专利名称：新孢子虫疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗病原体原生动物新孢子虫的疫苗，所述疫苗可用于预防哺乳动物临床疾病和流产。本发明的疫苗含有制备自新孢子虫种之细胞的匀浆物。
哺乳动物的新孢子虫病是由原生动物寄生虫新孢子虫(Neospora)的病原体株感染引起的，此病已被认为是流产，未满月婴儿死亡，先天感染和脑炎疾病的主要原因，Dubey和Lindsay,1996,Vet.Parasitol,67:1-59；Dubey和Lindsay,1993,Parasitol.Today,9:452-458。Neospora caninum感染狗并先天性地感染小狗，经常导致瘫痪。已从自然感染的小狗中分离出N.caninum的速殖子，Dubey和Lindsay,1989,J.Parasitol,75:163-165。新孢子虫的感染也是奶牛流产的主要原因。也已报道了山羊，绵羊和马中的新孢子虫病病例。
尽管N.caninum表面上与病原体Toxoplasma gondii相似，但N.caninum和T.gondii在抗原性和超微结构上相互之间有所不同，Dubey和Lindsay,1993，文献同上。另外，分离自流产牛胎脑并在体外连续培养的新孢子虫种原生动物寄生虫显示出在抗原性和超微结构上与T.gondii和Hammondia hammondi有所不同，但与N.caninum最为相似，Conrad等，1993,Parasitology,106:239-249。另外，对核小亚单位核糖体RNA基因的分析表明分离自奶牛和狗的新孢子虫株之间没有核苷酸差异，但当与T.gondii相比时，皆显示出一致的差异，因此进一步证实了病原体之间的区别，Marsh等，1995,J.Parasitol,81:530-535。
已证实了牛流产和先天性疾病中新孢子虫牛分离物的病原学作用，Barr等，1994,J.Vet.Diag.Invest,6:207-215。使用被N.caninum感染的近交BALB/c小鼠已建立了中枢神经系统新孢子虫病的啮齿类模型，Lindsay等，1995,J.Parasitol,81:313-315。另外，Cole等，1995,J.Parasitol,81:730-732和Long等，1996,J.Parasitol,82:608-611分别描述了研究怀孕的杂交和近交小鼠中N.caninum的跨胎盘传递的模型。另外，已建立了与天然获得的新孢子虫诱导的奶牛流产很类似的实验性N.caninum矮小山羊模型，Lindsay等，1995,Am.J.Vet.Res,56:1176-1180。
WO 9525541公开了牛新孢子虫的生物纯培养物，检测抗新孢子虫之抗体和新孢子虫特异性核酸的方法，以及可用作疫苗的含有牛新孢子虫抗原和载体的组合物。
以前未公开过可抗新孢子虫病的含有制备自新孢子虫细胞的匀浆物的有效疫苗。
第一方面，本发明提供了制备自新孢子虫细胞的匀浆物，所述匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病的保护性反应。
第二方面，本发明提供了保护哺乳动物抗新孢子虫病的疫苗，所述疫苗含有免疫有效量的制备自新孢子虫细胞的匀浆物和兽医学可接受的载体，所述匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病的保护性反应。本发明的疫苗还可含有一种或多种其它的免疫调节组分，包括例如佐剂或细胞因子。
第三方面，本发明提供了制备保护哺乳动物抗新孢子虫病之疫苗的方法，所述方法包括匀浆新孢子虫细胞以产生能在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应的匀浆物，并以适于给哺乳动物施用的方式将免疫有效量的匀浆物与兽医学可接受的载体混合。
第四方面，本发明提供了保护哺乳动物抗新孢子虫病的方法，所述方法包括给哺乳动物施用疫苗，所述疫苗含有免疫有效量的制备自新孢子虫细胞的匀浆物和兽医学可接受的载体，所述匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应。本发明的疫苗可施用于对新孢子虫引起的感染和疾病敏感的任何哺乳动物的种，包括但不限于狗，奶牛，山羊，绵羊和马。
第五方面，本发明提供了保护哺乳动物以抗新孢子虫病和，任选地抗一种或多种折磨哺乳动物的其它疾病或病理学状态的联合疫苗，所述联合疫苗含有免疫有效量的第一组合物，免疫有效量的第二组合物和兽医学可接受的载体，所述第一组合物含有制备自新孢子虫细胞的匀浆物，所述匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病的保护性反应，所述第二组合物能诱导抗折磨哺乳动物的疾病或病理学状态的保护性反应。
联合疫苗中第二组合物的选择基于其诱导抗新孢子虫病或另一种折磨众多哺乳动物种之成员的疾病或病理学状态的保护性反应的能力，这种选择是本领域已知的技术。本发明的联合疫苗可另外含有一种或多种其它的免疫调节组分，包括例如佐剂或细胞因子等。
第六方面，本发明提供了接种哺乳动物以抗新孢子虫病的试剂盒，所述试剂盒含有第一容器和第二容器，其中第一容器中含有免疫有效量的制备自新孢子虫细胞的匀浆物，所述匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应，第二容器中含有兽医学可接受的载体或适于与第一容器中的内容物相混合的稀释剂。
第七方面，本发明提供了特异于制备自新孢子虫细胞的匀浆物中存在的一种或多种抗原组分的抗体。
图1．BALB/c小鼠之血清的攻击前Western印迹分析。通过SDS-PAGE分级分离NC-1速殖子的完整细胞的匀浆物(“NSA制品”)并转移到PVDF膜上，然后将膜与第一抗血清样品一起温育，接着与碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠IgG温育，并使用生色底物BCIP/NBT显色。泳道1-3=仅施用佐剂(对照)的小鼠的血清；泳道4-6=施用了NSA制品+佐剂(疫苗)的小鼠的血清；示出了分子量标准。经接种小鼠的血清含有可与分子量约为17-19,28-30,33,37,46,48和56KD的NSA制品蛋白质反应的抗体。
图2．攻击前(A)和攻击后(B)免疫荧光抗体(IFA)滴度。在含有NC-1速殖子的孔中加入接种后第21天(攻击前第0天)和攻击后第21天的动物血清，然后将孔与(Fab)2异硫氰酸荧光素缀合的抗小鼠IgG+IgM(Kirkegaard & Perry,Gaithersburg,MD)一起温育，洗涤，并通过落射荧光显微术检查。抗体滴度以产生可测荧光之免疫血清的最高稀释度为基础。结果表明与对照相比，在攻击前的接种动物中平均IFA抗体滴度较高(2A)，攻击后IFA抗体滴度显著较高(2B)(P＜0.001)。在2B中，用106攻击，对照几何平均滴度(GMT)=2,691；疫苗GMT=25,600。用107攻击，对照GMT=5,382；疫苗GMT=72,408。
图3．攻击前脾抗原特异性增殖测定。在接种后第21天，制备仅施用佐剂(对照)或NSA制品+佐剂(疫苗)之小鼠的脾细胞，并通过在NSA制品存在时温育脾细胞和用[3H]胸苷脉冲脾细胞培养物来进行T-细胞增殖测定，如下所述(实施例2)。结果表示为Δcpm(含NSA的平均cpm减去仅有培养基的平均cpm)，结果表明新孢子虫的细胞匀浆物可在体内诱导T-细胞群体，用NSA制品刺激之后，所述群体可在体外增殖。
图4．供体攻击前脾抗原特异性细胞因子的产生。在接种后第21天，制备仅施用佐剂(对照)或NSA制品+佐剂(疫苗)之小鼠的脾细胞，通过在NSA制品存在时温育脾细胞，收集无细胞的上清液，并遵照厂商的说明(PharMingen,San Diego,CA)，使用可商购的细胞因子特异性抗体测定特异性的细胞因子即可测定细胞因子的产生水平。结果表明新孢子虫的细胞匀浆物可在体内诱导T-细胞群体，用NSA制品刺激之后，所述群体可在体外产生1型(IFN-γ,IL-2)和2型(IL-6,IL-10)细胞因子。
图5．攻击后脾抗原特异性增殖测定。在攻击后第21天，制备仅施用佐剂(对照)或NSA制品+佐剂(疫苗)之BALB/c小鼠的脾细胞，并如下所述通过用[3H]胸苷脉冲脾细胞培养物来进行T-细胞增殖测定。用1×106(A)或1×107(B)个NC-1速殖子攻击之后，与对照小鼠相比(n=4/组)，使用接种小鼠的脾细胞检测到显著较高的抗原特异性反应(*=P＜0.05；**=P＜0.01)。
图6．攻击后肺和脑的损害评分。制备用1×106(A,B)或1×107(C,D)个NC-1速殖子攻击之后第21天的对照(n=6)和疫苗(n=6)BALB/c小鼠的肺和脑组织切片，并如下所述进行评分。提供了各个动物的损害评分，点状线表示各组的平均损害评分，结果表明与攻击对照相比，用新孢子虫细胞匀浆物接种，并用1×107个NC-1速殖子攻击的动物具有显著较低的肺(P＜0.01)和脑(P＜0.05)平均损害评分。A．对照平均值=0.5，疫苗平均值=0.33。B．对照平均值=1.0，疫苗平均值=0.33。C．对照平均值=1.83，疫苗平均值=0.67(P＜0.01)。D．对照平均值=1.83，疫苗平均值=1.0(P＜0.05)。
图7．攻击后无胸腺裸鼠的存活曲线。裸鼠仅接受DPBS(无脾细胞=“无细胞”)；裸鼠接受仅注射了佐剂之BALB/c小鼠的脾细胞(“佐剂”)；裸鼠接受注射了NSA制品+佐剂之BALB/c小鼠的脾细胞(“疫苗”)(n=6-7只小鼠/组)。结果表明经接种的BALB/c小鼠的细胞转移到裸鼠体内会导致过继保护性免疫，这种免疫表现为存活期的延长和抗NC-1强毒性攻击的显著保护作用。
申请人已发现制备自新孢子虫细胞的匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应。因此，本发明提供了制备自新孢子虫细胞的匀浆物，所述匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应。
本发明还提供了保护哺乳动物抗新孢子虫病的疫苗，所述疫苗含有免疫有效量的制备自新孢子虫细胞的匀浆物和兽医学可接受的载体，所述匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应。
本文所用的术语“新孢子虫病”指的是新孢子虫种或株的细胞对哺乳动物的感染，或指与新孢子虫种或株的细胞对哺乳动物的感染有关或由所述感染导致的任何临床症状，状态，事件或病理学。
短语“能诱导保护性反应”在本文中广泛用于包括诱导或增强动物响应接种而作出的任何基于免疫的反应，包括抗体或细胞介导的免疫应答，或这两者，所述反应可用于保护经接种动物抗新孢子虫病。本文所用的术语“保护性反应”，“抗…的保护作用”，“保护”等不仅指对新孢子虫病的绝对预防或对导致新孢子虫病之病原体感染的绝对预防，也指这种病原体感染程度或感染率的任何可测的降低，被病原体强毒株感染之后死亡发生率的任何可测的降低或存活时间的任何可测的增加，由病原体感染引起的疾病或任何症状或状态的严重性的任何可测的降低，包括例如经接种动物的一个或多个组织中损害的形成速率或绝对数目的任何可测的降低，或流产的发生率或感染由亲代哺乳动物传染给后代的发生率的任何可测的降低。
短语“免疫有效量”指的是当施用给哺乳动物种的成员时，经单次施用或多次施用之后可诱导抗新孢子虫病保护性反应的疫苗，匀浆物，抗原或NSA制品的量或剂量。新孢子虫抗原制品本发明基于这样一个发现，即制备自新孢子虫细胞的匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应。在本发明疫苗中用于产生匀浆物的细胞可得自新孢子虫属任何种的任何株，所述细胞可以是，也可以不是病原体，其中匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应。在优选的实施方案中，新孢子虫种是N.caninum。从中可有用地制备匀浆物的N.caninum株的非限制性例子是NC-1株，NC-1可得自被感染的MARC145猴肾细胞，所述细胞可得自位于12301 Parklawn Drive,Rockville,MD20852的美国典型培养物保藏中心(ATCC入藏登记号为CRL-12231),NC-1包括通过一次或多次体外和/或体内传代得自NC-1的株。NC-1株也描述于Dubey等，1988,J.Am.Vet.Med.Assoc.193:1259-63(列入本文参考文献)。可使用标准的分离技术，如上述文献中所述的那些技术，从被感染动物的器官，组织或体液中分离本发明使用的新孢子虫株。
在非限制性的实施方案中，可使用在免疫学上与N.caninum相当的新孢子虫其它种之细胞的匀浆物，或使用在免疫学上与N.caninumNC-1株相当的N.caninum其它株之细胞的匀浆物来制备本发明的疫苗。新孢子虫种“在免疫学上相当于”N.caninum，其中制备自免疫学相当种之细胞的匀浆物能在哺乳动物中诱导抗体产生，所述抗体可识别N.caninum细胞匀浆物中存在的一种或多种抗原组分，这一点可通过例如Western印迹分析来测定，免疫学相当种之细胞的匀浆物能在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应。类似地，N.caninum株“在免疫学上相当于”N.caninum NC-1株，其中制备自免疫学相当株之细胞的匀浆物能在哺乳动物中诱导抗体产生，所述抗体可识别N.caninum NC-1株之细胞的匀浆物中存在的一种或多种抗原组分(见图1)，制备自免疫学相当株之细胞的匀浆物能在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应。
可直接地，并不加其它修饰地利用本发明所用的新孢子虫细胞。或者，可通过例如基因操作修饰这种细胞以增加，提高，缺失或降低一种或多种代谢途径或产物或抗原特性的表达，所述抗原特性如特殊的表面抗原或毒力因子，或要不然的话，修饰所述的途径，产物或特性。有用的是可在细胞中增加，提高或要不然的话，修饰这种途径，产物或特性的表达，优选所述途径，产物或特性可用以引发或增强对被相应匀浆物接种的哺乳动物抗新孢子虫病之保护性反应的诱导。例如，可经基因工程方法修饰新孢子虫的细胞以增加或可检测地提高一种或多种抗原组分的表达，所述抗原组分可用于引发或增强保护性反应的诱导。在非限制性实施方案中，可经基因工程方法修饰新孢子虫的细胞以增加或可检测地提高一种或多种优势免疫抗原的表达，所述抗原如按下述通过NSA制品的SDS-PAGE分离和Western印迹分析肉眼可测的那些，包括被鉴定为具有选自约17-19,28-30,33,37,46,48和56KD的分子量的那些抗原。
另外，可修饰细胞以缺失或可检测地降低一种或多种抗原组分的表达，所述组分与未经修饰的新孢子虫细胞或由其制备的匀浆物正常地相关。在非限制性的实施方案中，可经基因工程方法修饰新孢子虫的细胞以缺失或可检测地降低一种或多种抗原组分的表达，所述抗原组分如按下述通过NSA制品的SDS-PAGE分离和Western印迹分析肉眼可测的那些，包括被鉴定为具有选自约17-19,28-30,33,37,46,48和56KD的分子量的那些抗原组分。以此方法，可产生被“标记”的疫苗，从而使已接种的动物与被病原体自然感染的那些动物区别开来。
基因工程修饰原生动物细胞，如新孢子虫细胞的方法一般是本领域已知的方法，包括通过例如暴露于化学诱变剂或射线以导入随机突变，然后选择所需的突变表型。或者，通过靶向基因工程修饰可修饰新孢子虫细胞，所述修饰可通过已知方法进行，如Cruz和Beverley,1990，自然，348:171-173；Cruz等，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7170-7174；Donald和Roos,1994,Mol.Biochem.Parasitol,63:243-253；和Titus等，1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:10267-10271(皆列入本文参考文献)所述的同源重组。这种基因工程修饰是本领域技术人员熟知的技术，可使用通常已知的重组技术进行，如Maniatis等，1989，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约；Ausubel等，1989，分子生物学最新方法，Greene PublishingAssociates & Wiley Interscience，纽约；和Sambrook等，1989，分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约(列入本文参考文献)所述的那些技术。
一旦得到本发明所用的新孢子虫细胞，可根据本领域中所述的已知技术，通过用新孢子虫种或株的速殖子感染任何受体细胞系，优选哺乳动物细胞系以在体外培养所述新孢子虫细胞。可培养新孢子虫速殖子的哺乳动物细胞系包括例如人包皮成纤维细胞(Lindsay等，1993,Am.J.Vet.Res,54:103-106)，牛心肺主动脉内皮细胞(Marsh等，1995，文献同上)，牛单核细胞(Lindsay和Dubey,1989，文献同上)，猴肾细胞等。例如，可在Hs68人包皮成纤维细胞(ATCC入藏登记号为CRL-1635)的单层中培养N.caninum的速殖子(Lindsay等，1993，文献同上)，可按类似的方法培养和处理慢殖子。
可在本领域所述几种类型的培养基的任何一种中培养哺乳动物细胞培养物，维持被新孢子虫感染的细胞培养物。例如，可在添加10％(v/v)热灭活的胎牛血清(FBS)或成年马血清(ES)，2mM L-谷氨酰胺，50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的Dulbecco极限必需培养基(DMEM；GibcoLaboratories,N.Y.)中培养被N.caninum速殖子感染的牛心肺主动脉内皮细胞的固定单层培养物(Conrad等，1993，文献同上)。可在含有2％(v/v)FBS,1.0mM丙酮酸钠，1×104U/ml青霉素，1×104μg/ml链霉素，5×10-2mM 2-巯基乙醇和0.3mg/ml L-谷氨酰胺的RPMI 1640(维持培养基)中维持Hs68人包皮成纤维细胞单层。可在相同培养基中维持被新孢子虫感染的Hs68人包皮成纤维细胞单层培养物，不同之处在于将其中的FBS增加到10％(v/v)(生长培养基)。
一般在标准的组织培养条件下，如37℃和5％CO2中维持哺乳动物细胞被新孢子虫感染的单层培养物。通常，当使用标准技术通过显微术测定出培养物中70-90％的哺乳动物细胞已开始被感染时，可将速殖子传代给未被感染的单层培养物。通过使用任何标准技术裂解宿主细胞并通过例如过滤或离心收集速殖子，即可从被感染的哺乳动物细胞培养物中收集速殖子。
可用于产生本发明的细胞匀浆物的细胞优选为速殖子，但也可以是慢殖子或卵囊，或它们的某种联合。另外，用于本发明的细胞可以是存活的细胞或先前已通过用如甲醛或戊二醛等的化学灭活剂处理，或通过射线处理，或通过暴露于极端pH或温度中，或它们的某种联合处理从而被灭活的细胞。
本发明匀浆物的产生不局限于任何特殊的匀浆或破裂方法，确切地说，可使用本领域已知的任何技术匀浆或破裂新孢子虫细胞，所述技术包括但不限于冷冻/解冻，渗透裂解，研磨，超声处理，多真空管，搅拌器或组织匀浆器的使用，或它们的某种联合。
本文所用的术语“匀浆物”指的是通过匀浆或破裂新孢子虫的整个细胞而制备的制品。本发明的匀浆物可含有通过匀浆或破裂新孢子虫的整个细胞而产生的所有组分，因此它表示“完整细胞”制品。或者，本发明的匀浆物可由经匀浆或破裂的新孢子虫细胞总内容物的组分组成，所述组分是使用本领域已知的一种或多种分级分离，分离或纯化步骤从完整细胞制品中制备的，所述步骤包括例如离心，过滤，透析，制备性凝胶电泳，亲和层析，离子交换层析，大小排阻层析，硫酸铵沉淀或它们的某种联合，其中所得的完整细胞制品的组分保持了在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应的能力。这种组分可以是富集的膜组分，或在可溶性胞质组分中富集的组分。仅使用常规的制备和筛选方法即可容易地制备和检测这种组分。疫苗的制备和使用本发明提供了抗新孢子虫病的疫苗，所述疫苗含有免疫有效量的制备自新孢子虫细胞的匀浆物和兽医学可接受的载体，所述匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应。
本发明还提供了制备疫苗的方法，所述疫苗可保护哺乳动物抗新孢子虫病，所述方法包括匀浆新孢子虫细胞以产生能在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应的匀浆物，并以适于给哺乳动物施用的方式将免疫有效量的匀浆物与兽医学可接受的载体混合。
疫苗可仅含有在直接取自新孢子虫细胞培养物的培养液中制备的细胞匀浆物，然后可将所述匀浆物直接施用于哺乳动物，或疫苗也可含有与兽医可接受的载体混合的细胞匀浆物，所述载体可选自本领域已知的适于施用途径的那些载体。例如，可根据常规通过将匀浆物或其组分与标准的缓冲液，载体，稳定剂，稀释剂，防腐剂和/或增溶剂混合来配制本发明的疫苗，也可配制疫苗以便于持久释放。稀释剂包括水，盐水，葡萄糖，乙醇，甘油等。用于等渗的添加剂包括氯化钠，葡萄糖，甘露糖醇，山梨糖醇和乳糖等。稳定剂包括白蛋白等。对于本领域技术人员而言，适当的其它疫苗载体和添加剂是已知的，或是显而易见的，例见Remington，药物科学，第18版，1990,Mack Publishing(列入本文参考文献)。
本发明的疫苗可另外含有一种或多种其它的免疫调节组分，如佐剂或细胞因子。佐剂的非限制性例子包括RIBI佐剂系统(Ribi Inc.,Hamilton,MT.)，明矾，如氢氧化铝凝胶的矿物凝胶，水包油乳剂，如弗氏完全和不完全佐剂的油包水乳剂，嵌段共聚物(CytRx,AtlantaGA),QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA)和SAF-M(Chiron,Emeryville CA),AMPHIGEN佐剂，皂苷，Quil A或其它皂苷组分，单磷酰脂质A和Avridine脂质胺佐剂。用于本发明疫苗的水包油乳剂的具体的非限制性例子包括SEAM62和SEAM1/2，其组分列于下文。所述疫苗中包括的其它免疫调节剂包括例如一种或多种白细胞介素，干扰素或其它已知的细胞因子。疫苗可以以溶液的形式储存，也可以以施用前用无菌稀释溶液重建的冻干形式储存。
本发明的疫苗可任选地被配制成可持久释放的抗原，这种持久释放的制剂的例子包括与生物可相容性聚合物的复合材料混合的匀浆物，所述聚合物如聚(乳酸)，乳酸-乙醇酸共聚物，甲基纤维素，透明质酸，胶原等。在包括A.Domb等，1992,Polymers for AdvancedTechnologies,3:279-292(列入本文参考文献)的几种出版物中已综述了药物传递载体中可降解聚合物的结构，选择和使用。选择和使用药物制剂中的聚合物的其它指导见于M.Chasin和R.Langer(编)，1990，“用作药物传递系统的生物可降解聚合物”一文中，该文收录于Drugs andPharmaceutical Sciences，第45卷，M.Dekker,纽约(列入本文参考文献)。另外，可使匀浆物微囊化以改善施用和效力。使抗原微囊化的方法是本领域中熟知的，包括例如US专利3,137,631；US专利3,959,457；US专利4,205,060；US专利4,606,940；US专利4,744,933；US专利5,132,117和国际专利公开WO95/28227(皆列入本文参考文献)中所述的技术。
也可使用脂质体使本发明的匀浆物持久释放。涉及如何制备和使用脂质体制剂的细节见于其它文献，如美国专利4,016,100；美国专利4,452,747；美国专利4,921,706；美国专利4,927,637；美国专利4,944,948；美国专利5,008,050和美国专利5,009,956(皆列入本文参考文献)。
本发明另外还提供了保护哺乳动物抗新孢子虫病的方法，所述方法包括给哺乳动物施用疫苗，所述疫苗含有免疫有效量的制备自新孢子虫细胞的匀浆物和兽医学可接受的载体，所述匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应。
优选非肠道，如通过皮下或肌内注射施用疫苗。然而，也可以通过腹膜内或静脉内注射，或通过其它途径，包括例如口服，鼻内，直肠，阴道，眼内，或通过联合途径施用疫苗。本领域熟练技术人员知道如何根据选定的施药途径配制疫苗组合物。
通过常规方法，开始用低剂量的匀浆物，然后逐渐增加剂量，同时监测效果即可确定有效剂量。当确定每只动物的最适剂量时，应考虑多种因素，其中主要的因素有动物种类，动物大小，动物的年龄，动物的一般身体状况，动物体内其它药物的存在，接种动物所抗的新孢子虫特殊种或株的毒力等。优选考虑到得自其它动物研究的结果之后选择实际的剂量。
也可根据上述因素选择疫苗的施用制度。可在特定动物生命过程中的任何时间施用本发明的疫苗，这取决于几个因素，包括例如其它动物中新孢子虫病暴发时间的选择等。可给断奶期或更幼小的动物施用疫苗，或也可以给更加成熟的动物施用作为生育前疫苗的疫苗以保护动物抗与新孢子虫相关之先天性疾病或流产。
仅一次接种即可获得有效的保护，或需要一次或多次加强接种以获得完全的保护。检测是否得到充足的免疫保护的一个方法是在接种后测定动物的血清转变和抗体滴度。优选由兽医根据所有相关因素的分析(一些因素见上述)确定接种时间的选择和加强免疫的次数(如果有的话)。
优选疫苗中匀浆物量的范围约为10-1,000μg蛋白质/ml，更优选约为100-500μg蛋白质/ml。适当剂量大小范围约为0.5ml-10.0ml，更优选约为1.0ml-5.0ml。一般情况下，以每剂量为基础，施用给动物的细胞匀浆物的量优选约为10-1,000μg蛋白质，更优选约为100-500μg蛋白质。
本发明的疫苗可用于保护哺乳动物抗由新孢子虫引起的感染或疾病。本文所用的术语“哺乳动物”指的是使用本发明的疫苗可保护其抗新孢子虫病的任何哺乳动物的种，包括狗，奶牛，山羊，绵羊和马等。疫苗既可用于保护怀孕的哺乳动物，也可用于保护未怀孕的哺乳动物。
本发明另外还提供了保护哺乳动物以抗新孢子虫病和，任选地抗一种或多种折磨哺乳动物的其它疾病或病理学状态的联合疫苗，所述联合疫苗含有免疫有效量的第一组合物，免疫有效量的第二组合物和如上所述的兽医学可接受的载体，所述第一组合物含有制备自新孢子虫细胞的匀浆物，所述匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应，所述第二组合物能诱导抗折磨哺乳动物的疾病或病理学状态的保护性反应。
联合疫苗中第二组合物的选择基于其诱导抗新孢子虫病或另一种折磨众多哺乳动物种之成员的疾病或病理学状态的保护性反应的能力，这种选择是本领域已知的技术。已知可用于特定哺乳动物种之疫苗组合物的任何免疫原性组合物都可用作联合疫苗的第二组合物。这种免疫原性组合物包括但不限于那些提供抗病原体保护的组合物，所述病原体选自牛疱疹病毒(传染性牛鼻气管炎)，牛呼吸道合胞病毒，牛病毒性腹泻病毒，副流感病毒Ⅰ,Ⅱ或Ⅲ型，钩端螺旋体(Leptospira)种，弯曲杆菌(Campylobacter)种，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，枝原体(Mycoplasma)种，克雷伯氏菌(Klebsiella)种，沙门氏菌(Salmonella)种，轮状病毒，冠状病毒，狂犬病毒，溶血性巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)，多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)，梭菌(Clostridia)种，破伤风类毒素，大肠杆菌，隐孢菌(Cryptosporidium)种，Eimeria spp和其它真核生物寄生虫等。
本发明的联合疫苗可另外含有一种或多种其它的免疫调节组分，包括例如佐剂或细胞因子等，并可如上所述任选地将联合疫苗配制成持久释放的形式，或以冻干的形式储存，或同时具有这两种形式。
本发明另外还提供了给哺乳动物接种以抗新孢子虫病的试剂盒，所述试剂盒含有第一容器和第二容器，其中第一容器中含有疫苗，所述疫苗含有免疫有效量的制备自新孢子虫细胞的匀浆物，所述匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应，第二容器中含有兽医学可接受的载体或适于与第一容器中的组分相混合的稀释剂。疫苗可以以通过加入载体或稀释剂重建的冻干形式储存。抗新孢子虫抗体与一种或多种新孢子虫特异性抗原组分结合的多克隆和单克隆抗体的产生属于本发明的范围之内。这种抗体可特异于与新孢子虫细胞或由其制备的匀浆物相关的任何抗原组分。在非限制性的实施方案中，可产生抗一种或多种抗原组分的抗体，在图1的Western印迹中可肉眼观察到所述抗原组分，包括那些被鉴定为具有选自约17-19,28-30,33,37,46,48和56KD的分子量的抗原组分。这种抗体可用作鉴别诊断新孢子虫病的试剂，如用于在ELISA或Western印迹测定中检测动物组织切片，细胞，组织或液体样品中的新孢子虫特异性抗原，或定量测定疫苗制品中抗原的量。
可产生抗新孢子虫细胞匀浆物中存在的任何抗原组分的抗体，所述组分如下文所述的NSA制品中的那些组分。根据已知的免疫学技术可使用多种宿主动物生产抗一种或多种新孢子虫特异性抗原组分的抗体，所述动物包括但不限于奶牛，马，兔，山羊，绵羊和小鼠。可使用如上所述的多种佐剂增强免疫应答，从而增加抗体的产生。
从被接种的动物中可得到多克隆抗体，使用标准技术可检测其抗新孢子虫特异性抗原组分的特异性。或者，可使用由经培养的连续传代细胞系生产抗体分子的任何技术制备新孢子虫特异性抗原组分的单克隆抗体。所述技术包括但不限于最先由Kohler和Milstein(自然，1975，256:495-497)描述的杂交瘤技术；人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等，1983,Immunology Today,4:72；Cote等，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:2026-2030)；和EBV-杂交瘤技术(Cole等，1985，单克隆抗体和癌症疗法、Alan R.Liss,Inc.,p77-96)。或者，用于产生单链抗体的技术(例如见美国专利4,946,778)可适于产生新孢子虫抗原特异性单链抗体。上述这些文献都已列入本文参考文献。
含有新孢子虫特异性抗原组分之特异性结合位点的抗体片段也包含在本发明中，并可通过已知技术产生。这种片段包括但不限于F(ab’)2片段和Fab片段，前者可通过用胃蛋白酶消化完整的抗体分子而产生，后者可通过还原F(ab’)2片段的二硫键而产生。或者，可构建Fab表达文库(Huse等，1989，科学，246:1275-1281)以快速鉴定对新孢子虫特异性抗原具有所需特异性的Fab片段。
本发明的抗体和抗体片段可另外含有本领域已知的标记物，如荧光标记，放射性标记或酶，目的是在任一前述诊断测定中检测特异性结合的抗体。
生产和使用单克隆抗体和抗体片段的技术是本领域已知的，另外还描述于其它文献中，如Harlow和Lane,1988，抗体实验室手册，冷泉港实验室，和J.W.Goding,1986，单克隆抗体原理和操作，AcademicPress，伦敦(皆列入本文参考文献)。
下列实施例将进一步地阐明而不是限制本发明的组合物和方法。
实施例1新孢子虫疫苗的制备新孢子虫培养物的维持于37℃,5％CO2的条件下，在组织培养瓶中的MARC-145猴肾细胞单层(USDA,ARS,Clay Center,NE.)中维持N.caninum NC-1株的速殖子，所用培养基是含有1％(v/v)FBS,100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和2mM谷氨酰胺的Opti-MEMTM培养基(Gibco BRL)。当通过显微术检查单层的致细胞病变效应测定出约60-90％MARC-145宿主细胞已裂解时，从被感染的细胞培养物中收获速殖子。使用细胞刮棒刮下含有胞内速殖子的其余被感染细胞，并用含有游离的胞外速殖子的培养基收集之。离心(1,876×g，10分钟，4℃)制品(被感染的细胞+游离的速殖子)，将沉淀物重新悬浮于5ml的Hank氏平衡盐溶液(HBSS)(Gibco BRL)中。使悬浮液通过22号的针头5次，如前述离心，重新悬浮于5ml HBSS中，并通过28号针头5次。如前述离心材料，将沉淀物重新悬浮于5mlHBSS中，接着通过无菌的5μM滤器以除去宿主细胞碎片。如前述离心材料，将含有游离速殖子的寄生虫沉淀物重新悬浮于HBSS中，使用血细胞计数器和台盼蓝测定存活速殖子的总数。匀浆物(新孢子虫抗原)的制备在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中将按上述制备的存活的速殖子调节成细胞密度为2×108/ml。在每毫升速殖子悬浮液中加入5微升蛋白酶抑制剂储液A和5微升蛋白酶抑制剂储液B。蛋白酶抑制剂储液A含有1ml EDTA溶液(通过在5ml水中加入1.46 gm EDTA制备得到)和4ml水。蛋白酶抑制剂储液B含有1ml NEM(N-乙基马来酰亚胺)溶液(通过在2.5ml乙醇中加入312 mg NEM(Sigma Chmical Co.)制备得到)，1ml胃酶抑制剂溶液(通过在5ml乙醇中加入3.43mg胃酶抑制剂(Sigma)制备得到)，3ml PMSF(苯甲基磺酰氟)溶液(通过在5ml乙醇中加入291 mgPMSF(Sigma)制备得到)，和1mlTPCK(N-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲酮)溶液(通过在5ml乙醇中加入176mg TPCK(Sigma)制备得到)。
将速殖子制品冷冻(-20℃)和解冻(室温)3次，然后在冰上以恒定的输出功率超声处理(Branson Sonifer 250,Branson Inc.)所述制品(4分钟/循环)共3个循环，所得匀浆物被称为新孢子虫抗原(NSA)制品，使用可商购的试剂盒(Pierce BCA)测定NSA制品的蛋白质浓度。制备NSA制品的等分试样并储存于-20℃或-70℃待进一步地用于疫苗和体外测定(例如，Western印迹，细胞增殖)。通过在MARC-145细胞中缺乏体外生长，而且不能杀死免疫缺损的裸鼠这一事实，可确定NSA制品不含任何存活的速殖子。疫苗的配制本文试验的疫苗含有按上述制备的NSA制品和兽医可接受的佐剂。将两个不同的佐剂SEAM62或SEAM1/2中的一个用作佐剂，SEAM62是水包油的乳剂，含有5％(v/v)角鲨烯(Sigma)，1％(v/v)SPAN85去污剂(ICI表面活性剂公司)，0.7％(v/v)吐温80去污剂(ICI表面活性剂公司)，2.5％(v/v)乙醇，200μg/ml Quil A,100μg/ml胆固醇，0.5％(v/v)卵磷脂和0.01％Thimerosal(Sigma)。SEAM1/2也是水包油乳剂，含有5％(v/v)角鲨烯，1％(v/v)SPAN85去污剂，0.7％(v/v)吐温80去污剂，2.5％(v/v)乙醇，100μg/ml Quil A,50μg/ml胆固醇，和0.01％Thimerosal。
通过加入等体积的NSA制品和佐剂(SEAM62或SEAM1/2)，接着缓慢地混合即可制备疫苗，将疫苗储存于4℃中以供初次和加强免疫接种。两个实验中最终的疫苗蛋白质浓度为250μg NSA蛋白质/ml。对照疫苗仅含有佐剂(下文实施例2中为SEAM62；下文实施例3中为SEAM1/2)。
实施例2接种和攻击具有免疫能力的小鼠分两部分研究的目的是阐明对于N.caninum NC-1株的速殖子而言，新孢子虫细胞匀浆物在具有免疫能力的小鼠中诱导保护性免疫应答的能力。
在第一部分的研究中，在第0天和第21天仅用SEAM62佐剂(对照)或用NSA制品+SEAM62佐剂(疫苗)接种8周龄的雌性BALB/c小鼠(n=10只/组)，最后一次接种后的第5天，随机地从每组3只小鼠体内收集各个血清样品，将所述样品储存于-20℃以通过Western印迹分析寄生虫特异性的抗体(图1)。按下述进行接种后的Western印迹分析在标准的非还原条件下，通过使用12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺预制凝胶(Novex)的制备性凝胶电泳(SDS-PAGE)，在分子量标记物(Novex,SanDiego,CA.)的旁边分级分离NSA制品。电泳后，将分离的蛋白质转移到PVDF膜(Millipore,Bedford,MA.)上，然后用洗涤缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(pH7.5)/0.5％吐温20去污剂)冲洗膜，风干，切下各个膜条(约8μgNSA蛋白质/条)。室温下将膜条置于封闭缓冲液(含有5％脱脂乳的洗涤缓冲液)温育过夜，简单地洗涤两次后，室温下将膜条与最后一次接种后第15天从3只佐剂对照小鼠(图1，泳道1-3)或3只经接种小鼠(图1，泳道4-6)中得到的第一抗血清样品(以洗涤缓冲液按1∶200稀释)一起温育1小时，用洗涤缓冲液冲洗2次后，室温下将膜条与碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠IgG(Kirkegaard & Perry)(以洗涤缓冲液按1∶10,000稀释)一起温育1小时，用洗涤缓冲液冲洗2次后，使用生色底物BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯/氮蓝四唑)(Kirkegaard & Perry)检测免疫反应性蛋白质。
如图1的Western印迹所示，从接种了NSA制品+佐剂的3只小鼠收集的血清抗体(泳道4-6)可与NSA制品蛋白质反应，所述蛋白质具有的分子量约为17-19,28-30,33,37,46,48和56KD。接种了NSA制品+佐剂的3只小鼠的血清样品的免疫反应性分布图相互之间基本上相同，这应归功于NSA制品的施用，因为在仅施用佐剂的对照小鼠(泳道1-3)中来检测到NSA-特异性抗体。
在第二部分的研究中，在第0天和第14天用NSA制品+SEAM1/2佐剂(疫苗)，或仅用SEAM1/2佐剂(对照)接种4周龄的雌性BALB/c小鼠(n=16只/组)，最后一次接种后的第7天，随机地从每组中选择4只供体小鼠，从每只小鼠中收集血清，混合之，并将所述样品储存于-20℃待通过免疫荧光检测。然后使用标准方法制备供体组的脾细胞，简单地说，使用组织网筛破裂从每组收集到的脾脏以得到单细胞悬浮液，在Tris缓冲的0.83％NH4Cl中裂解红细胞。计数存活的细胞之后，使用两种混合的脾细胞制品(疫苗，对照)中每一种的等分试样进行下述的攻击前抗原特异性淋巴细胞增殖测定和细胞因子测定。将其余的混合脾细胞用于过继转移到T-细胞缺陷的无胸腺小鼠中(见下文实施例3)。将其余小鼠再分成4组(n=6只/组)供随后的攻击。
在接种后第22天，用1×106或1×107个NC-1速殖子皮下攻击施用了NSA制品+SEAM1/2佐剂，或仅施用了SEAM1/2佐剂的BALB/c小鼠组(n=6只/组)。攻击后3周，收集所有小鼠的各个血清样品，无痛致死小鼠，独立地收集组织(脾，肺和脑)供随后如下所述进行加工和检测。
按下述进行攻击前和攻击后的免疫荧光抗体(IFA)滴度测定。在96孔平底培养板的每个孔中加入存活的NC-1速殖子(5×104)，将孔风干，将培养板置于-20℃中待用。检测在接种后第21天(攻击的第0天)和攻击后第21天所收集的血清检测样品的IFA滴度。以最初的1∶50血清稀释度开始，在孔中加入2倍系列稀释液并在室温下温育30分钟，用碳酸盐洗涤缓冲液洗涤2次后，将孔与(Fab)2异硫氰酸荧光素-缀合的抗小鼠IgG+IgM(Southern Biotechnology,Birmingham,AL)一起温育，洗涤培养板，在每孔中加入50μl用洗涤缓冲液稀释的50％甘油。将培养板储存于4℃直至在配备有在510nm下发射的滤光片的荧光显微镜下观察。抗体滴度基于产生可检测荧光的免疫血清的最高稀释度。
基于IFA滴度测定的结果，本发明的疫苗能诱导体液免疫应答，所述免疫应答可导致抗整个速殖子的反应性抗体的产生(图2)。从接种疫苗的小鼠随机取4只，混合其血清样品，所述血清的平均IFA滴度为＞25,000，相比之下，使用对照小鼠的混合血清得到的平均滴度＜50。接种动物被攻击后的几何平均滴度比对照动物显著较高(P＜0.001)，并比攻击前的滴度要高，这表明疫苗在接种动物中诱导了记忆免疫应答，所述免疫应答通过随后的寄生虫攻击而得以增强。
按下述测定NSA制品诱导细胞(T-细胞)免疫应答的能力。最后一次接种后的第7天，无痛致死仅注射了佐剂(对照)的小鼠和注射了NSA制品+佐剂(疫苗)的小鼠，并摘除它们的脾脏。使用组织网筛破裂收集到的脾脏(每组4只)以得到单细胞悬浮液，接着在Tris缓冲的0.83％NH4Cl中裂解红细胞。计数存活的细胞之后，将细胞悬浮于完全RPMI1640培养基中，所述培养基中含有10％热灭活的FBS，青霉素(100U/ml)，链霉素(100μg/ml)，5×10-5M β-巯基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，5μg/ml胰岛素，10μg/ml运铁蛋白和10μg/ml硒。为了进行增殖测定，在96孔平底培养板中以5×105个细胞/孔的密度平铺细胞。将细胞与一式四份孔中的总体积为200μl的完全培养基一起温育，所述培养基含有或不合以10μg NSA蛋白质/ml开始的5倍系列稀释的NSA制品。于37℃，7％CO2中将培养板温育72小时，再通过用0.33μCi[3H]胸苷脉冲脾细胞培养物18-24小时以评估T淋巴细胞的增殖。使用MACHⅢ细胞收获器(TomTech,Orange,CT.)将细胞收获至滤器上，用闪烁计数仪(Wallac,Turku，芬兰)测定放射性的掺入，结果表示为图3中的Δcpm(含NSA的平均cpm减去仅有培养基的平均cpm)。
用NSA制品刺激之后，接种小鼠而不是对照小鼠的脾细胞在体外增殖，这些体外细胞增殖测定结果证明本发明的疫苗可诱导细胞(T-细胞)免疫应答。
为了进行细胞因子测定，在96孔平底培养板中以5×105个细胞/孔的密度平铺细胞，将细胞与一式四份孔中的总体积为200μl的完全培养基一起温育，所述培养基含有或不含NSA制品(终浓度为10μg NSA蛋白质/ml)，于37℃，7％CO2中温育培养板，以24小时为间隔收集无细胞的悬浮液达4天，并储存于-20℃待测。通过双位点免疫吸附测定(ELISA)测定收集的样品中特异性细胞因子的存在，所述测定使用了一系列可商购的细胞因子特异性未缀合和缀合的抗体，由厂商(PharMingen,SanDiego,CA)建议的重组细胞因子标准和方案。结果表示为pg/ml，其中不与NSA温育的细胞孔中的背景细胞因子活性被减去。
供体攻击前脾抗原特异性细胞因子的产生示于图4，表明接种后本发明的疫苗可诱导1型(IFN-γ,IL-2)和2型(IL-6,IL-10)细胞免疫应答。对IFN-γ的诱导特别有意义，因为最近已阐明此细胞因子具有抗鼠新孢子虫病的保护性作用(Khan等，1997，实验寄生虫学，85:24-34)。另外，宿主抗相关Apicomplexa寄生虫T.gondii的保护似乎也需要IFN-γ(Suzuki等，1988，科学，240:516-518)。本发明疫苗对IFN-γ的诱导也涉及疫苗保护具有免疫能力的小鼠的能力，以及如下文实施例3所述，将这种细胞过继转移给免疫缺损的无胸腺小鼠之后，疫苗诱导记忆T细胞分泌IFN-γ的能力。在疫苗保护动物抗新孢子虫病的能力中，灭活疫苗诱导IL-6和IL-10的能力也是重要的，因为这两种细胞因子都已显示出对于宿主抗T.gondii的保护具有重要的作用(Suzuki等，1997,Infect.Immun,65:2339-2345；Neyer等，1997,Infect.Immun,65:1675-1682)。
按与上述接种后第21天的小鼠相同的方法，通过检测攻击后第21天脾抗原特异性的增殖可进一步地确定本发明疫苗诱导细胞(T-细胞)免疫应答的能力。如图5所示，相对于对照而言，在接种动物中，用1×106或1×107个NC-1速殖子攻击后T-淋巴细胞对NSA制品的反应显著较高(P＜0.01,P＜0.05)。
以2种不同攻击剂量感染接种和对照小鼠后，通过测量肺和脑组织切片中损害的数目可测定本发明疫苗保护动物抗新孢子虫诱导的脑炎的能力。在攻击后第21天，使用常规的组织学技术，分开收集肺和脑组织(6个/组)，在10％中性缓冲的福尔马林中固定，切片，并用苏木精和伊红染色。以预先不知道如何处理的盲目方式编码经染色的肺和脑切片并对所述切片进行评分，使用下列系统评分肺和脑切片(0)正常限度内，(1)轻微的，(2)轻度，(3)中度，(4)严重的和(5)显著的。
BALB/c小鼠攻击后脑和肺损害的评分示于图6(a-d)，表明与对照相比，用本发明疫苗接种的动物经1×107个NC-1速殖子的寄生虫攻击后，具有显著较低的平均肺(P＜0.01)和脑(P＜0.05)损害。另外，与经接种的小鼠相比，对照小鼠经1×106个NC-1速殖子的寄生虫攻击后，平均脑和肺损害评分的数字较高。当攻击剂量为1×106时，接种和对照小鼠之间的损害评分在统计学上没有显著的差异，这可能是由于接种组中的一个异常值小鼠引起的，该小鼠的肺和脑评分皆为2。
实施例3过继转移脾细胞之后攻击免疫缺损的小鼠此项研究的目的是测定经接种的，具有免疫能力的小鼠的脾淋巴细胞是否能用于将保护作用过继转移给T-细胞免疫缺损的无胸腺小鼠(nu/nu或‘无胸腺’小鼠(即裸鼠)，Charles River Labs)，这一点可通过经强毒的NC-1攻击之后存活期的延长来证明。
最后一次接种后的第7天，每只裸鼠(n=7只/组)接受静脉内注射1×107个脾细胞(于0.1ml DPBS中)，所述脾细胞得自接种或佐剂对照BALB/c小鼠。对照nu/nu小鼠仅接受DPBS(0.1ml)。在第22天(转移后24小时)，用5×106个NC-1速殖子皮下攻击所有的裸鼠，监测被攻击裸鼠的新孢子虫病临床症状，攻击后第14天开始出现死亡。
无胸腺裸鼠的攻击后存活曲线示于图7，仅接受DPBS的裸鼠(无脾细胞=“无细胞”)对NC-1速殖子的攻击具有高度的敏感性。到攻击后第21天为止，该组中没有一个小鼠存活。接受了注射过NSA制品+佐剂或仅注射过佐剂的BALB/c小鼠的脾细胞的裸鼠活得时间较长。接受了仅注射过佐剂的BALB/c小鼠之脾细胞的裸鼠80％最后都死于感染，实验结束时(攻击后第48天)，此组中仅有1只小鼠存活。与之相反，接受了注射过NSA制品+佐剂的BALB/c小鼠之脾细胞的裸鼠在整个实验期间的寄生虫攻击下100％都可存活。这些结果表明接种供体的脾细胞能赋予抗新孢子虫病的过继保护性免疫，并为本发明疫苗的效力提供了进一步的证据。
上述所有专利，专利申请和出版物都全文列入本文参考文献。
本发明不限于所述具体实施方案的范围，所述实施方案只是为了阐明本发明的各个方面。功能上等同的组合物和方法也在本发明的范围之内，实际上根据前面的描述，对于本领域熟练技术人员而言，除了本文所示和所述的那些以外，本发明的多种修饰将是显而易见的，这种修饰包含在所附的权利要求书的范围之内。
权利要求
1．制备自新孢子虫细胞的匀浆物，所述匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应。
2．权利要求1的匀浆物，其中制备匀浆物的新孢子虫种为N.caninum。
3．权利要求1的匀浆物，所述匀浆物可诱导抗体的产生，所述抗体可识别N.caninum NC-1株细胞匀浆物中存在的一种或多种抗原组分。
4．权利要求3的匀浆物，其中制备匀浆物的新孢子虫种为N.caninum。
5．权利要求4的匀浆物，其中制备匀浆物的N.caninum株是NC-1。
6．权利要求1的匀浆物，所述匀浆物制备自速殖子。
7．保护哺乳动物抗新孢子虫病的疫苗，所述疫苗含有免疫有效量的制备自新孢子虫细胞的匀浆物和兽医学可接受的载体，所述匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应。
8．权利要求7的疫苗，其中制备匀浆物的新孢子虫种为N.caninum。
9．权利要求7的疫苗，所述疫苗可诱导抗体的产生，所述抗体可识别N.caninum NC-1株细胞匀浆物中存在的一种或多种抗原组分。
10．权利要求9的疫苗，其中制备疫苗匀浆物的新孢子虫种为N.caninum。
11．权利要求10的疫苗，其中制备疫苗匀浆物的N.caninum株是NC-1。
12．权利要求7的疫苗，其中匀浆物制备自速殖子。
13．权利要求7的疫苗，另外含有一种或多种其它的免疫调节组分。
14．权利要求13的疫苗，其中另外的免疫调节组分是佐剂。
15．权利要求14的疫苗，其中佐剂选自RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)，明矾，氢氧化铝凝胶，水包油乳剂，油包水乳剂，嵌段共聚物，QS-21，SAF-M，AMPHIGEN佐剂，皂苷，Quil A，单磷酰脂质A和Avridine脂质胺佐剂。
16．权利要求15的疫苗，其中佐剂是选自SEAM62和SEAM1/2的水包油乳剂。
17．权利要求13的疫苗，其中其它的免疫调节组分是细胞因子。
18．权利要求7的疫苗，其中制备匀浆物的新孢子虫细胞已被修饰以使正常情况下与新孢子虫细胞或由其制备的匀浆物相关的一种或多种抗原组分的表达缺失。
19．制备保护哺乳动物抗新孢子虫病之疫苗的方法，所述方法包括匀浆新孢子虫细胞以产生能在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应的匀浆物，并将免疫有效量的匀浆物与兽医学可接受的载体混合。
20．权利要求19的方法，其中制备匀浆物的新孢子虫种为N.caninum。
21．权利要求19的方法，其中所述疫苗可诱导抗体的产生，所述抗体可识别N.caninum NC-1株细胞匀浆物中存在的一种或多种抗原组分。
22．权利要求21的方法，其中制备疫苗匀浆物的新孢子虫种为N.caninum。
23．权利要求22的方法，其中制备疫苗匀浆物的N.caninum株是NC-1。
24．权利要求19的方法，其中被匀浆的细胞是速殖子。
25．权利要求24的方法，其中通过冷冻/解冻和超声处理匀浆速殖子。
26．权利要求19的方法，另外包括在疫苗中加入一种或多种其它的免疫调节组分。
2．权利要求26的方法，其中其它的免疫调节组分是佐剂。
28．权利要求26的方法，其中其它的免疫调节组分是细胞因子。
29．保护哺乳动物抗新孢子虫病的方法，所述方法包括给哺乳动物施用疫苗，所述疫苗含有免疫有效量的制备自新孢子虫细胞的匀浆物和兽医学可接受的载体，所述匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应。
30．权利要求29的方法，其中制备匀浆物的新孢子虫种为N.caninum。
31．权利要求29的方法，其中所述疫苗可诱导抗体的产生，所述抗体可识别N.caninum NC-1株细胞匀浆物中存在的一种或多种抗原组分。
32．权利要求31的方法，其中制备疫苗匀浆物的新孢子虫种为N.caninum。
33．权利要求32的方法，其中制备疫苗匀浆物的N.caninum株是NC-1。
34．权利要求29的方法，其中疫苗的匀浆物制备自速殖子。
35．权利要求29的方法，其中疫苗另外含有一种或多种其它的免疫调节组分。
36．权利要求35的方法，其中其它的免疫调节组分是佐剂。
37．权利要求35的方法，其中其它的免疫调节组分是细胞因子。
38．权利要求29的方法，其中施用疫苗的哺乳动物种选自狗，奶牛，山羊，绵羊和马。
39．保护哺乳动物抗新孢子虫病和，任选地抗一种或多种折磨哺乳动物的其它疾病或病理学状态的联合疫苗，所述联合疫苗含有免疫有效量的第一组合物，免疫有效量的第二组合物和兽医学可接受的载体，所述第一组合物含有制备自新孢子虫细胞的匀浆物，所述匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应，所述第二组合物能诱导抗折磨哺乳动物的疾病或病理学状态的保护性反应。
40．权利要求39的联合疫苗，其中制备第一组合物的匀浆物的新孢子虫种为N.caninum。
41．权利要求39的联合疫苗，其中所述疫苗可诱导抗体的产生，所述抗体可识别N.caninum NC-1株细胞匀浆物中存在的一种或多种抗原组分。
42．权利要求41的联合疫苗，其中制备第一组合物的匀浆物的新孢子虫种为N.caninum。
43．权利要求42的联合疫苗，其中制备第一组合物的匀浆物的N.caninum株是NC-1。
44．权利要求39的联合疫苗，其中第一组合物的匀浆物制备自速殖子。
45．权利要求39的联合疫苗，另外含有一种或多种其它的免疫调节组分。
46．权利要求45的联合疫苗，其中其它的免疫调节组分是佐剂。
47．权利要求45的联合疫苗，其中其它的免疫调节组分是细胞因子。
48．权利要求39的联合疫苗，其中第二组合物能在哺乳动物中诱导抗病原体的保护性反应，所述病原体选自牛疱疹病毒，牛呼吸道合胞病毒，牛病毒性腹泻病毒，副流感病毒Ⅰ,Ⅱ或Ⅲ型，钩端螺旋体种，弯曲杆菌种，金黄色葡萄球菌，无乳链球菌，枝原体种，克雷伯氏菌种，沙门氏菌种，轮状病毒，冠状病毒，狂犬病毒，溶血性巴斯德氏菌，多杀巴斯德氏菌，梭菌种，破伤风类毒素，大肠杆菌，隐孢菌种，Eimeriaspp和新孢子虫种。
49．接种哺乳动物以抗新孢子虫病的试剂盒，所述试剂盒含有第一容器和第二容器，其中第一容器中含有免疫有效量的制备自新孢子虫细胞的匀浆物，所述匀浆物可在哺乳动物中诱导抗新孢子虫病保护性反应，第二容器中含有兽医学可接受的载体或稀释剂。
50．权利要求49的试剂盒，其中制备匀浆物的新孢子虫种为N.caninum。
51．权利要求49的试剂盒，其中匀浆物能诱导抗体的产生，所述抗体可识别N.caninum NC-1株细胞匀浆物中存在的一种或多种抗原组分。
52．权利要求51的试剂盒，其中制备匀浆物的新孢子虫种为N.caninum。
53．权利要求52的试剂盒，其中制备匀浆物的N.caninum株是NC-1。
54．权利要求49的试剂盒，其中匀浆物制备自速殖子。
55．权利要求49的试剂盒，其中匀浆物为冻干形式。
56．特异于新孢子虫细胞匀浆物中存在的抗原组分的抗体。
57．权利要求56的抗体，所述抗体特异于制备自N.caninum细胞的匀浆物中存在的抗原组分。
58．权利要求57的抗体，所述抗体特异于制备自N.caninum NC-1株之细胞的匀浆物中存在的抗原组分。
59．权利要求58的抗体，其中抗原组分的分子量选自17-19,28-30,33,37,46,48和56KD。
60．权利要求56的抗体，另外含有可检测的标记物。
全文摘要
本发明提供了制备自新孢子虫细胞的匀浆物,以及由其制备的抗新孢子虫病的疫苗,所述疫苗可用于预防哺乳动物的临床疾病和流产。
文档编号A61K35/68GK1211449SQ9811797
公开日1999年3月24日 申请日期1998年8月25日 优先权日1997年8月26日
发明者D·A·布拉克, M·卡泼斯 申请人:辉瑞产品公司