一种同时检测多个微量样本tcr库的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术和临床免疫学领域，具体涉及一种检测多个微量样本T细胞 受体库（Tcellreceptor,TCR)的方法。
【背景技术】
[0002] T细胞是淋巴细胞的主要组分，它具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助 或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等， 是身体中抵御感染和肿瘤形成的英勇斗士。T细胞通过其表面受体（Tcellreceptor, TCR)分子识别外环境中的病原体及其毒素和内环境中因基因突变产生的肿瘤抗原，然而 环境中的抗原千变万化，他们何以识别自然界中千变万化的抗原？经典的克隆选择理论 (clonalselectiontheory)认为，机体内存在众多的淋巴细胞克隆（1012以上)，每一个克 隆携带一种抗原受体，特异性识别一种抗原，从而组成一个蕴藏极其多样性的TCR库（TCR repertoire)。
[0003]TCR库多样性是在个体发育过程中，由决定TCR结构的胚系基因发生重排 (rearrangement)而产生的。TCR由异源性二聚体α、β或γ、δ两条多肽链组成。人外周 血中约95%Τ细胞TCR分子由α、β链组成。β链基因由可变区（variableregion,V)、多 样区（diversityregion,D)、结合区（joiningregion,J)和恒定区（constantregion, C)基因片段组成，α链基因则由V、J、C基因片段组成，各基因片段在T细胞发育早期不连 贯分布，T细胞在胸腺发育过程中TCR基因发生重排，使V、（D)、J、C基因片段相连成为有功 能的a、β基因，重组过程伴随基因片段连接处N个核苷酸的随机剪切或插入，这种连接多 样性约达2Χ1011，α、β链可以随机配对，产生约6Χ102个多样性的组合，总计连接多样性 与组合多样性约可产生1〇15个不同的TCR。
[0004] 传统的研究TCR库的方法，是基于V区基因序列的同源性，将TCRVa基因分为34 个家族、Vi3基因分为24个家族，针对每个Va、Vi3家族V区序列设计一条上游引物（即34 条Val~Va34、24条l~Vi3 24上游引物)，再针对a、β基因的恒定区序列设计一条通 用Ca、Cf3下游引物，通过RT-PCR即可扩增出Τ细胞库中所有Τ细胞的a、β基因，鉴定 各TCRVa、νβ基因家族的频率分布。理论上而言，健康人体内Τ细胞克隆多且分布相对 均匀，表明具有功能完整的抗广谱病原体的多样性Τ细胞库。而疾病状态下，抗原持续刺激 将引起特异TCRVα、νβ家族Τ细胞优势扩增，克隆分布出现偏移，表明具有功能缺陷的限 制性Τ细胞库，且限制性程度与病情相关，疾病越重，限制性程度越高。因此，分析TCR库多 样性和Va、Vβ家族频率分布可以了解机体整体Τ细胞免疫功能状况。
[0005]传统方法的局限在于：①可分析的TCR仅限于已知的TCRVa、Vi3家族。实际上， 仍有很多V基因片段是尚未发现和划分家族的，仅依据NCBI数据库中目前更新的数据，就 已将TCRVα基因分为了 41个家族，νβ基因分为30个家族，较早期的研究多出了 13个 家族。②由于针对每个家族设计不同的引物进行RT-PCR扩增，各TCRVa、Vi3基因家族 扩增效率的不同本身都会造成频率分布的偏差，无法客观反映各家族的频率分布状况。③ 分别对58个家族进行RT-PCR扩增，需要较多的cDNA模板，样本量需求较大(通常至少需要 10ml左右血样)，且操作过程繁琐，耗时费力，易出现操作失误。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述存在的问题，本发明建立了一种高效的要可对多个微量样本TCR库 同时进行检测的方法，并且可以对不同样本进行有效区分。同时，本发明使用的引物排除了 使用家族引物导致特异性扩增的可能性，更加客观反应各家族的频率分布状况。本发明操 作更加便捷，检测更加精准，可以极大的促进各类TCR库研究的发展。
[0007] 本发明的目的在于提供一种同时检测多个微量样本TCR库的方法。
[0008] 本发明所采取的技术方案是： 一种检测样本TCR库的引物，所述引物为：α链外侧引物： Ρ1 :5' -GACAGACTTGTCACTGGATTTA-3'（SEQIDΝ0:1);β链外侧引物： Ρ2 :5' -AGATCTCTGCTTCTGATGGCT-3'（SEQIDΝ0:2);α链内侧引物： Ρ3 :5' -TAGAGTCTCTCAGCTGGTACA-3'（SEQIDΝ0:3);β链内侧引物： P4:5' -TGGCTCAAACACAGCGACCT-3'（SEQIDΝ0:4)。
[0009] 进一步的，上述α链内侧引物和β链内侧引物根据需要在引物5'端接上所需的 接头。
[0010] -种检测样本TCR库的试剂盒，该试剂盒中含有上述所述的引物。
[0011] 一种检测样本TCR库的方法，包括以下步骤： 1) 提取样本总RNA; 2) 对提取的RNA进行第一链cDNA的合成，用于5'-RACE; 3) 第一链cDNA作为模板，进行5'-RACEPCR;其中上游引物为通用引物，下游引物为 上述所述的α链外侧引物或β链外侧引物； 4) 以5'-RACEPCR产物为模板，进行巢式PCR，其中上游引物为通用引物，下游引物为 上述所述的α链内侧引物或β链内侧引物； 5) 将巢式PCR的产物进行测序和分析，即可获得TCR库的分布情况。
[0012] 进一步的，步骤2)所述第一链cDNA的合成采用SMARTer?RACEcDNA试剂盒进 行合成。
[0013] 进一步的，步骤3)所述5'-RACEPCR的反应体系为： 每25μ1反应体系中，含有以下成分： PCR-GradeWater 17.25μ1 10XAdvantage2PCRBuffer 2. 5μ1 10mMdNTPMix 0. 5μ1 cDNA 1. 25μ1 上游通用引物 2. 5μ1 α链外侧引物或β链外侧引物 0. 5μ1 50XAdvantage2PolymeraseMix0·5μ1〇
[0014] 进一步的，步骤3)所述5'-RACEPCR的反应条件为94°C、3min;94°C、30s，50°C、 3〇8,72。(：、9〇8,35个循环；72。(：、1〇11^11。
[0015] 进一步的，步骤4)所述巢式PCR的反应体系为： 每25μ1反应体系中，含有以下成分： 灭菌双蒸水 19. 3μ1 10XPCRBuffer 2. 5μ1 dNTPMix 0. 5μ1 5'-RACEPCR产物 Ι.ΟμΙ MgS04 0 . 5μ1 上游通用引物 0. 5μ1 α链内侧引物或β链内侧引物0. 5μ1Pfx尚保真酶 0· 2μ1。
[0016] 进一步的，步骤4)所述巢式PCR的反应条件：94°C、3min;94°C、15s，50°C、30s， 68°C、90s，40 个循环；68°C、10min。
[0017] 进一步的，当待测样本为多个样本时，对同一样本中的α链内侧引物和β链内侧 引物添加相同的接头，对不同样本中的α链和β链内侧引物的5'端添加不同的接头；SP 可实现在步骤5)的测序过程中，将多个样本的巢式PCR产物混合在一起进行测序。
[0018] 进一步的，该方法获得的TCR库分布情况，包括样本中TCRα链和β链中所有 V区、J区基因的表达分布情况，其中包括尚未被发现或划分家族的V、J基因的表达分布情 况。
[0019] 本发明的有益效果是： 1)本发明使用5'RACE接头巢式PCR引物和特定的TCRα、β基因特异性引物RT-PCR扩增获得TCRα、β基因产物，①可获得尚未被发现或划分家族的V、J基因序列；②避免 了传统方法使用各Va、νβ家族引物导致PCR扩增效率不同造成的频率分布偏差；③在一 个PCR反应中扩增出全部TCR，极大地减少了样本需求量。
[0020] 2 )本发明在各样本中特异性引物（内侧引物）添加特定接头，测序后可以较便捷地 区分各样本，故实现了将多个样本PCR产物混合在一起进行测序，大大降低了测序成本。
[0021] 3)本发明使用的引物排除了使用家族引物导致特异性扩增的可能性，更加客观反 应各家族的频率分布状况。本发明操作更加便捷，检测更加精准，可以极大的促进各类TCR 库研究的发展。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明的技术路线示意图； 图2为样本1中TCR库的分布情况，其中A、B、C、D分别为样本1中已知的含α链V区、α链J区、β链V区、β链J区的Τ细胞表面受体的表达分布情况； 图3为样本1中TCR库的分布情况，其中A、B、C、D分别为样本1中已知的含α链V区、α链J区、β链V区、β链J区的Τ细胞表面受体的表达分布情况； 图4为样本1中TCR库的分布情况，其中A、B、C、D分别为样本1中已知的含α链V区、α链J区、β链V区、β链J区的Τ细胞表面受体的表达分布情况。
【具体实施方式】
[0023] 一种检测样本TCR库的引物，所述引物为： α链外侧引物： Ρ1 :5' -GACAGACTTGTCACTGGATTTA-3'（SEQIDΝ0:1);β链外侧引物： Ρ2 :5'-AGATCTCTGCTTCTGATGGCT-3'（SEQIDΝ0:2);α链内侧引物： Ρ3 :5' -TAGAGTCTCTCAGCTGGTACA-3'（SEQIDΝ0:3);β链内侧引物： P4:5' -TGGCTCAAACACAGCGACCT-3'（SEQIDΝ0:4)。
[0024] 优选的，上述α链内侧引物和β链内侧引物根据需要在引物5'端接上所需的接 头。
[0025] -种检测样本TCR库的试剂盒，该试剂盒中含有上述所述的引物。
[0026] -种检测样本TCR库的方法，包括以下步骤： 1) 提取样本总RNA; 2)对提取的RNA进行第一链cDNA的合成，用于5' -RACE; 3)第一链cDNA作为模板，进行5' -RACE PCR;其中上游引物为通用引物，下游引物为 上述所述的α链外侧引物或β链外侧引物； 4) 以5'-RACEPCR产物为模板，进行巢式PCR，其中上游引物为通用引物，下游引物为 上述所述的α链内侧引物或β链内侧引物； 5) 将巢式PCR的产物进行测序和分析，即可获得TCR库的分布情况。
[0027] 优选的，步骤2)所述第一链cDNA的合成采用SMARTer? RACE cDNA试剂盒进行 合成。
[0028] 优选的，步骤3)所述5'-RACE PCR的反应体系为： 每25μ1反应体系中，含有以下成分： PCR-GradeWater 17.25μ1 10XAdvantage2PCRBuffer 2. 5μ1 10mMdNTPMix 0. 5μ1 cDNA 1. 25μ1 上游通用引物 2. 5μ1 α链外侧引物或β链外侧引物 0. 5μ1 50XAdvantage2PolymeraseMix0·5μ1〇
[0029]优选的，步骤 3)所述 5'-RACEPCR的反应条件为 94°C、3min;94°C、30s，50°C、 3〇8,72。(：、9〇8,35个循环；72。(：、1〇11^11。
[0030] 优选的，步骤4)所述巢式PCR的反应体系为： 每25μ1反应体系中，含有以下成分： 灭菌双蒸水 19. 3μ1 10XPCRBuffer 2. 5μ1 dNTPMix 0. 5μ1 5'-RACEPCR产物 Ι.ΟμΙ MgS04 0 . 5μ1 上游通用引物 0. 5μ1 α链内侧引物或β链内侧引物 0. 5μ1Pfx尚保真酶 0· 2μ1。
[0031] 优选的，步骤4)所述巢式PCR的反应条件：94°C、3min;94°C、15s，50°C、30s， 68°C、90s，40 个循环；68°C、10min。
[0032] 优选的，当待测样本为多个样本时，对同一样本中的α链内侧引物和β链内侧引 物添加相同的接头