植物抗旱相关蛋白EtSnRK2.2及其编码基因和应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体涉及植物抗旱相关蛋白EtSnRK2.2及其编码基因和应用。
背景技术：
：小麦作为我国重要的粮食作物之一，在国民经济中占有非常重要的地位。然而，每年因干旱、盐碱等逆境胁迫条件严重影响着小麦的产量和品质，制约着我国小麦粮食安全。利用基因工程技术从分子水平上深入研究植物与非生物逆境之间的关系，揭示植物对逆境胁迫信号传导及基因表达调控分子机理，克隆抗逆相关基因为培育作物抗逆新种质提供候选抗逆基因资源。蔗糖非发酵相关蛋白激酶家族(SnRKs)在植物的许多生理过程中起着重要的作用，例如激素信号传导、非生物胁迫和植物的生长发育等。SnRK2家族基因在功能上表现出差异性，拟南芥中SnRK家族成员中有9个基因被甘露醇或NaCl高渗胁迫诱导，5个基因被ABA诱导，但均不受冷胁迫诱导。水稻中SnRK基因，通过蛋白磷酸化分析表明所有成员都能被高渗胁迫激活，但是只有OsSAPK8、OsSAPK9和OsSAPK10这三个基因受ABA诱导表达。在小麦中，第一个SnRK2成员是从ABA处理的小麦胚胎cDNA文库中分离得到的PKABA1，PKABA1的表达除受ABA和干旱胁迫所诱导。TaSnRK2.4基因过表达能够增强转基因拟南芥对干旱、高盐的胁迫耐性，同时不会造成植物的生长矮化现象。TaSnRK2.7基因功能分析显示，在糖代谢、降低渗透势、增强光系统II的活性以及促进植物生根等生理生化过程中起着重要作用；TaSnRK2.8基因过表达的拟南芥对干旱、低温、高盐、高温等均有一定胁迫耐性。因此，克隆、分离抗逆相关SnRK蛋白激酶基因改良和提高作物的抗逆性具有非常重要的意义。技术实现要素：本发明的目的是提供一种植物抗旱相关蛋白EtSnRK2.2。本发明的再一目的是提供编码上述植物抗旱相关蛋EtSnRK2.2的基因。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本发明的另一目的是提供包含上述基因的转基因细胞系。本发明的另一目的提供上述植物抗旱相关蛋白EtSnRK2.2的应用。本发明所提供的抗旱相关蛋白EtSnRK2.2，来源于毛穗偃麦草，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明的蛋白激酶由343个氨基酸残基组成，是SnRK类蛋白激酶。自SEQIDNO.1的氨基末端第10-30位氨基酸残基是ATP结合域，自SEQIDNO.1的第115-130位氨基酸残基为丝氨酸/苏氨酸结合域。SEQIDNO：1为了使蛋白EtSnRK2.2便于纯化，可在由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL根据本发明所公开的SEQIDNO.1序列，本发明的转录因子EtSnRK2.2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。根据本发明的EtSnRK2.2编码基因具有如SEQIDNO.2所示cDNA序列。SEQIDNO.2含有EtSnRK2.2基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有EtSnRK2.2基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用EtSnRK2.2构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆植物的方法。本发明所提供的培育耐逆植物的方法，是将上述任一种含有EtSnRK2.2基因的重组表达载体导入植物细胞中，得到耐逆植物。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的SnRK蛋白激酶EtSnRK2.2基因导入植物细胞，可获得对干旱和盐等非生物逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：拟南芥、小麦、毛穗偃麦草、拟南芥、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。本发明以抗旱性较强的毛穗偃麦草(ElytrigiatrichophoraL.)为实验材料，得到了抗逆相关的EtSnRK2.2蛋白及其编码基因，并将其导入小麦，显著提高了转基因小麦的抗旱性。本发明的抗旱相关蛋白及其编码基因对改良、增强小麦抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。附图说明图1显示EtSnRK2.2转基因小麦分子检测结果。M：Trans2KPlusDNAmarker；7：阴性对照；2-6为不同转基因小麦株系。图2显示EtSnRK2.2转基因小麦旱棚抗旱鉴定结果，其中，京冬18为受体对照；446-1，463-2，660-1，471-3为不同转基因株系。图3显示EtSnRK2.2转基因小麦田间抗旱生理指标测定结果，主要测定了446-1，463-2，660-1，471-3转基因株系及受体京冬18的可溶性糖及叶绿素荧光。图4显示了EtSnRK2.2转基因小麦不同株系表型比较，主要考察了421-1、437-8、471-2、582-1转基因株系及受体京冬18的穗粒数、株高、穗长等数据。具体实施方式以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。实施例1：毛穗偃麦草抗旱相关EtSnRK2.2基因的cDNA克隆对生长30天左右的毛穗偃麦草幼苗进行干旱处理5小时，用Trizol提取毛穗偃麦草总RNA。应用5’RACE试剂盒(GIBCOBRL,CAT.NO.18374-058)和3’RACE试剂盒(GIBCOBRL,CAT.NO.18373-019)获得EtSnRK2.2基因的全长序列1032bp。用Trizol提取毛穗偃麦草幼苗的总RNA，用superscriptII(invitrogen)反转录酶反转录获得到cDNA。根据EtSnRK2.2基因编码区序列设计引物P1和P2。以反转录得到的cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增。引物P1和P2的序列如下：P1：5’-ATGGATCGGTACGAGGTGGT-3’，P2：5’-TTACAAAGGGCACACGAAATCC-3’。对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为1kb左右的条带，与预期结果相符。回收该片段，将该回收片段与pGEM-TEasy(Promega)连接，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-TEasy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的EtSnRK2.2基因的开放阅读框(ORF)为SEQIDNo.2的自5’末端第1至1032位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是SEQIDNo.1的蛋白质。将含序列SEQIDNo.2所示EtSnRK2.2基因的重组载体命名为pTE-EtSnRK2.2。EtSnRK2.2基因为一个新基因，进一步用引物P1和P2在毛穗偃麦草基因组中进行扩增，结果显示该基因的基因组序列大小与cDNA长度大小一致，不含有内含子序列。实施例2：用EtSnRK2.2基因增强植物的抗旱性1、重组表达载体的构建1)Ubi-EtSnRK2.2重组表达载体的构建以毛穗偃麦草的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有HindIII和BamHI接头序列的特异引物进行PCR扩增；然后HindIII和BamHI双酶切PCR产物回收，将酶切产物正向插入载体pNT112的Ubi启动子之后的HindIII和BamHI酶切位点之间，得到重组载体Ubi::EtSnRK2.2。引物序列如下：EtSnRK2.2[HindIII]5’-TCAAGCTTATGGATCGGTACGAGGTGGT-3’EtSnRK2.2[BamHI]5’-GGGGATCCTTACAAAGGGCACACGAAATCC-3’2、转基因小麦获得和功能鉴定1)转基因小麦材料的获得将上述构建的重组表达载体pUbi::EtSnRK2.2分别用冻融法转化根癌农杆菌C58C1，再用pUbi::EtSnRK2.2的根癌农杆菌C58C1转化小麦，用含200mg/LBasta的MS培养基进行筛选，得到阳性转基因植株。将筛选得到的阳性转基因植株用PCR做进一步鉴定筛选，PCR所用的一对引物为P3和P4。P3(上游引物):5’-GGAGATTATGAACCACCGGT-3’，P4(下游引物):5’-TCTCCGGGATGGTTATTCGC-3’。对Ubi::EtSnRK2.2转基因小麦进行PCR鉴定，阳性转基因植株经PCR扩增可获得1000bp左右条带，结果获得转Ubi::EtSnRK2.2小麦56株(图1)。同时将pNT112空载体导入小麦，方法同上，作为对照，获得10个株系的转空载体小麦，筛选获得的转基因小麦用T2代表示。2)EtSnRK2.2转基因小麦抗旱性鉴定在全生育期只浇返青水情况下，对种植的EtSnRK2.2转基因材料进行旱棚抗旱性筛选。对田间抗旱表型鉴定发现，EtSnRK2.2转基因株系持绿性较好，旗叶仍然能够正常进行光合作用，籽粒灌浆充足，千粒重增加显著；而对照京冬18持绿性差，旗叶及其他部位叶片发黄、早衰严重，不能正常进行光合作用(图2)。可溶性糖、叶绿素荧光生理指标测定发现，EtSnRK2.2转基因株系的叶绿素荧光值、可溶性糖含量均比对照积累较多(图3)。此外，从收获的考种数据分析发现，转基因株系的穗粒数、根系、穗长等性状均优于对照，从而使得EtSnRK2.2转基因材料耐旱性显著增强(图4)。<110>北京市农林科学院<120>植物抗旱相关蛋白EtSnRK2.2及其编码基因和应用<160>2<210>1<211>343<212>PRT<213>偃麦草<400>1MDRYEVVRDIGSDNFGVAKLVRDVRTKEHFAVKFIKRGRKIDEHVQREIMNHRSLKHPNI60IRFKEVVLTPTHLAIIMEYASGGELFQRICNAGRFSEDEGRFFFQQLISGVSYCHSMQVC120HRDLKLENTLLDGSVAPRLKICGFGYSKSSVLHSQPKSTVGTPAYIAPEVLSRREYDGKV180ADVWSCGVTLYVMLVGAYPFEDPDEPRNFRKTITRILSVQYS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