专利名称：抗原生动物的皂角苷类的制作方法
技术领域：
本发明是关于从紫金牛(Myrsinaceae)科植物中分离抗原生动物皂角苷类的方法及该皂角苷类制备药物的用途，该药物用于治疗感染利什曼原虫属原生动物寄生虫的宿主(人类及动物)，及减轻该宿主中利什曼原虫病的临床表现形式及治愈利什曼原虫病。
利什曼原虫病有许多不同的疾病表现形式，其严重性及对健康的影响显著不同。首先，利什曼原虫病是一种由许多种利什曼原虫中的任何一种引起的衰弱症状，可经许多种沙蚊传染。利什曼原虫病很多且对大众健康的重要性远超过人们先前的认知。要控制利什曼原虫的感染非常复杂，因为许多种类的沙蚊是可能的传染媒介，而许多动物都可作储病媒的宿主，所以诊断方法(临床、血清、寄生虫诊断)的诊断价值往往无效或只能有限度的接受。
利什曼原虫病的表现形式可为内脏型、粘液皮肤型及/或皮肤型，感染生物体的菌株及宿主的免疫状态均可影响寄生虫疾病的临床表现形式及结果。治疗利什曼原虫病须要复杂及长期的全身的治疗。治疗的目的是治愈人类或动物病患细胞内的寄生虫感染，预防旧病复发，避开不反应性的发生及使住院及总治疗费用降至最小。为达此目的，必须在适当的期间投用适当剂量含量及频率的适当药物。虽然努力的寻找有效的及耐受性良好的抗利什曼原虫的药剂，仅发现少数药剂可用于病人。目前有两种五价的锑化合物可经深部肌肉内注射投用，通常用作为第一线的药物；葡萄糖甲胺锑酸盐(GlucantimTM，Farmitalia)及葡萄糖酸锑钠(PentostamTM，Wellcome)。第二线的药物是两性霉素(amphothericin)-B(尤其是微脂粒的调制剂)、戊脒及别嘌呤醇。现行的治疗效果不佳且会对病人引起毒性副作用。此外，其活性范围不广。因此仍须要新颖的药物。本文确认的新颖的活性成分可用于治疗利什曼原虫属的原生动物寄生虫引起的病症。
出乎意料地，分离自紫金牛杜茎山(Maesa)属的顶花杜茎山(Maesa balansae)及兰赛兰特杜茎山(M.Lanceolata)植物的三萜烯皂角苷类具有强大预防及治疗利什曼原虫的效用。
本发明是关于从紫金牛科植物中分离出三萜烯皂角苷类的方法，其中该方法包含以下的步骤(a)用非极性溶剂从干燥的植物部份中去除非极性物质，(b)用醇类萃取所述植物部份，及(c)在醇类萃取物中用液-液萃取、过滤及色层分析法进一步的纯化皂角苷类。
特定言之，非极性溶剂为卤化烃，例如二氯甲烷或氯仿；而醇类则为甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇，各视需要地与水预混合。特别适用者为甲醇∶水(90∶10)混合物或乙醇∶水(70∶30)混合物以供分离内含皂角苷类的级份。
醇类萃取物内的皂角苷类可用以下的方法进一步的纯化(c1)蒸发干燥萃取物，(c2)用丁醇及水分配残余物，(c3)蒸发干燥有机层，(c4)在酮类中清洗残余物，以及(c5)过滤粗皂角苷混合物。
于步骤(c2)中，水层以用正丁醇萃取数次较佳。
本发明也关于另一种从紫金牛科植物分离三萜烯皂角苷类的方法，其中该方法包含以下的步骤(a)用醇类萃取干燥的植物部份以及浓缩萃取物，(b)从萃取物中用非极性溶剂进行液-液萃取法去除非极性级份，及(c)进一步的用液-液萃取、过滤及色层分析法纯化醇类萃取物中的皂角苷类。
特定的醇类为甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇，各视需要地与水混合，较佳者为乙醇∶水(70∶30)混合物；非极性溶剂为烃，例如己烷。
醇类萃取物中的皂角苷类可进一步的用以下的方法纯化(c6)用以水饱和的丁醇来萃取水溶性级份，(c7)蒸发干燥有机层，(c8)在酮类中清洗残余物，以及(c9)过滤粗皂角苷混合物，于步骤(c6)中，水层以用正丁醇萃取数次较佳。
当从杜茎山属植物中分离皂角苷类时，色层分析法可包含使用以下梯度洗脱液系统的反相液相色层分析法A0.5％乙酸铵水溶液B甲醇C乙腈其中在t＝0时，(A∶B∶C)＝(60∶20∶20)及在t＝结束时，(A∶B∶C)＝(0∶50∶50)，或使用硅胶的正相液相色层分析法。
此类方法产生的混合物基本上是由皂角苷类组成。实验部份中描述的许多药理实验是用此皂角苷类混合物。为了区别其构造，将此混合物用描述于实验部份的HPLC方法分离成个别的成分。
因此本发明也关于以本文描述的方法得到的一种或多种三萜烯皂角苷类的混合物或分离产物。
特定而言，本发明是关于得自杜茎山属的三萜烯皂角苷类，其是用以下的梯度洗脱液系统的色层分析法包含反相液相色层分析法加以分离A0.5％乙酸铵水溶液B甲醇C乙腈其中在t＝0时，(A∶B∶C)＝(60∶20∶20)及在t结束时，(A∶B∶C)＝(0∶50∶50)，且其中该皂角苷具有以下的特性化合物1MW＝1532，λmax＝228.6毫微米，λmax2＝273.3毫微米；tR＝8.97化合物2MW＝1510，λmax＝223.9毫微米，λmax2＝274.5毫微米；tR＝9.39化合物3MW＝1532，λmax＝279.2毫微米，λmax2＝223.9毫微米；tR＝9.68化合物4MW＝1510，λmax＝280.4毫微米，λmax2＝222.7毫微米；tR＝10.09化合物5MW＝1574，λmax＝276.8毫微米，λmax2＝225.0毫微米；tR＝10.87；及化合物6MW＝1552，λmax＝279.2毫微米，λmax2＝223.9毫微米；tR＝11.37。
相对保留时间tR为使用Hypersil BDS C-18，3微米，100×4毫米的管柱时与尿嘧啶保留时间的比值，其是为10次测量的平均值。
具体地说，本发明是关于三萜烯皂角苷类，其分子式为 其中R2为-O(C＝O)C6H5或-O(C＝O)C(CH3)＝CHCH3，R3为(E)或(Z)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，及R4为氢或-(C＝O)CH3；更明确的说，在化合物1中，R2为-O(C＝O)C6H5，R3为(Z)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4为氢；在化合物2中，R2为-O(C＝O)C(CH3)＝CHCH3、R3为(Z)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4为氢；在化合物3中，R2为-O(C＝O)C6H5，R3为(E)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4为氢；在化合物4中，R2为-O(C＝O)C(CH3)＝CHCH3、
R3为(E)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4为氢；在化合物5中，R2为-O(C＝O)C6H5，R3为(E)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4为-(C＝O)CH3；在化合物6中，R2为-O(C＝O)C(CH3)＝CHCH3、R3为(E)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4为-(C＝O)CH3；用于本发明药物组合物及治疗方法中的较佳化合物为本发明的化合物3及4，尤其是化合物3。
明确的说，本发明是关于使用一种或多种三萜烯皂角苷类于制备药物组合物的用途，该药物组合物用以治疗被利什曼原虫品系感染的宿主的利什曼原虫病，其中皂角苷的分子式为(I) 其立体异构物形式或其医药学上可接受的加成盐，其中R1为氢、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基、经苯基取代的-(C＝O)C2-5烯基、单糖类基团或寡糖类基团；R2为氢、羟基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、-O(C＝O)C6H5、或经苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R3为氢、羟基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、-O(C＝O)C6H5、或经苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R4为氢、C1-6烷基、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基、-(C＝O)C6H5、或经苯基取代的-(C＝O)C2-5烯基；R5为CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、COOH；或R5及R2形成式-C(＝O)-O-的二价基；R6及R7为氢；或共同形成一条键；或R5及R6形成下式的二价基-CH2-O- (a)，-CH(OR13)-O-(b)，-C(＝O)-O-(c)，其中R13为氢，C1-6烷基或-(C＝O)C1-5烷基R8α及R8β是各自独立为CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、CH(OCH3)2、CH＝NOH、COOH；或R8β及R3形成式-C(＝O)-O-的二价基；或R8β及R5形成式-CH2O-CHOH的二价基；R9为CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、COOH；R10为CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、COOH；R11为氢、羟基或O-C(＝O)C1-5烷基；或R10及R11形成二价的式-CH2O-基；及R12为CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、CH＝NOH、或COOH。
较佳的式(1)化合物中R1为氢、-(C＝O)C1-5烷基、或寡糖类基团；R3为氢、羟基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、经苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R4为氢、C1-6烷基、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基；R5为CH2OH、CH2O-C(＝O)CH3、CHO；及R6及R7共同形成一条键；或R5及R6形成下式的二价基-CH2-O- (a)，-CH(OR13)-O-(b)，-C(＝O)-O- (c)，其中R13为氢，C1-6烷基或-(C＝O)C1-5烷基；及
R7为氢；R8a为CH3；R8β为CH3、CH2OH、CHO、CH(OCH3)2、CH＝NOH、COOH；或R8β及R3形成式-C(＝O)-O-的二价基；或R8β及R5形成式-CH2O-CHOH的二价基；R10为CH3、CH2OH；R11为氢、羟基或O-C(＝O)C1-5烷基；或R10及R11形成式-CH2O-的二价基；及R12为CH3、CH2OH、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、或CH＝NOH。
特佳的式(1)化合物中R1为氢或寡糖类基团；R2为氢、羟基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、-O(C＝O)C6H5、或经苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R3为氢、羟基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、经苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R4为氢、C1-6烷基、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基；经苯基取代的-(C＝O)C2-5烯基；R5为CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、COOH；及R6及R7共同形成一条键；或R5及R6形成下式的二价基-CH2-O- (a)，-CH(OR13)-O-(b)，-C(＝O)-O-(c)，其中R13为氢；及R7为氢；R8a及R8β均为CH3；R9为CH3；R10为CH3；R11为氢；及R12为CH3。
式(I)化合物可用已知技艺的方法相互转换。尤其感兴趣的方法是碱性介质中的皂化反应、酸性介质中的酯基转换作用、及寡糖类部分的酶降解以产生糖苷配基，即式(I)化合物中R1为氢。
本发明也关于减轻人类及动物由利什曼原虫属的原生动物寄生虫感染引起的利什曼原虫病的临床表现形式、及治愈病症的方法，该方法包含对感染的宿主投用治疗量有效的式(I)化合物 其立体异构物的形式或其医药学上可接受的加成盐，其中R1为氢、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基、经苯基取代的-(C＝O)C2-5烯基、单糖类基团或寡糖类基团；R2为氢、羟基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C1-5烯基、-O(C＝O)C6H5、或经苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R3为氢、羟基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、-O(C＝O)C6H5、或经苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R4为氢、C1-6烷基、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基、-(C＝O)C6H5、或经苯基取代的-(C＝O)C2-5烯基；R5为CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、COOH；或R5及R2形成式-C(＝O)-O-的二价基；R6及R7为氢；或共同形成一条键；或R5及R6形成下式的二价基-CH2-O- (a)，-CH(OR13)-O-(b)，-C(＝O)-O- (c)，其中R13为氢，C1-6烷基或-(C＝O)C1-5烷基
R8α及R8β是各自独立为CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、CH(OCH3)2、CH＝NOH、COOH；R8β及R3形成式-C(＝O)-O-的二价基；R8β及R5形成式-CH2O-CHOH-的二价基；R9为CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、COOH；R10为CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、COOH；R11为氢、羟基或O-C(＝O)C1-5烷基；或R10及R11形成式-CH2O-的二价基；及R12为CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、CH＝NOH、或COOH。
为了治疗利什曼原虫病，式(I)化合物可以以内含常见的非毒性医药学上可接受的载体、辅助剂及载剂的剂量单位配方以口服的、局部、非经肠的、吸入喷洒方式或直肠投用。本文中非经肠的方式包括对感染利什曼原虫生物体的患者进行皮下注射、静脉、肌肉、胸腔内注射、动脉注射、或灌流方法。
内含活性成分的药物组合物可为适于口服的形式，例如片剂、糖锭剂、锭剂、水溶性或油状的溶液或悬浮液、可分散的粉末或颗粒、乳状液、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂。口服的组合物可依据任何制备生产药物组合物的已知技艺的方法制备，此组合物可含一种或多种药剂，其是选自增甜剂、调味剂、着色剂及保存剂以产生医药学上精致的及美味的制品。含活性成分的药片可与非毒性的医药学上可接受的赋形剂预先混合，赋形剂是制造药片适当的且包括(但非限于)惰性稀释剂、造粒及崩解剂、及润滑剂。片剂可为未涂覆的或用已知的技艺涂覆以延缓胃肠道中的崩解及吸附，因而提供长期的长效作用；盖住不佳的味料或口感；或改进外观及辨视性。
含活性物质的含水悬浮液可与适于制作悬浮水溶液的赋形剂预先混合。此赋形剂为悬浮剂、分散或湿化剂。该悬浮水溶液也可含一种或多种防腐剂，油状的悬浮液可用适当的植物油或矿物油(例如液体石蜡)悬浮活性成分调制妥。油状的悬浮液可含增稠剂、增甜剂、及调味剂制作成可口的口服制剂。此类组合物中可添加可接受的抗氧化剂保存。
经添加水后适于制备悬浮水溶液的可分散的粉末及颗粒的活性成分可与分散或湿化剂、悬浮剂及一种或多种防腐剂预先混合。
本发明药物组合物也可为水包油(o/w)或油包水(w/o)乳状液的形式。油相可为内含适当的乳化剂及抗氧化剂的医药学上适当的植物油、花生油、或矿物油。水相可含乳化剂、增稠剂及防腐剂。乳状液也可含增甜剂、着色剂及调味剂。
糖浆及酏剂可与增甜剂调制。此调制剂也可含镇痛剂、保存剂及风味剂及着色剂。
药物组合物可为灭菌的可注射制剂形式，例如灭菌的可注射水溶性或含油的、非毒性非经肠的可接受的稀释剂或溶剂的溶液或悬浮液。适用的可接受的载剂及溶剂为水、林格氏溶液及等张的氯化钠溶液。此外，灭菌、固定的油类也常见作为溶剂或悬浮液基质。此目的中可使用任何混合的固定的油类，包括合成的单-或二甘油酯、脂肪酸及其他适当的注射添加剂。悬浮液可依据已知的技艺使用适当的分散或湿化剂及悬浮剂调制。
式(I)化合物也可以栓剂或其他调制剂，例如直肠投药的溶液或悬浮液的药物形式投用。制备栓剂时是将药物与适当的非刺激性赋形剂混合，后者在常温下为固体、但在直肠温度下则以液体形式释放药物。
式(I)化合物的每日剂量在宽范围内变化，例如1.0至2,000毫克。较佳者，药物组合物中式(I)化合物与载体，是以内含5、10、25、50、100、150、250或500毫克的活性成分对待治疗病人投用适当剂量的次分剂量给药。有效量的药物一般含约0.01毫克至约50毫克/公斤体重的剂量。较佳者，介于约0.1毫克至约7毫克/公斤体重的范围。
但是，应该理解，任何特定病人的特定剂量水平需视各种因素而定，包括使用的特定的化合物的活性、年龄、体重、一般的健康状况、性别、饮食、投药时间、投药路径、分泌速率、药物组合及器官系统受影响的严重性及治疗的需求。
实验部份从顶花杜茎山分离三萜烯皂角苷类将以空气干燥的顶花杜茎山的粉末树叶(3公斤)依序用氯仿萃取去除非极性材料，然后用甲醇∶水(9∶1)萃取。将醇系萃取物在减压下蒸发，残余物用正丁醇(经水饱和)及水分配。蒸发有机层至干燥。残余物用丙酮清洗及过滤。内含皂角苷类不溶于丙酮的部份(10克)用反相BPLC(静相为RP-18 HS BDS Hyperprep 100，8微米；200克，管柱5公分)使用以下的梯度洗脱液系统纯化A0.5％乙酸铵水溶液，B甲醇及C乙腈流速为80毫升/分钟，235毫微米下以UV-侦测。使用的梯度洗脱液系统为(t＝0分钟)A∶B∶C(60∶20∶20)至(t＝50分钟)A∶B∶C(0∶50∶50)得到纯皂角苷混合物(5克)，包括六种化合物。
用相同的管柱在相同的条件下使用上述的梯度溶剂系统进行分离六种皂角苷类。依洗脱的次序得到以下的化合物化合物1MW＝1532，λmax＝223.3毫微米；可进一步的纯化，使用固定溶剂组成的溶剂系统A∶B∶C(33∶64∶03)；产率230毫克。
化合物2MW＝1510，λmax＝209.2毫微米；梯度洗脱系统(t＝0分钟)A∶B∶C(42∶29∶29)至(t＝终止时)A∶B∶C(24∶38∶38)；产率110毫克。
化合物3MW＝1532，λmax＝222.1毫微米；固定溶剂组成的溶剂系统A∶B∶C(40∶30∶30)；产率1,000毫克。
化合物4MW＝1510，λmax＝202.2毫微米；固定溶剂组成的溶剂系统A∶B∶C(59∶00∶41)；产率1,000毫克。
化合物5MW＝1574，λmax＝203.4毫微米；及固定溶剂组成的溶剂系统A∶B∶C(32∶34∶34)；产率220毫克。
化合物6MW＝1552，λmax＝216.3毫微米；固定溶剂组成的溶剂系统A∶B∶C(32∶34∶34)，回收(4次)；产率230毫克。
评估抗利什曼原虫的活性以下实验例所使用的测试药物PX内含分离自顶花杜茎山的皂角苷类混合物。
1.活体外抗利什曼原虫的活性活体外生长利什曼原虫生物体的方法及筛选方法可参见国际文献。测试方法可有弹性，且依据特定目的及测试化合物的特性调整。简言之，使用以下活体外的方法将源自实验室啮齿动物或巨噬细胞系的初级腹膜的巨噬细胞种入多孔组织培养容器内，并使其吸附约24小时。添加适当感染比例的无鞭毛体利什曼原虫(取自感染无鞭毛体的供体动物的目标组织或感染鞭毛体的培养组织)或前鞭毛体利什曼原虫及各种稀释浓度的药物或测试化合物。测试药物是溶于可耐活体外测试系统的适当溶剂(DMSO水、醇类、及等类似功能的溶剂)并添加在组织培养液中。在37℃下5％CO2中进行培养5-15天。未感染的对照组培养细胞也进行处理以测定选择性指数。并包括以参考药物处理的培养细胞以测定测试药物的相对药效。药品活性是用染色方法测定总寄生虫荷载的百分比降低或与未处理的对照培养组比较巨噬细胞感染的数目。用显微镜记读，测定EC50值(50％抑制的有效浓度)。降低的百分比及EC50值可作为活体外抗利什曼原虫活性的指标并可显著的发现临床上有用的药剂。
表I活体外初级小鼠巨噬细胞抗利什曼原虫的活性
nd未测定2.活体中抗利什曼原虫的活性活体中维持利什曼原虫生物体的方法及动物模式载于国际文献。Balb-C小鼠及黄金仓鼠为经初步分离、维持及使用人造感染模式的较佳实验室动物。测试方法可有弹性且可依据特定目的及测试化合物的特性调整。简言之，使用以下的活体中方法内脏型的利什曼原虫品系将Balb-C小鼠或年轻的仓鼠用源自感染供体动物的目标器官(一般而言为脾脏)或活体外培养的寄生虫形式的无鞭毛体(约106至107)经静脉感染。动物用不同剂量含量(剂量范围0.1至80毫克/公斤的100％DMSO或任何其他可接受的载剂)的测试化合物治疗，使用不同投药路径及治疗流程。在感染后不同时间(治疗地)内、并发感染(预防性地)或感染前(残存的活性)即开始进行治疗。在预防性的研究设计中，测试药物在人为感染利什曼原虫前或在感染的同时进行第一次投药。治疗的研究设计中，人为感染利什曼原虫后数周进行首次投用测试药物(早期治疗＝首次出现临床症候时；晚期的治疗＝临床症状完全呈现或转变成慢性时)。药品活性的评估是测定肝或任何其他相关的目标组织/器官中总寄生虫含量，并与未经治疗的对照组动物中组织/器官的含量比较。无鞭毛体的平均数目是用印染的抹片或载玻片以定量或以半定量的方式计算。降低的百分比即可作为抗利什曼原虫活性的指标并据以显著的发掘具有临床用途的药剂。最低的活性剂量(LAD)的定义为在初级目标器官/组织中降低寄生虫含量至少80％的最低剂量。表II活体中小鼠及仓鼠抗内脏型利什曼原虫的抗利什曼原虫活性
表III活体外及活体中抗内脏型幼儿利什曼原虫的活性
皮肤型及粘膜皮肤型利什曼原虫品系Balb-C小鼠或年轻的仓鼠经真皮内或皮下的用源自感染供体动物的目标器官(一般而言为损害的皮肤)或活体外培养的寄生虫形式的无鞭毛体(约106至107)感染。动物用不同剂量含量(毫克/公斤的100％DMSO或任何其他可接受的载剂)的测试化合物治疗，使用不同的投药路径及治疗流程。在感染前(预防性地)，感染后不同的时间(治疗地)即开始进行治疗。预防性的研究设计中，测试药物在人为感染利什曼原虫前或在感染的同时进行第一次投药。治疗的研究设计中，人为感染利什曼原虫后数周进行首次投用测试药物(早期治疗＝当首次出现皮肤损伤时；晚期的治疗＝当皮肤损伤完全呈现或转变成慢性时)。药品活性的评估是测定相关的目标组织/器官中损害的严重性(第一参数)或相关的目标组织/器官中的寄生虫含量(第二参数)，并与未治疗的对照组动物比较。损害大小是使用J.El-On.及A.D.Hamburger[Trans.Roy.Soc.Trop.Med.Hyg.，81，734-737(1987)]的方法定量的评估。降低的百分比即可作为抗利什曼原虫活性的指标并据以显著的发掘具有临床用途的药剂。最低的活性剂量(LAD)的定义为在初级目标器官/组织中预防损害的发展，停止损害进一步的演化或对损害引发临床治疗的最低剂量。
表IV活体中小鼠及仓鼠抗皮肤型及粘膜皮肤型利什曼原虫品系的抗利什曼原虫的活性A.预防性的治疗预防性研究的设计是在进行人为的利什曼原虫感染之前立即第一次投用测试药物
*使用的公式为〔垂直的直径×水平的直径〕/2(毫米2)
*使用的公式为〔垂直的直径×水平的直径〕/2(毫米2)
*使用的公式为〔垂直的直径×水平的直径〕/2(毫米2)B.治病性的治疗在治病的研究设计中，人为感染利什曼原虫品系后数周(一般而言为首次出现临床症候时)进行首次投用测试药物。
*使用的公式为〔垂直的直径×水平的直径〕/2(毫米2)**治疗起始
*使用的公式为〔垂直的直径×水平的直径〕/2(毫米2)**治疗起始
*使用的公式为〔垂直的直径×水平的直径〕/2(毫米2)**治疗起始表V活体中PX混合物抗不同的利什曼原虫品系的抗利什曼原虫活性
*内脏型以肝脏中无鞭毛体含量及皮肤型以损害大小为基准计
权利要求
1.一种从紫金牛(Myrsinaceae)科植物中分离三萜烯皂角苷类的方法，其中该方法包含以下的步骤(a)用酒精萃取干燥的植物部分及浓缩萃取物，(b)从萃取物中用非极性溶剂以液-液萃取法去除非极性级份，及(c)进一步的从醇类萃取物中用液-液萃取法、过滤及色层分析法纯化皂角苷类。
2.如权利要求1的方法，其中的醇类为甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇，各视需要地与水混合。
3.如权利要求1的方法，其中醇类萃取物的皂角苷类用以下的方法进一步的纯化(c6)用水饱和的丁醇萃取水溶性级份，(c7)蒸发有机层至干，(c8)于酮类中清洗残余物，及(c9)过滤粗皂角苷混合物。
4.如权利要求1的方法，其中皂角苷类是分离自顶花杜茎山(Maesa balansae)品种的植物，色层分析法包含硅胶的正相液态色层分析法或使用以下梯度洗脱液系统的反相液态色层分析法A0.5％乙酸铵水溶液B甲醇C乙腈其中t＝0时，(A∶B∶C)＝(60∶20∶20)以及当及t＝结束时，(A∶B∶C)＝(0∶50∶50)。
5.三萜烯皂角苷，它可通过权利要求1至4中任一项的方法得到。
6.如权利要求5的三萜烯皂角苷，其中该皂角苷是分离自顶花杜茎山品系的植物，色层分析法包含使用以下梯度洗脱液系统的反相液态色层分析法A0.5％乙酸铵水溶液B甲醇C乙腈其中t＝0时，(A∶B∶C)＝(60∶20∶20)及t＝结束时，(A∶B∶C)＝(0∶50∶50)，其中该皂角苷有以下的特性化合物1MW＝1532，λmax＝228.6毫微米，λmax2＝273.3毫微米；化合物2MW＝1510，λmax＝223.9毫微米，λmax2＝274.5毫微米；化合物3MW＝1532，λmax＝279.2毫微米，λmax2＝223.9毫微米；化合物4MW＝1510，λmax＝280.4毫微米，λmax2＝222.7毫微米；化合物5MW＝1574，λmax＝276.8毫微米，λmax2＝225.0毫微米；或化合物6MW＝1552，λmax＝279.2毫微米，λmax2＝223.9毫微米。
7.一种下式的三萜烯皂角苷 其中R2为-O(C＝O)C6H5或-O(C＝O)C(CH3)＝CHCH3，R3为(E)或(Z)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，及R4为氢或-(C＝O)CH3。
8.如权利要求7的化合物，其中在化合物1中，R2为-O(C＝O)C6H5，R3为(Z)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4为氢；在化合物2中，R2为-O(C＝O)C(CH3)＝CHCH3、R3为(Z)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4为氢；在化合物3中，R2为-O(C＝O)C6H5R3为(E)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4为氢；在化合物4中，R2为-O(C＝O)C(CH3)＝CHCH3、R3为(E)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4为氢；在化合物5中，R2为-O(C＝O)C6H5，R3为(E)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4为-(C＝O)C3；在化合物6中，R2为-O(C＝O)C(CH3)＝CHCH3、R3为(E)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4为-(C＝O)CH3。
9.一种药物组合物，其内含医药学上可接受的赋形剂及如权利要求5、6、7或8项中所定义的三萜烯皂角苷作为活性成分。
10.如权利要求7的组合物，其是调制成供非经肠投药之用。
11.一种或多种三萜烯皂角苷类用于制备药物组合物的用途，该药物组合物是用于治疗宿主感染利什曼原虫属(Leishmania)的利什曼原虫病，其中皂角苷为下式 及其立体异构物的形式或其医药学上可接受的加成盐，其中R1为氢、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基、经苯基取代的-(C＝O)C2-5烯基、单糖类基团或寡糖类基团；R2为氢、羟基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、-O(C＝O)C6H5、或经苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R3为氢、羟基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、-O(C＝O)C6H5、或经苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R4为氢、C1-6烷基、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基、-(C＝O)C6H5、或经苯基取代的-(C＝O)C2-5烯基；R5为CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、COOH；或R5及R2形成式-C(＝O)-O-的二价基；R6及R7为氢；或共同形成一条键；或R5及R6形成下式的二价基-CH2-O- (a)，-CH(OR13)-O-(b)，-C(＝O)-O-(c)，其中R13为氢，C1-6烷基或-(C＝O)C1-5烷基；R8α及R8β是各自独立为CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、CH(OCH3)2、CH＝NOH、COOH；R8β及R3形成式-C(＝O)-O的二价基；R8β及R5形成式-CH2O-CHOH-的二价基；R9为CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、COOH；R10为CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、COOH；R11为氢、羟基或O-C(＝O)C1-5烷基；或R10及R11形成式-CH2O-的二价基；及R12为CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、CH＝NOH、或COOH。
12.如权利要求11的用途，其中R1为氢、-(C＝O)C1-5烷基、或寡糖类基团；R3为氢、羟基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、经苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R4为氢、C1-5烷基、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基；R5为CH2OH、CH2O-C(＝O)CH3、CHO；及R6及R7共同形成一条键；或R5及R6形成下式的二价基-CH2-O- (a)，-CH(OR13)-O-(b)，-C(＝O)-O- (c)，其中R13为氢，C1-6烷基或-(C＝O)C1-5烷基；及R7为氢；R8β为CH3、CH2OH、CHO、CH(OCH3)2、CH＝NOH、COOH；R8a为CH3；R8β及R3形成式-C(＝O)-O-的二价基；或R8β及R5形成式-CH2O-CHOH的二价基；R10为CH3、CH2OH；R11为氢、羟基或O-C(＝O)C1-5烷基；或R10及R11形成式-CH2O-的二价基；及R12为CH3、CH2OH、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、或CH＝NOH。
13.如权利要求12的用途，其中R1为氢或寡糖类基团；R2为氢、羟基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、-O(C＝O)C6H5、或经苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R3为氢、羟基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、经苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R4为氢、C1-6烷基、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基；经苯基取代的-(C＝O)C2-5烯基；R5为CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、COOH；及R6及R7共同形成一条键；或R5及R6形成下式的二价基-CH2-O- (a)，-CH(OR13)-O-(b)，-C(＝O)-O-(c)，其中R13为氢；及R7为氢；R8a及R8β均为CH3；R9为CH3；R10为CH3；R11为氢；及R12为CH3。
14.一种减轻人类及动物由利什曼原虫属的原生动物寄生虫感染引起的利什曼原虫病的临床表现形式、及治愈病症的方法，该方法包含对感染的宿主投用治疗有效量的以下式的化合物 其立体异构物的形式或其医药学上可接受的加成盐，其中R1为氢、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基、经苯基取代的-(C＝O)C2-5烯基、单糖类基团或寡糖类基团；R2为氢、羟基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、-O(C＝O)C6H5、或经苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R3为氢、羟基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、-O(C＝O)C6H5、或经苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R4为氢、C1-6烷基、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基、-(C＝O)C6H5、或经苯基取代的-(C＝O)C2-5烯基；R5为CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、COOH；或R5及R2形成式-C(＝O)-O-的二价基；R6及R7为氢；或共同形成一条键；或R5及R6形成下式的二价基-CH2-O- (a)，-CH(OR13)-O-(b)，-C(＝O)-O- (c)，其中R13为氢，C1-6烷基或-(C＝O)C1-5烷基R8α及R8β是各自独立为CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、CH(OCH3)2、CH＝NOH、COOH；R8β及R3形成式-C(＝O)-O-的二价基；R8β及R5形成式-CH2O-CHOH-的二价基；R9为CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、COOH；R10为CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、COOH；R11为氢、羟基或O-C(＝O)C1-5烷基；或R10及R11形成式-CH2O-的二价基；及R12为CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、CH＝NOH、或COOH。
全文摘要
自紫金牛科的植物中可分离出下式(Ⅰ)的皂角苷类、其立体异构物形式或其医药学上可接受的加成盐,其中R
文档编号A61K31/7028GK1331601SQ99814876
公开日2002年1月16日 申请日期1999年12月15日 优先权日1998年12月22日
发明者L·J·R·M·梅斯, N·A·G·格蒙普雷茨, L·E·M·范普伊维尔德, M·范特里, T·恩戈克尼恩, N·G·M·德金佩 申请人:詹森药业有限公司