反应体系为20μL，配制时可按照需求的量 进行倍比扩增。配好后进行分装，为lmL/管，50次的用量，贴上标签，于-20°C保存备用。
[0055] 表1猪链球菌2、7、9型PCR试剂盒的PCR预混液配方
[0056]
[0057] (2)阳性对照的制备
[0058] 阳性对照为猪链球菌2型、猪链球菌7型、猪链球菌9型的质粒组。阳性对照的制 备包括如下步骤：
[0059] 1)菌株培养猪链球菌2、7、9型标准菌株在THB培养基（BD公司）或含10%绵羊 血的琼脂培养基上生长。大肠杆菌DH5a在LB琼脂平板上生长，添加氨苄（Amp)至终浓度 为 50g/mL。
[0060] 2)DNA模板的准备挑取含10%绵羊血的琼脂培养基上生长过夜的猪链球菌2、 7、9型菌株，分别接种于THB液体培养基，37°C静置培养过夜，取4mL菌液用TIANamp BacteriaDNAKit(TIANGEN)按照说明书提取细菌的基因组DNA，并溶于灭菌超纯水 中，-20 °C保存备用。
[0061] 3) 2、7、9型猪链球菌的荚膜多糖合成基因簇保守序列的克隆以上述基因组为模板 分别用引物cps2I-F/cps2I-R、cps7L-F/cps7L-R、cps9J-F/cps9J-R对 2、7、9 型猪链球菌的 cps2I或cps7L或cps9J进行PCR扩增，PCR产物分别经琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下切下 目的条带（如图1所示），然后用UNIQ-10柱式DNA凝胶回收试剂盒（上海生工生物有限公 司）回收目的片段，具体步骤按试剂盒说明书操作。回收产物_20°C保存备用。
[0062] 4)质粒构建将回收的cps2I或cps7L或cps9J分别连接克隆载体pMD-18T中，反 应体系如下：
[0063]
[0064] 16°C连接过夜后，各取5μL连接产物分别加入200μL大肠杆菌感受态细胞DH5α 中，混匀，冰上放置30min;42°C热激90s，迅速转移至冰上放置2min，加入800μLLB液体 培养基，37°C120rpm振荡培养lh后，3000rpm离心5min，弃上清800μL，用剩余液体重悬 细胞，分别均匀涂布于含Amp的LB平板上，分别标记为02、07和09,于37°C振荡培养过夜。 三种质粒分别命名为P〇2、p07、p09。
[0065] 质粒构建的技术路线如图2-4。
[0066] 5)克隆质粒酶切鉴定将步骤4)中培养的菌液进行质粒提取，提取步骤按照质粒 小量提取试剂盒（TAKARA)的说明书进行。纯化后的质粒于37°C酶切3小时后琼脂糖凝胶 电泳观察结果，如图5所示，为重组质粒p02、p07和p09PCR扩增及质粒酶切鉴定结果。酶 切体系如下：
[0067]
[0068] 6)序列测定将PCR鉴定和酶切鉴定均正确的大肠杆菌重组菌送上海生工生物技 术有限公司进行测序。所得序列与NCBI数据库中已有猪链球菌的序列数据进行比对分析。 测序结果见序列表7-9,其中，重组质粒p02测序结果如SEQIDN0. 7所示，重组质粒p07测 序结果如SEQIDN0. 8所示，重组质粒p09测序结果如SEQIDN0. 9所示。
[0069] 7)阳性对照的配制上述测序正确后的质粒分别提取纯化质粒，纯化后的质粒 用紫外分光光度计测定在280nm和260nm波长时的光吸收值（0D)，按公式拷贝数/mL= (amount(ng/yLX10 9)Χ6· 022X1023V(DNAlengthX660)分别计算质粒p02、p07、p09 的 浓度（拷贝数）。
[0070] 分别将质粒p02、p07、p09的浓度用ddH20稀释至浓度为3X106拷贝数/mL、3X104 拷贝数/mL、3X106拷贝数/mL。最后按1 :1 :1的比例将3种质粒混合在一起，充分混匀， 即为试剂盒中的阳性对照样品。将阳性对照分装至1.5mL样品管中，贴上标签，-20°C保存 备用。
[0071] ⑶阴性对照的制备选取双蒸水进行121°C，30min高压灭菌后，分装至EP管中，分 装量为〇·lmL或0· 04mL，贴上标签，-20°C保存备用。
[0072] 实施例3
[0073] -种检测来自死亡动物的样品中是否携带猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球 菌9型的方法，包括如下步骤：
[0074] (1)样品核酸提取：
[0075] 从20只同种类的死亡动物选取样品组织，分别命名为待测样品1-20,然后分别提 取样品组织的DNA基因组作为DNA模板，并溶于灭菌超纯水中，-20°C保存，备用；
[0076] (2)PCR扩增：
[0077] 以步骤⑴提取的DNA基因组为DNA模板分别用所述的引物组cpS2I-F/cpS2I-R、 cps7L_F/cps7L_R、cps9J-F/cps9J-R对2、7、9型猪链球菌的cps2I、cps7L、cps9J进行PCR 扩增，得到PCR产物；
[0078] 其中，PCR扩增中使用的PCR反应液配方为：每份PCR反应液包括
[0079]
[0080] 扩增反应条件为：
[0081]
[0082] (3)结果分析：
[0083]PCR扩增结束后取10yLPCR产物于1%琼脂糖凝胶中，以100V电压电泳30min， 紫外灯下观察结果，如图6-7所示。从图中可见，待测样品1-20中能检测出待测样品1-10 中携带2或7或9型猪链球菌，而待测样品11-20均为检出的2或7或9型猪链球菌；此 外，从待测样品1-10的检测结果可以看出，2或7或9型猪链球菌的条带之间的间距较宽， 能够清楚判断待测样品携带的是何种猪链球菌的血清型。
[0084] 下面，对实施例2中的试剂盒进行特异性试验以及敏感性试验的分析。
[0085] (1)试剂盒的特异性试验
[0086] 分别以大肠杆菌、巴氏杆菌、波氏杆菌、沙门氏菌和副猪嗜血杆菌为模板用上述 PCR预混液进行PCR反应；同时分别以猪链球菌1、3-6、8、9-31、33型猪链球菌的基因组为 模板进行PCR反应，反应体系和反应程序同上，鉴定该试剂盒的特异性。
[0087] 结果如图8所示，从图中可见，显示该试剂盒具有较好的特异性，与大肠杆菌、巴 氏杆菌、波氏杆菌、沙门氏菌和副猪嗜血杆菌以及猪链球菌1、3-6、8、9-31、33型猪链球菌 都没有交叉反应。
[0088] (2)试剂盒敏感性试验
[0089] 将培养过夜的2、7、9型菌液分别10倍稀释至10 7次方，ddH20为阴性对照，和原 浓度的菌液对多重PCR的敏感性进行检测。并将菌液10 6-10 4次方稀释的菌液分别涂布平 板，37°C过夜培养后，分别计算每个型菌株的菌液浓度。
[0090] 将培养过夜的各型模板稀释至108次方，ddH 20为阴性对照，分别以各稀释度的菌 液为模板进行多重PCR的敏感性检测。
[0091] 如图9-11所示，试验结果显示，2型的检出限为3cfu，7型的检出限为4cfu，9型的 检出限可达5cfu。
[0092] 使用本发明的试剂盒通过对样品简单的处理便可快速检测样品中否携带猪链球 菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型；本发明的试剂盒具有操作简单、快速、结果判定方 便、特异性强、灵敏度高的优点。
[0093] 对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种 相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围 之内。
【主权项】
1. 一种辅助鉴定猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的引物组，其特征在于， 由如下引物对组成：由如SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列和如SEQIDNO. 2所示的核苷酸 序列组成的用于辅助鉴定猪链球菌2型的引物对；由如SEQIDNO. 3所示的核苷酸序列和 如SEQIDNO. 4所示的核苷酸序列组成的用于辅助鉴定猪链球菌7型的引物对；由如SEQ IDNO. 5所示的核苷酸序列和如SEQIDNO. 6所示的核苷酸序列组成的用于辅助鉴定猪链 球菌9型的引物对。2. 权利要求1所述引物组在制备辅助鉴定猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9 型的试剂盒中的应用。3. -种辅助鉴定猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的试剂盒，其特征在于， 包括PCR预混液、阳性对照以及阴性对照，所述PCR预混液包括Taq聚合酶、dNTPs、如权利 要求1所述的引物组以及双蒸水。4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为猪链球菌2型、猪链球 菌7型、猪链球菌9型的质粒组，阴性对照为无菌双蒸水。5. -种检测来自死亡动物的样品中是否携带猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌 9型的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 样品核酸提取： 从死亡动物选取样品组织，提取样品组织的DNA基因组作为DNA模板，并溶于灭菌超纯 水中，-20°C保存，备用； (2) PCR扩增： 以步骤（1)提取的DNA基因组为DNA模板分别用如权利要求1中所述的引物组对2、7、 9型猪链球菌的cps2I、cps7L、cps9J进行PCR扩增，得到PCR产物； (3) 结果分析： 将步骤（2)得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察目的条带。6. 根据权利要求5所述的检测来自死亡动物的样品中是否携带猪链球菌2型、猪链球 菌7型和猪链球菌9型的方法，其特征在于，所述步骤（2)中的PCR扩增中PCR反应液包括 18μLPCR预混液、1μL步骤⑴制备得到的DNA模板、2μL阳性对照和2μL阴性对照； 扩增反应条件为：94°ClOmin预变性；94°C30s，60°C60s，72°C90s，35个循环；72°C延伸 10min〇
【专利摘要】一种辅助鉴定猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的引物组及其应用，该引物组由如下引物对组成：由如SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列和如SEQ？ID？NO.2所示的核苷酸序列组成的用于辅助鉴定猪链球菌2型的引物对；由如SEQ？ID？NO.3所示的核苷酸序列和如SEQ？ID？NO.4所示的核苷酸序列组成的用于辅助鉴定猪链球菌7型的引物对；由如SEQ？ID？NO.5所示的核苷酸序列和如SEQ？ID？NO.6所示的核苷酸序列组成的用于辅助鉴定猪链球菌9型的引物对。本发明将引物组制备成试剂盒，建立了猪链球菌2、7、9型PCR定型方法，实现了1次PCR同时检测3个血清型，大大缩短了工作内容。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105274102
【申请号】CN201510776701
【发明人】贾爱卿, 刘琪, 周如月, 甘振磊, 王贵平
【申请人】广东海大畜牧兽医研究院有限公司
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年11月12日