到2个新鲜BT细胞烧瓶中。神经元肉孢子虫和镰状肉孢子虫的裂殖子每5～10天以这种方式过一遍，而鼠弓形体和犬新孢子虫的速殖子每3～4天以这种方式过一遍。
用来确定泊那珠利的有效性的试验是微滴单层破裂试验(MMDA)。用这种试验来确定该寄生虫或化合物对BT细胞是否有毒。平底96孔微滴板用BT细胞温育，所得到的单层用来确定托曲珠利和泊那珠利对以CPE量度的裂殖子生产(斑点形成)的影响。各单层与寄生虫一起温育(神经元肉孢子虫或镰状肉孢子虫以50,000/孔的计数，鼠弓形体以10,000/孔的水平，犬新孢子虫以20,000/孔的水平培养)。所有孔都在感染后2小时与试验化合物一起培养。未处理的和未感染的单层孔用来作为寄生虫对照，而未感染的药剂处理BT细胞用来作为毒性对照。每个处理都以6次重复进行考察。每个孔每日用目测法监测，当未处理裂殖子感染细胞的90～100％溶解(90～100％CPE)时停止试验。试板的所有孔都用磷酸盐缓冲食盐水(PBS)漂洗，用100％甲醇固定5分钟，然后用结晶紫溶液将其染色。裂殖子诱发破坏或BT细胞因毒性而死亡的区域不摄取结晶紫。用一台ELISA试板阅读器来定量结晶紫结合量，用这些数据确定泊那珠利使破坏作用抑制50％的浓度(抑制浓度50或IC50)。显示抑制作用的数据列于表4中。要说明的是，低达1μg/mL的泊那珠利就提供了对犬新孢子虫、鼠弓形体和镰状肉孢子虫所产生的细胞破坏的100％抑制。而需要10μg/mL的泊那珠利才会产生对神经元肉孢子虫所引起细胞破坏的100％抑制。这表明，托曲珠利和泊那珠利等三嗪酮能有效地治疗球虫目所引起、已知与神经病学的和致流产的疾病症状相联系的疾病，其中包括神经元肉孢子虫、犬新孢子虫、N.hugesi和鼠弓形体所引起的疾病。此外，泊那珠利对BT细胞是无毒的。
表4关于泊那珠利的离体试验数据
实施例5进行本实验是为了确定托曲珠利等三嗪酮是否能通过血脑屏障。把正常的马分成三组，每组三匹马。第1组马接受以5％悬浮液剂经口给药、剂量水平为2.5mg/kg的托曲珠利。第2组马接受以5％悬浮液剂经口给药、剂量水平为5.0mg/kg的托曲珠利。第3组马接受以5％悬浮液剂经口给药、剂量水平为7.5mg/kg的托曲珠利。10天内每天一次重复以上给药。在48小时、96小时和240小时抽取血样，测定血清中托曲珠利、托曲珠利亚砜和泊那珠利的浓度。处理开始后10天(第10天)，抽取每匹马的脑髓液样品，再次测定这些样品中托曲珠利、托曲珠利亚砜和泊那珠利的浓度。血清中和脑髓液中托曲珠利、托曲珠利亚砜和泊那珠利的浓度报告于表5a和5b中。马匹用托曲珠利处理后血液和脑髓液中泊那珠利的浓度是显著的，这在于马匹用托曲珠利处理后脑髓液中泊那珠利的浓度基本上等效于托曲珠利本身的浓度。这就是托曲珠利和泊那珠利都能有效地穿越血-脑屏障而且泊那珠利比托曲珠利更有效地穿越这个屏障的证据。对于熟悉本门技术的人员来说，这些数据表明三嗪酮也能有效地穿越胎盘屏障。
表5a马匹中托曲珠利重复给药后的药物水平
表5b马匹中托曲珠利重复给药后的药物水平
尽管上文中为了说明之目的详细描述了本发明，但要理解的是，这样的细节仅仅是为了该目的而已，除可能受到权利要求书的限定外，只要不背离本发明的精神和范围，熟悉本门技术的人员可以对其做各种改变。
权利要求
1.患有对用三嗪酮化合物处理敏感的寄生虫性神经病学疾病或致流产疾病的患病动物的一种治疗性处理方法，包含对该动物给药某一医药上有效量的该化合物，其先决条件是，当该疾病是神经元肉孢子虫病(Sarcocystis neurona)时该化合物不是地克珠利或托曲珠利。
2.权利要求1的方法，其中，该寄生虫疾病是球虫目引起的。
3.权利要求2的方法，其中，该球虫目是肉孢子虫科的一员。
4.权利要求3的方法，其中，肉孢子虫科的一员是从肉孢子虫属、新孢子虫属和弓形体(虫)属组成的一组中选择的。
5.权利要求4的方法，其中，肉孢子虫属选自各肉孢子虫种组成的一组，新孢子虫属选自各新孢子虫种组成的一组，弓形体属选自各弓形虫种组成的一组。
6.权利要求5的方法，其中，该肉孢子虫种是神经元肉孢子虫，该新孢子虫种是犬新孢子虫或Neospora hugesi，弓形虫种是鼠弓形体。
7.权利要求4的方法，其中，该肉孢子虫属是引起马原生动物脑髓炎(EPM)的神经元肉孢子虫。
8.权利要求4的方法，其中，该新孢子虫属是引起牛或狗新孢子虫病的犬新孢子虫。
9.权利要求4的方法，其中，该弓形体是鼠弓形体。
10.感染了一种成为对用三嗪酮化合物处理敏感的神经病学疾病或致流产疾病的病因剂的寄生虫的动物的准预防性处理方法，包含对其给药某一准预防有效量的所述三嗪酮。
11.权利要求1或权利要求10的方法，其中，该三嗪酮化合物选自托曲珠利、泊那珠利和地克珠利组成的一组。
12.权利要求1或权利要求10的方法，其中，该三嗪酮化合物是泊那珠利。
13.权利要求1或权利要求10的方法，其中，该三嗪酮化合物是以两次或更多次重复剂量给药的。
14.权利要求13的方法，其中，该重复剂量是以1.0～100mg/kg的数量给药的。
15.权利要求10的方法，其中，该三嗪酮化合物给药直至该动物发展了保护性免疫为止。
16.权利要求1或权利要求10的方法，其中，该三嗪酮是以2.5mg/kg～10mg/kg之间的数量给药的。
17.权利要求16的方法，其中，该三嗪酮是托曲珠利或泊那珠利。
18.权利要求1的方法，其中，该三嗪酮化合物是以大于10mg/kg的单一高剂量给药的。
19.权利要求8的方法，其中，该三嗪酮化合物是以重复的周期性剂量处理方案给药的，直至建立了免疫学保护为止。
20.权利要求1的方法，其中，该三嗪酮化合物是以为期28天、每天2.5mg/kg～10mg/kg的处理方案给药的。
21.一种治疗组合物，包含(a)旨在处理对其敏感的患病动物的医药上有效量的三嗪酮化合物，(b)载体，和(c)也可以有的助剂。
22.权利要求21的组合物，呈膏剂形式。
23.马原生动物脑髓炎(EPM)的处理方法，包含对怀疑患有EPM的马匹给药某一治疗有效量的一种或多种三嗪二酮。
24.权利要求23的方法，其中，该三嗪二酮是地克珠利。
25.权利要求23的方法，其中，该马是一种马。
全文摘要
这里公开的是易患或已患寄生虫性神经病学疾病或致流产疾病例如肉孢子虫病(Sarcocystidiae)或弓形体病(Toxoplasmosis)的受感染动物的治疗性或准预防性处理方法,该疾病可用三嗪酮化合物类处理,即向其给药某一医药上有效量的该化合物,包括单一高剂量治疗性处理。
文档编号A61P25/00GK1331595SQ99815013
公开日2002年1月16日 申请日期1999年12月17日 优先权日1998年12月22日
发明者T·J·肯尼迪 申请人:美国拜尔公司