辅助鉴定猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的引物组及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种辅助鉴定猪链球菌2型、猪链 球菌7型和猪链球菌9型的引物组及其应用，尤其在利用该引物组来辅助检测来自死亡动 物的样品中是否携带猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 猪链球菌（Streptococcussuis,SS)是一种世界性的可引起猪重大疾病的重要病 原菌之一，同时它也是一种人兽共患病病原体。人感染猪链球菌的途径主要是接触病死猪， 致病菌经破损皮肤和黏膜侵入，或食入未煮熟的病死猪肉而感染。近年来，人感染猪链球菌 的报道大量增加，而这些病例主要来自亚洲国家。我国于2005年在四川省爆发的猪链球菌 疫情共感染215人，病死率将近20%。
[0003] 血清分型不仅是了解猪链球菌某一次特定爆发的流行情况或监测血清型流行情 况的一种很重要的辅助监控方法，而且对疫苗的研制有着重要的指导意义。目前，猪链球菌 的血清型主要通过凝集实验来检测，这种方法既耗时，又费力，且标准血清较为昂贵，结果 判读主观差异较大，常常引起误判。此外，还有相当一部分自凝菌株的血清型无法鉴定。因 此，迫切的需要一种既简单快速，又可靠的方法来进行血清型的鉴定。
[0004] 猪链球菌的血清型主要取决于其荚膜的抗原性，而荚膜的产生又受控于基因组中 的荚膜合成基因簇（cps)。与传统的用抗血清检测血清型的方法比较，基于血清型特异性基 因cps的PCR方法是一种简单、可靠，且经济的方法。
[0005] 目前公认的猪链球菌的血清型有33种（1-31，33,1/2)，经流行病学分析，临床上 猪链球菌主要以2、7、9型是引起猪感染的重要流行血清型，且其致病力较强，而2型猪链球 菌极易感染人。虽然之前有文献报道过2、7、9型的3重PCR方法，但其中用到的引物与我 们的不同，另外文献中的3条引物扩增的目的条带间隔距离太小，很难进行肉眼的区分。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，以2、7、9型的荚膜多 糖合成基因簇为模板设计了特异性引物组，利用该引物组来辅助检测来自死亡动物的样品 中是否携带猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的试剂盒及其检测方法。从中建 立了猪链球菌2、7、9型PCR定型方法，实现了 1次PCR同时检测多个血清型，减少了繁琐的 工作内容。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种辅助鉴定猪链球菌2型、 猪链球菌7型和猪链球菌9型的引物组，由如下引物对组成：由如SEQIDNO. 1所示的核苷 酸序列和如SEQIDN0. 2所示的核苷酸序列组成的用于辅助鉴定猪链球菌2型的引物对； 由如SEQIDN0. 3所示的核苷酸序列和如SEQIDN0. 4所示的核苷酸序列组成的用于辅助 鉴定猪链球菌7型的引物对；由如SEQIDN0. 5所示的核苷酸序列和如SEQIDN0. 6所示 的核苷酸序列组成的用于辅助鉴定猪链球菌9型的引物对。
[0008] 本发明所述引物组在制备辅助鉴定猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型 的试剂盒中的应用。
[0009] 本发明还提供一种辅助鉴定猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的试剂 盒，包括PCR预混液、阳性对照以及阴性对照，所述PCR预混液包括Taq聚合酶、dNTPs、上述 的引物组以及双蒸水。
[0010] 本发明所述的试剂盒，其中，所述阳性对照为猪链球菌2型、猪链球菌7型、猪链球 菌9型的质粒组，阴性对照为无菌双蒸水。
[0011] 本发明还提供一种检测来自死亡动物的样品中是否携带猪链球菌2型、猪链球菌 7型和猪链球菌9型的方法，包括如下步骤：
[0012] (1)样品核酸提取：
[0013] 从死亡动物选取样品组织，提取样品组织的DNA基因组作为DNA模板，并溶于灭菌 超纯水中，-20 °C保存，备用；
[0014] (2)PCR扩增：
[0015] 以步骤⑴提取的DNA基因组为DNA模板分别用如权利要求1中所述的引物组对 2、7、9型猪链球菌的cps2I、cps7L、cps9J进行PCR扩增，得到PCR产物；
[0016] (3)结果分析：
[0017] 将步骤（2)得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察目的条带。
[0018] 其中，所述步骤（2)中的PCR扩增中PCR反应液包括18μLPCR预混液、1μL步骤 (1)制备得到的DNA模板、2yL阳性对照和2yL阴性对照；扩增反应条件为：94°ClOmin预 变性；94°C30s，60°C60s，72°C90s，35 个循环；72°C延伸lOmin。
[0019] 实施本发明的辅助鉴定猪链球菌2型、7型和9型的引物组及其应用，具有以下有 益效果：
[0020] (1)本发明以2、7、9型的荚膜多糖合成基因簇为模板设计了特异性引物组，将引 物组制备成试剂盒，建立了猪链球菌2、7、9型PCR定型方法，实现了 1次PCR同时检测3个 血清型，大大缩短了临床中的工作量与工作时间；同时我们对试剂盒的各项条件进行了优 化，操作特别简单易行，只需在试剂盒中加入待测样本直接进行PCR扩增即可，不需进行试 剂的配制等繁琐工作。
[0021] ⑵本发明的试剂盒及其检测方法，三对引物对PCR扩增的目的条带间隔距离较 大，容易区分出猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型，该试剂盒具有操作简单、快 速、结果判定方便、特异性强、灵敏度高的优点。
【附图说明】
[0022] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0023] 图1为2、7、9型猪链球菌cps2I、cps7L和cps9J基因PCR结果图；其中，1代表 DL2000DNAMarker;2 代表cps2IPCR结果；3 代表cps7LPCR结果；4 代表cps9JPCR结 果；
[0024] 图2为质粒p02的构建路线；
[0025] 图3为质粒p07的构建路线；
[0026] 图4为质粒p09的构建路线；
[0027] 图5为重组质粒p02、p07和p09PCR扩增及质粒酶切鉴定结果图；其中，1为p02/ BamHI+Sall;2 为cps2IPCR产物；3 为p07/BamHI+SalI;4 为cps7LPCR产物；5 为p09/ BamHI+Sall;6 为cps9JPCR产物；Μ为DL15000DNAMarker;
[0028] 图6为检测待测样品中是否携带2、7、9型猪链球菌的多重PCR的检测结果；其中， 1-20:临床样品；21:阳性对照；M:DL2000DNAMarker;22:阴性对照；
[0029] 图7为本发明的试剂盒其特异性检测结果；其中，1-24为SSI-24 ;M为DL2000DNA Marker；
[0030] 图8为本发明的试剂盒其特异性检测结果；其中，25-31为SS25-31 ;32为SS33 ;33 为SS2 ;34为SS7 ;35为SS9 ;36为阳性对照；37为阴性对照；Μ为DL2000DNAMarker;38为 副猪嗜血杆菌；39为猪大肠杆菌；40为猪巴氏杆菌；41为猪波氏杆菌；42为猪沙门氏菌；
[0031] 图9为本发明的试剂盒对2型猪链球菌的敏感性检测结果；其中，1为3X105CFU; 2 为 3X104CFU;3 为 3X103CFU;4 为 3X102CFU;5 为SXK^CFU;6 为 3CFU;7 为 3X10tFU; 8为3X102CFU;9为3X103CFU; 10为3X104CFU; -为阴性对照汁为阳性对照；Μ为 DL2000DNAMarker；
[0032] 图10为本发明的试剂盒对7型猪链球菌的敏感性检测结果；其中，1为4X105CFU; 2 为 4X104CFU;3 为 4X103CFU;4 为 4X102CFU;5 为AXK^CFU;6 为 4CFU;7 为 4X10tFU; 8为4X102CFU;9为4X103CFU;10为4X104CFU;+为阳性对照；一为阴性对照；Μ为 DL2000DNAMarker；
[0033] 图11为本发明的试剂盒对9型猪链球菌的敏感性检测结果；其中，1为5X105CFU; 2 为 5X104CFU;3 为 5X103CFU;4 为 5X102CFU;5 为SXK^CFU;6 为 5CFU;7 为 5X10tFU; 8为5X102CFU;9为5X103CFU; 10为5X104CFU; -为阴性对照汁为阳性对照；Μ为 DL2000DNAMarker〇
【具体实施方式】
[0034] 下面，结合附图以及【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0035] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试 验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。
[0036] 实施例1
[0037] -种辅助鉴定猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的引物组，由如下引物 对组成：
[0038] 猪链球菌2型上游引物（cps2I-F):
[0039]TTCGTATTAACTTACTTGGCGT(如SEQIDNO. 1 所示）
[0040] 猪链球菌2型下游引物（cps2I-R):
[0041]TAAATCCCCATATGCCAAATCC(如SEQIDN0.2 所示）
[0042] 猪链球菌7型上游引物（cps7L-F):
[0043]AAAATTCGTTCCATTGTAGGTG(如SEQIDN0.3 所示）
[0044] 猪链球菌7型下游引物（cps7L-R):
[0045]TGAAGTTGAAGCTGGTGATAAA(如SEQIDN0.4 所示）
[0046] 猪链球菌9型上游引物（cps9J-F):
[0047] TGAAAGTAGGTATATCTCAGCA(如SEQIDN0.5 所示）
[0048] 猪链球菌9型下游引物（cps9J-R):
[0049] AAAGAATTGAATCCCACCTGAG(如SEQIDN0.6 所示）
[0050] 实施例2
[0051] -种辅助鉴定猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的试剂盒，用于离体动 物组织的2、7、9型猪链球菌分离株的血清型的辅助鉴定和间接反映猪链球菌流行病学调 查。
[0052] 该试剂盒包括PCR预混液、阳性对照以及阴性对照，所述PCR预混液包括Taq聚合 酶、dNTPs、上述的引物组以及双蒸水。阴性对照为无菌双蒸水。
[0053] (1)PCR预混液的配制
[0054] 试剂盒中PCR预混液按以下配方配制，