专利名称：猪源罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及家畜饲料的微生物添加剂及其制备方法，特别是涉及一种含有由猪源 罗伊氏乳酸杆菌组成的直接饲喂的活菌冻干制剂及其制备方法。
背景技术：
人和动物肠道内存在着大量的细菌，约30个属500多种，共同构成了肠道正常菌 群。这些微生物与宿主之间既有正向关系(偏利共生、相生和互惠现象)，也有负向关系(竞 争、偏害现象)，共同维持着微生态平衡。然而，近年来抗生素作为饲料添加剂的大量使用， 在抑制和杀灭病原菌的同时也抑杀了动物机体内正常共生的菌群，破坏了微生态平衡。相 反，益生菌的作用在于扶植正常微生物菌群，颉颃病原菌，把生态失衡调节为生态平衡。其 中，乳酸菌作为猪肠道内优势菌群，能够调节肠道内正常菌群的共性比例，维持着肠道生态 系统的平衡。罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)属于专性异型乳酸发酵菌，是普遍存 在于人和动物肠道的有益乳酸杆菌，也是乳酸杆菌属中重要的种群之一。研究表明，罗伊氏 乳酸杆菌肠道能够调整肠道菌群平衡，降低机体胆固醇、调节机体免疫反应等。另外，罗伊 氏乳酸杆菌还能够产生一种独特的抑菌素(reuterin)，可以有效地抑制大肠埃希氏、鼠伤 寒杆菌、白假丝酵母、黄曲霉菌、空肠弯曲杆菌及芽孢梭菌等多种有害菌，被认为是唯一一 种能够产生广谱抗菌作用的肠道乳酸菌菌种。美国食品和药品管理协会(FDA)于1989年 将罗伊氏乳酸杆菌列为安全的微生物菌种后，该菌得到了广泛的应用。目前国际上报道最 多的一株菌种是瑞典Biogaia AB公司所有的罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri ATCC-55730)，全球消费已超过15亿个罗伊氏乳杆菌剂量，且没有食用不安全的报导。日本 另有报道认为，市面上20多种益生菌发酵乳中，唯有含罗伊氏乳酸杆菌类产品能够对儿童 龋齿起到抑制效果，主要是由于该菌能够抑制变形链球(Sti^ptococcus mutan)的生长繁 殖，而Str印tococcusmutan是引起龋齿的主要微生物。我国卫生部于2003年批准罗伊氏 乳酸杆菌(Lactobacillusreuteri)为可用于保健食品的益生菌菌种，目前国内关于罗伊 氏乳酸杆菌的报道主要应用在人类酸奶食品中，且报道数量较少。而作为动物饲用的罗伊 氏乳酸杆菌更是鲜见报道，这主要是由于该菌从分离鉴定到产品制备以至于在动物生产中 的应用等过程尚没有系统的研究，这些因素限制了该菌种在动物生产中的推广应用。因此， 根据畜牧生产的需要，通过严格的科学试验，开发一种新型、实用的乳酸菌制剂，有着广阔 的应用前景。
发明内容
本发明针对上述领域的不足，提供一种猪源罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂，可以直接 饲喂动物。能够增加保育猪粪中乳酸菌活菌含量，降低大肠杆菌含量，并具有提高保育猪平 均日增重和免疫力的作用。猪源罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)冻干制剂，其特征在于冻干制剂中保护剂的组分及各组分的重量百分比为脱脂乳10%、谷氨酸钠0. 1%、半胱氨酸0.3%、 海藻糖10%、乳糖8%、糊精10%，其余为水。所述猪源罗伊氏乳酸杆菌活菌数彡109cfu/g。所述猪源罗伊氏乳酸杆菌来源于断奶仔猪盲肠黏膜。上述猪源罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂的制备方法，其步骤为将猪源罗伊氏乳酸杆 菌进行发酵扩大培养，离心发酵液后取菌泥，将菌泥加入到所述保护剂中，混勻、冻干即可。所述发酵扩大培养中接种量为1%，发酵温度为37°C，pH为6. 4 6. 5，发酵时间 为 24h。所述发酵扩大培养中采用的培养基的组分及各组分的重量百分比为麦芽糖 2%、酪蛋白胨1. 5%、酵母粉0. 5%、磷酸氢二钾0. 4%、乙酸钠0. 7%、硫酸镁0. 058%、硫酸 锰0. 019%、吐温0. 1%、牛肉膏1%、柠檬酸氢二铵0.2%。 上述冻干制剂在动物饲料添加剂中的应用。所述动物为家畜。所述家畜为猪。本发明在断奶仔猪盲肠黏膜分离得到了猪源罗伊氏乳酸杆菌，试验数据表明，将 该猪源罗伊氏乳酸杆菌制成的冻干制剂添加到保育猪饲料中，能够促进保育猪生长，提高 其饲料利用率，降低料肉比见表20 ；能够增加保育猪肠道中有益菌含量，降低有害菌含量， 从而维持猪肠道微生态环境的平衡，见表21 ；在保护肝脏、增强机体免疫力方面具有积极 的作用，见表22。基于对猪源罗伊氏乳酸杆菌在动物肠道中的益生功能，为了使猪源罗伊氏乳酸杆 菌在动物饲料中得到良好的应用并充分发挥其益生菌的作用，本发明通过大量的配方筛 选得到一种冻干保护剂配方10%脱脂乳、0. 谷氨酸钠、0.3%半胱氨酸、8%乳糖、10% 糊精、10%海藻糖，其余为水。该冻干保护剂对猪源罗伊氏乳酸杆菌的冻干保护率达到 98. 84 %，见表17 ；使其在常温保存90d后，菌存活率达到75. 64 %，见表18。本发明还提供了猪源罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂的制备方法，主要特征在于在增菌 制备猪源罗伊氏乳酸杆菌时采用本发明优化得到的猪源罗伊氏乳酸杆菌优化培养基，麦芽 糖2 %、酪蛋白胨1. 5 %、酵母粉0. 5 %、磷酸氢二钾0.4%、乙酸钠0. 7 %、硫酸镁0. 058 %、 硫酸锰0.019%、吐温0. 1%、牛肉膏1%、柠檬酸氢二铵0.2%。该培养基在MRS培养基基 础上进行优化，使其最适于猪源罗伊氏乳酸杆菌，接种到该培养基的猪源罗伊氏乳酸杆菌 的活菌数是同时接种到MRS培养基上的猪源罗伊氏乳酸杆菌活菌数的6倍。由于本发明提供的猪源罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂，主要特点在于冻干制剂配方， 而其中的罗伊氏乳酸杆菌为普通动物肠道常见的益生菌，如猪、鸡肠内都有发现此菌，因 此，该猪源罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂在动物饲料中都可以添加，本发明将该冻干制剂用于 猪饲料中只是一种优选方案而已。综上所述，本发明提供的猪源罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂的冻干保护剂，能为罗伊 氏乳酸杆菌提供良好的冻干保护，能得到较高的菌存活率与保存稳定性，且生产工艺简单， 成本合理，使本发明的冻干制剂非常适于应用到动物饲料中。具体实施方法实施例1猪源罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂的制备
1. 1猪源乳酸杆菌的分离鉴定将仔猪剖杀，无菌操作刮取盲肠黏膜lg，置于盛有9ml无菌生理盐水的带有玻璃 珠的三角瓶中，充分震荡摇勻，然后吸取1. Oml菌液于盛有9. Oml无菌生理盐水的试管中， 此稀释度为10—1，重复以上过程，依次制成10_2、10_3、10-4、10_5、10_6的菌液。选择10_4、10_5、 10_6三个稀释度，吸取0. Iml菌液分别滴于MRS培养基平板上，采用烛缸法37°C培养24 48h，挑取形态不同的菌落在MRS培养基上划线接种做纯培养，而后置于4°C冰箱保存备用。然后挑取纯培养物进行染色，镜检；选取无芽孢革兰氏阳性杆菌进行接触酶、硝酸 盐还原、明胶液化等生化实验，以及糖醇发酵试验，结果与《常见细菌系统鉴定手册》、《乳酸 细菌分类及实验方法》对照，确定菌种。然后送至中国工业微生物菌种保藏中心进行鉴定检 验。中国工业微生物菌种保藏管理中心对该乳酸杆菌为罗伊氏乳酸杆菌 (Lactobacillusreuteri)的鉴定结果如下表1猪源罗伊氏乳酸杆菌生理生化特征试验报告
生理生化特征氧化酶—接触酶—硝酸盐还原—从精氨酸产氨+产酸苦杏彳苷+葡萄糖+松二糖+蔗糖+H拉伯糖+葡萄糖酸钠+棉籽糖+海藻糖-纤维—糖乳糖+鼠李糖-木糖+七叶灵犮芽糖+核糖—蜜二糖+果糖-甘露醇-水杨苷—、丨乳糖+甘露糖+ W山梨醇—注表中“ + ”表示彡90%菌株阳性，“_”表示彡90%菌株阴性，“ND”表示未测定。1. 2猪源罗伊氏乳酸杆菌生物学特性1. 2. 1耐酸性能测定将菌种活化2次后，采用5%接种量，分别接入到pH = 1. 5、pH = 2. 0、pH = 3的 溶液中，置于371保温0.511、1.5、2.511，测定活菌数，计算存活率。由结果可知，罗伊氏乳酸 杆菌菌体随着PH的降低及保温时间的延长呈下降趋势。其中，在PH= 1.5保温2h对菌体 损伤最大，其存活率仅为17. 50%。表2猪源罗伊氏乳酸杆菌耐酸性能测定
权利要求
猪源罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)冻干制剂，其特征在于冻干制剂中保护剂的组分及各组分的重量百分比为脱脂乳10％、谷氨酸钠0.1％、半胱氨酸0.3％、海藻糖10％、乳糖8％、糊精10％，其余为水。
2.根据权利要求1所述的冻干制剂，所述猪源罗伊氏乳酸杆菌活菌数>109cfu/g。
3.根据权利要求1所述的冻干制剂，所述猪源罗伊氏乳酸杆菌来源于断奶仔猪盲肠黏膜。
4.权利要求1 3任一所述猪源罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂的制备方法，其步骤为将 猪源罗伊氏乳酸杆菌进行发酵扩大培养，离心发酵液后取菌泥，将菌泥加入到所述保护剂 中，混勻、冻干即可。
5.根据权利要求4所述的制备方法，所述发酵扩大培养中接种量为1%，发酵温度为 37°C，pH为6. 4 6. 5，发酵时间为24h。
6.根据权利要求4所述的制备方法，所述发酵扩大培养中采用的培养基的组分及各组 分的重量百分比为麦芽糖2%、酪蛋白胨1. 5%、酵母粉0. 5%、磷酸氢二钾0. 4%、乙酸钠 0. 7 %、硫酸镁0. 058 %、硫酸锰0. 019 %、吐温0. 1 %、牛肉膏1 %、柠檬酸氢二铵0.2%。
7.权利要求1 3任一所述猪源罗伊氏乳酸杆菌剂冻干制剂在动物饲料添加剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，所述动物为家畜。
9.根据权利要求8所述的应用，所述家畜为猪。
全文摘要
本发明涉及“猪源罗伊氏乳酸杆菌干制剂及其制备方法”，属于微生物的应用领域。猪源罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)冻干制剂，其特征在于冻干制剂中的保护剂的组分及各组分的重量百分比为脱脂乳10％、谷氨酸钠0.1％、半胱氨酸0.3％、海藻糖10％、乳糖8％、糊精10％，其余为水。本发明的猪源罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂经试验证明能够增加保育猪粪中乳酸菌活菌含量，降低大肠杆菌含量，并具有提高保育猪平均日增重和免疫力的作用。本发明制备的冻干制剂中活菌数≥109cfu/g，该冻干制剂能够保证保存90天后活菌存活率在75％以上。本发明还为罗伊氏乳杆菌提供了优化培养基，比常规培养基(MRS培养基)上培养的活菌数要高6倍以上。
文档编号A23K1/16GK101971920SQ20101029563
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者刘辉, 季海峰, 张董燕, 王四新, 王雅民 申请人:北京市农林科学院