反应体系 如下：10Xbuffer(含MgCl2) 5μL，dNTPsmixture(浓度各 2. 5mmol/L) 1. 0μL，GSP1 (浓 度 10μmol/L) 2· 5μL，UPM(浓度 10μmol/L) 5· 0μL，Taq酶（5U/μL) 0· 2μL，first-strand cDNA模板的工作液2. 5μL，无菌水补至50μL。反应程序如下：94°C预变性lmin;98°C变 性10s，72°C延伸2min，共7个循环；98°C变性10s，68°C延伸2min，共33个循环；72°C延伸 10min〇
[0036] 第二轮PCR:以第一轮PCR的反应产物50倍的稀释液作为模板，以GSP2和NUP为 引物进行扩增，反应体系如下：1〇><131^€61'(含]\%(]12)5以1^，（11^1 ：)8 111丨11：11代（浓度各2.5111 mol/L)1. 0μL，GSP2 (浓度10μmol/L) 2. 5μL，NUP(浓度10μmol/L) 2. 5μL，Taq酶（5U/ μL)0.2μL，模板溶液1. 0μL，无菌水补至50μL，反应程序同第一轮PCR。PCR产物用1. 0% 的（质量体积比，以下相同）琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增结果如图2。
[0037]GSP2 引物：5' -TGTCCACCTATGCCTGGTTACTCCTCTGT-3 '； NUP引物：5 ' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT- 3 '。
[0038] 凝胶回收试剂盒（购自天根生化科技北京有限公司，以下相同）纯化回收后，连 接到PMD18-T载体（购自TaKaRa公司，以下相同），转化大肠杆菌DH5a菌株的感受态细胞 (购自大连宝生物工程有限公司，以下相同），转化后的感受态均匀涂在氨苄青霉素LB固体 培养基（50mg/L)上，培养16小时后挑取阳性菌斑，并在氨苄青霉素LB液体培养基（50mg/ L)中扩繁，提取质粒并经酶切验证后以M13F/M13R为引物，经测序后和SEQIDN0:1所示 核苷酸序列比对，两者完全同源，证明所获得的SEQIDNO: 1所示核苷酸序列是花生PAhWRI1 启动子。M13F:5' -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'; M13R:5 ^ -GTAAAACGACGGCCAGT-3 ^。
[0039]实施例2:花生PAhWRIi植物表达载体的构建和根癌农杆菌菌株EHA105(购于 上海沪尚生物科技有限公司）的转化构建重组载体，是将质粒pBI-PAhsAD-GUS(质粒 pBI-PAhsAD_GUS，河南省农业科学院经济作物研究所保存，下同）上的PAhsAD启动子序列用克 隆得到PMRI :片段替换获得。
[0040] 为完成此目的，首先用SalI/XbaI双酶切克隆载体pMD18-PAhWRIi，同时用 SalI/XbaI双酶切pBI-PAhsAD-GUS质粒；酶切反应在37°C培养箱中进行，约反应4~6小 时后，用1% (质量体积比，下同）的琼脂糖胶电泳检测。
[0041] 将克隆载体pMD18-PAhWRIi酶切下的约3Kb的片段和pBI-PAhsAD-GUS酶切下的约l〇Kb的片段用DNA凝胶回收试剂盒回收。按照pMD18-PAhWRIi酶切下的约3Kb的片段和 pBI-PAhsAD_GUS切下的约10Kb的片段（150ng3Kb的片段：50ng10Kb的片段）=3:1的比 例（摩尔浓度比）混合样品，加入T4DNA连接酶5个单位，10X反应缓冲液2yL，无菌水补 充体积至20μL，16°C连接，过夜，获得连接液。
[0042] 冻融法转化连接液至DH5a菌株的感受态细胞，在含有卡那霉素（50μg/mL)的固 体LB培养基平板上筛选，16小时后挑取正常生长的菌斑进行菌落PCR，挑取阳性菌落提质 粒，经酶切验证正确的重组质粒，命名为pBI-PAhWRI1;构建成植物表达载体pBI-PAhWRIi(图3、 图4)。
[0043] 利用冻融法将pBI-PAhWRIi转入根癌农杆菌EHA105,用卡那霉素（50μg/mL)和利 福平（50μg/mL)双抗性平板筛选，48小时后挑斑，菌落用PCR检测验证，挑取阳性菌斑，保 存菌株，命名为pBI-PAhWRI忑拟105。
[0044] 其中的冻融法步骤如下：（1)取0. 2mL农杆菌EHA105感受态，于冰水中缓慢融化； (2)加入约2μg重组质粒DNA，轻轻混匀，冰浴30min后，投入液氮速冻5min，然后37°C水 浴5min，融化细胞；（3)加入800μL不含抗生素的LB液体培养基，28°C轻摇培养4~5h; (4) 12000rpm离心30s，去上清，细胞重悬于0. 2mL的LB培养基中；（5)将培养物均匀涂布 在含Rif(50mg/L)、Str(50mg/L)和Kan(50mg/L)的琼脂板上，28°C培养2天，待平板上出现 转化子后挑菌，进行PCR检测。
[0045]实施例3 :PAhWRIi植物表达载体pBI-PAhWRIi在拟南芥中的遗传转化及转基因植株筛 选 参照文献中的方法进行拟南芥转化（ZhangX.R，etal.Agrobacterium-mediated transformationofArabidopsisthalianausingthefloraldipmethod.Nature，2006, 1:1-6)。制备含有植物表达载体pBI-PAhWRIi的根癌农杆菌EHA105菌液，在转 化拟南芥前一天，将pBI_PAhWRI #撤105转入含有卡那霉素50μg/mL、利福平50μg/mL的LB 液体培养基200mL中，28°C、220r/min过夜培养。第二天，用紫外分光光度计（SPEKOL1300) 于276纳米波长下检测菌液的吸光值，当菌液的吸光值在1. 6~2. 0之间时取出。室温 (20~25°C，下同）以4000g离心10min，弃上清，沉淀悬浮于等体积的5%蔗糖溶液中（质 量体积比）。将浑浊的蔗糖溶液倒入直径为15cm的培养皿中，转化前加入终浓度为0. 02% (体积比）的SilwetL-77 (购自北京五洲元业科贸中心），混匀。把待转化的拟南芥整个 花序轻轻的浸没在蔗糖中，15秒后取出植株花序。转化后的植株用黑色塑料袋包好，放在植 物生长箱中培养。
[0046] 第二天将塑料袋揭开，隔一周再做一次转化。培养一个月左右收获种子，将种子在 培养箱或日光下干燥3~5天。将转化收获的T0代种子用70% (体积比）的酒精和0. 01% (质量比）的升汞分别消毒3分钟和10分钟，然后用蒸馏水洗涤数次（5~7次），均匀地 吹打到含卡那霉素（50mg/L)的MS固体筛选培养基表面（MS固体筛选培养基组成：MS大量 元素母液l〇〇mL;MS微量元素母液10mL;MS有机母液10mL;MS铁盐10mL;肌醇10mL;蔗糖 30g;用lmol/L的NaOH调pH至 5. 8,8g琼脂粉，定容至 1L，121°C，6. 859X104Pa下高压消 毒15分钟，备用。各种母液配方见表1)。4°C避光放置3~5天后，转入植物生长培养箱 【光周期16 (白天）/8 (黑暗）小时，温度：白天22°C，黑夜20°C】培养。根据表达载体上所 特有的卡那霉素抗性筛选阳性苗。
[0047] 表IMS培养基母液配方
当叶片长到足够大时（3~4叶期），取少许绿苗叶片，提取DNA，进行PCR阳性检测， 反应体系为 25yL，内含：1XPCRbuffer，MgCl2 1.5mmol/L，dNTP0.2mmol/L、引物浓度为 0· 5mol/L，Pfu酶L5 单位，模板约lOOng; 所用引物为： Pahwri 1s：5 ; -ACGCGTCGACCCCTAACCGTTCTATCTCTTTTCTCCCAC-3;, PahwriiA：5 ; -CGCGGATCCCTCACCACCACCACCACCACCCTC-3;； 根据具体情况设置循环参数，结果表明获得了转基因阳性苗。
[0048] 将获得的转基因阳性苗进行培养，待绿苗长出两片真叶后，将其移栽到蛭石中，待 植株长出花序后，取一片真叶用SDS方法提取基因组DNA，做PCR鉴定。PCR鉴定时采用的 引物序列为Ρμι?ιιS和PAhWRI1A; PCR反应体系如下：基因组DNA模板1yL(约50ng)、10XTaq酶反应缓冲液2uL、 25mmol/L的MgCl2 1. 2uL、2mmol/L的dNTP1.