专利名称：两形真杆菌制剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及凸腹真杆菌和两形真杆菌制剂及其应用，具体涉及凸腹真杆菌和两形真杆菌单独或组合作为主要活性成份制成微生态制剂，及该微生态制剂在治疗相关疾病中的应用，属于生物药领域。
背景技术：
目前，抗菌药在临床和养殖业等方面滥用的危害已引起重视，由于微生态制剂没有副作用，利用微生态制剂治疗相关疾病、保健及作为兽药和饲料添加剂已得到广泛应用。目前的微生态制剂主要成份包括双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等，治疗相关疾病疗效不是非常理想。丁酸(酪酸)已经被证实是结肠能量的首选来源，提供肠粘膜70%的能量，促进肠粘膜细胞增殖生长及消化系统发育成熟，同时丁酸也是调节免疫的重要物质。本发明微生态制剂进入肠道由于能够分泌大量酪酸，治疗相关疾病疗效显著，并可作为保健品、兽药和饲料添加剂应用，社会意义巨大，且未见相关研究报道，特申请此发明专利。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的微生态制剂，该微生态制剂中的主要活性成份进入肠道能产生大量丁酸，修复肠粘膜，调节免疫，抑制炎症因子过度表达，同时该微生态制剂还能恢复肠道菌群平衡和提高机体及粘膜免疫，有效治疗消化系统疾病、营养吸收障碍性疾病、自身免疫性疾病、心脑血管疾病、变态反应性疾病、手足口病及提高免疫和抗癌。其中所述消化系统疾病包括腹泻、肠易激综合征、冷凉泻、喝酒泻、溃疡性结肠炎、克罗恩病、抗生素相关性腹泻、伪膜性肠炎、小儿肺炎继发性腹泻、肠癌、肿瘤放化疗辅助治疗、腹胀和 消化不良、便秘、便臭、便臭中毒综合征、肝胆疾病、病毒性腹泻、喂养不耐受、坏死性小肠结肠炎、黄疸、口腔溃疡、鹅口疮、促进小儿肠道发育成熟、促进消化吸收、营养保健和生长发育；所述营养吸收障碍性疾病包括佝偻病；所述自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、强直性脊柱炎；所述心脑血管疾病包括高脂血症、高血压、脑血栓、脑栓塞、脑缺血、心肌梗塞、冠心病、脑梗死、脑出血、心绞痛、心肌炎、动脉粥样硬化；所述变态反应性疾病包括湿疹；所述提高免疫包括治疗反复呼吸道感染。本发明的微生态制剂的制备优选是通过下述步骤实施的，但不局限于此制备工艺，公知的能实现的制备工艺均可以采取含凸腹真杆菌或两形真杆菌的样本，优选人或动物粪便，更优选健康婴儿粪便，然后将样品置于灭菌厌氧瓶内，吹入氮气同时充分混合，迅速从中取2克样品加入ISmL灭菌的稀释液中，吹入氮气同时充分混匀，在无菌操作台内，进行10' 10_2、10' 1θΛ 10_5，10_6，10_7梯度稀释，取10_5，10_6，10_7三个稀释梯度，分别涂布于凸腹真杆菌或两形真杆菌选择性单菌落分离固体培养基上，置于厌氧罐内，厌氧37°c下培养48小时，选择长势良好的单菌落分别接种于液体扩增培养基中，置于厌氧罐内，厌氧37°C下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出各菌种的干燥菌粉，然后进行菌种鉴定、产丁酸实验和毒性试验，将鉴定的无毒性凸腹真杆菌或两形真杆菌干燥菌粉单独或组合按需要比例添加辅料制成片剂、胶囊和散剂等各种剂型或兽 药、饲料添加剂。凸腹真杆菌或两形真杆菌选择性单菌落分离固体培养基优选但不局限于纯化水IOOmL,胰蛋白胨Ig,酵母浸膏O. 5g,磷酸氢二钠O. 4g,葡萄糖O. 15g,可溶性淀粉O. 05g,L-半胱氨酸O. 02g, L-半胱氨酸盐酸盐O. 05g,琼脂I. 5g，调pH值7. 7，115°C，20分钟高压灭菌。灭菌后在冷却到60°C后加入5mL脱纤维马血，ES溶液4mL。其中ES溶液丙酸纳30%，硫酸链霉素4*%，硫酸巴龙霉素2*%，硫酸多粘囷素BO. 02%。凸腹真杆菌或两形真杆菌液体扩增培养基优选但不局限于绞碎的牛肉500g，蒸馏水11，IN NaOH 25. OmL，用精牛肉或马肉，绞碎去除脂肪和连接组织，混合肉、水和氢氧化钠煮沸，同时搅拌，冷却至室温，略去表面的脂肪并过滤，保留滤液，补充足够的蒸馏水滤液恢复I升原体积。向每IOOmL滤液中添加蛋白胨2. Og、葡萄糖O. 5g、酵母浸膏I. Og、盐酸半胱氨酸O. 05g、盐溶液4. OmL,维生素Kl溶液O. lmL、5mg/mL氯化血红素溶液O. 5mL，调pH至7. 2 士 O. 1，在厌氧管内通入97%的氮，3%的氢，盖紧丁基橡胶瓶塞帽，121°C高压灭菌15min。其中1、盐溶液的配制称取无水氯化钙O. 2g，硫酸镁O. 2g，磷酸氢二钾lg，磷酸二氢钾lg，碳酸氢钠IOg,氯化钠2g,加蒸懼水至IOOOmL ;2、氯化血红素溶液(5mg/mL)的配制称取氯化血红素0. 5g溶于lmol/L氢氧化钠ImL中，加蒸馏水至lOOmL，121°C高压灭菌15min，冰箱保存；3、维生素K1溶液的配制称取维生素K1Ig加无水乙醇99mL，过滤除菌，放冷暗处保存。本发明优选使用的凸腹真杆菌的细菌学性质I、菌落形态显微镜观察长I. 5-2微米，宽0. 5微米，短杆，革兰氏染色阳性。平板形态菌体呈圆形、凸起、周边整齐、光滑；颜色灰色，不透明。2、生理生化鉴定石蕊牛奶_ ;脂酶_ ;明胶液化_ ;过氧化氢酶_ ;精氨酸产氨_ ;七叶苷水解+ ;吲哚-;硫化氢乙酰甲基甲醇试验(V-P试验)-;是否需氧厌氧性。3、糖酵解实验鉴定纤维二糖_ ；D-果糖+ ；D-半乳糖+ ;匍萄糖+ ；D-甘露糖+ ；D-棉子糖-；鼠李糖;山梨糖_ ;松三糖_ ;蔗糖_ ;海藻糖_ ;木糖+ ;麦芽糖+ ;淀粉+ ;蜜二糖+ ;核糖+ ;甘油_ ;七叶灵+ ;阿拉伯糖_ ;果糖+。本发明优选使用的两形真杆菌的细菌学性质I、菌落形态显微镜观察长2. 0-5微米，宽I. O微米，中长杆，革兰氏染色阳性。平板形态菌体呈圆形、凸起、周边整齐、光滑；颜色灰色，不透明。
2、生理生化鉴定石蕊牛奶_ ;脂酶_ ;明胶液化_ ;过氧化氢酶_ ;精氨酸产氨_ ;七叶苷水解+ 引哚_;硫化氢_ ；v-p试验-;是否需氧厌氧性。
3、糖酵解实验鉴定纤维二糖-；D-果糖+ ；D-半乳糖+ ;匍萄糖+ ；D-甘露糖+ ；D-棉子糖-；鼠李糖;山梨糖_ ;松三糖_ ;蔗糖_ ;海藻糖+ ;木糖_ ;麦芽糖_ ;淀粉_ ;蜜二糖_ ;核糖_ ;七叶灵+ ;甘油_ ;阿拉伯糖_。发明人利用上述方法通过凸腹真杆菌或两形真杆菌选择性单菌落分离固体培养基分离鉴定出了凸腹真杆菌或两形真杆菌。本发明所述凸腹真杆菌优选但不限于凸腹真杆菌(Eubacterium ventriosum)、CGMCC、保存编号2465。本发明所述两形真杆菌优选但不限于两形真杆菌(Eubacterium biforme)、CGMCC、保存编号2466。本发明所述的凸腹真杆菌或两形真杆菌指活生物个体。 本发明是以有效剂量的上述凸腹真杆菌或两形真杆菌单独或组合作为主要药物活性成份，按照一定的制剂工艺，加入常规的赋形剂、调味剂、崩解剂、防腐剂、润滑剂、湿润齐U、黏合剂、溶剂、增稠剂、增溶剂等药物辅料，制成任何一种适合于临床上使用的剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂、灌肠剂等剂型。本发明所述以有效剂量的上述凸腹真杆菌或两形真杆菌单独或组合作为主要药物活性成份制成活菌微生态制剂，也可以是上述凸腹真杆菌或两形真杆菌单独或组合与双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌等益生菌中的一种或几种或其他活性成份组合制成活菌微生态制剂，以起到协同治疗作用，提高治疗效果。本发明中的微生态制剂在临床上的用量，因患者年龄、体重及症状、用药目的所决定的用药方式和方法、治疗效果及用药时间等因素而不同，正确的用量应该由医师来决定，且应用剂量也是临床医生根据病情很容易掌握和调整的。本发明所指有效剂量是指以上述凸腹真杆菌或两形真杆菌根据上面所述单独或组合作为主要药物活性成份制成的固体活菌制剂包含的总活菌数不能低于IX 106CFU/g，一般在I X 107CFU/g以上，最高可达到I X 1012CFU/g或I X 1012CFU/g以上。本发明所指有效剂量是指以上述凸腹真杆菌或两形真杆菌根据上面所述单独或组合作为主要药物活性成份制成的液体活菌制剂包含的总活菌数不能低于I X 106CFU/mL,一般在 IX 107CFU/mL 以上，最高可达到 IX 1012CFU/mL 或 I X 1012CFU/mL 以上。由于本发明首次公开了凸腹真杆菌或两形真杆菌在作为主要活性成份制成微生态制剂中的应用，因此含上述凸腹真杆菌或两形真杆菌的药剂均属于本发明的保护范围。本发明所述的凸腹真杆菌或两形真杆菌中的任何一个菌株，包括凸腹真杆菌CGMCC2465株和两形真杆菌CGMCC2466株，在制成任何一种剂型时，均具有治疗上述疾病的作用。任何药剂，如果其组份中含有上述凸腹真杆菌或两形真杆菌中的任何一个菌株成份制备成药，在其包装或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提示具有治疗上述疾病的作用，则落入本发明的保护范围之内。本发明所述的凸腹真杆菌或两形真杆菌中的任何一个菌株，包括凸腹真杆菌CGMCC2465株和两形真杆菌CGMCC2466株可以制成保健品或饮品。将上述凸腹真杆菌或两形真杆菌中的任何一个菌株制成的保健品或饮品，如果在其包装或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提示具有治疗上述疾病的作用，则落入本发明的保护范围之内。本发明所述的凸腹真杆菌或两形真杆菌中的任何一个菌株，包括凸腹真杆菌CGMCC2465株和两形真杆菌CGMCC2466株可以制成兽药或饲料添加剂。将上述凸腹真杆菌或两形真杆菌中的任何一个菌株制成兽药或饲料添加剂，则落入本发明的保护范围之内。
具体实施例方式药物制备例说明上述已经对凸腹真杆菌和两形真杆菌的制备进行说明，这里通过以凸腹真杆菌CGMCC2465株和两形真杆菌CGMCC2466株为例，说明凸腹真杆菌散剂、两形真杆菌散剂和凸腹真杆菌两形真杆菌二联活菌散剂(以下简称二联活菌)的制备方法，其他凸腹真杆菌和两形真杆菌菌株制剂的制备方法本领域技术人员通过本实施例很容易掌握，其他剂型的制备方法本领域技术人员通过本实施很容易掌握，在此不再一一叙述说明。 制备方法并不局限于本发明实施例所述，公知的能够达到制备目的的方法均可以，实施例的制备说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。药物制备实施例I 口服凸腹真杆菌活菌散剂、口服两形真杆菌活菌散剂和二联活菌散剂的制备I菌粉的制备和菌种的鉴定采取山东省胶南市一健康婴儿粪便，然后将粪便置于灭菌厌氧瓶内，吹入氮气同时充分混合，迅速从中取2克粪便加入18mL灭菌的稀释液中，吹入氮气同时充分混匀，在无菌操作台内，进行10' 10_2、10' 10_4、10_5、10' 10_7梯度稀释，取10_5、10_6、10_7三个稀释梯度，涂布于凸腹真杆菌或两形真杆菌选择性单菌落分离固体培养基上，置于厌氧罐内，厌氧37°C下培养48小时，选择长势良好的两个单菌落分别接种到凸腹真杆菌或两形真杆菌液体扩增培养基中，置于厌氧罐内，厌氧37°C下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出两个菌种的干燥菌粉，然后根据上述方法进行菌种鉴定，经鉴定为凸腹真杆菌CGMCC2465株和两形真杆菌CGMCC2466株。2产丁酸实验将分离到的凸腹真杆菌和两形真杆菌分别接种到液体扩增培养基中，置于厌氧罐内，厌氧37°C下扩增培养48小时，离心(12000rpm)，取上清液用气相检测代谢产物丁酸含量分别为7. 8mmol/L和8. 2mmol/L，表明均能产丁酸。3生理生化鉴定经鉴定均不产生硫化氢、吲哚、氨等有害物质。4毒性试验4. I动物及分组取30只SPF级别小鼠，6 8周龄，体重16 19g，随机分入凸腹真杆菌组、两形真杆菌组和未给药组，每组10只。4. 2制备菌液将上述凸腹真杆菌菌粉和两形真杆菌菌粉用纯化水调制为含菌数均为 lX1012CFU/mL 的菌液。4. 3方法凸腹真杆菌组、两形真杆菌组和未给药组均给予相同的基础饲料，且饲养条件均一致，凸腹真杆菌组每天灌服凸腹真杆菌菌液O. 5mL，两形真杆菌组每天灌服两形真杆菌菌液O. 5mL,未给药组每天灌服纯化水O. 5mL，饲喂6个月，观察体重及毒性反应。4. 4 结果各组小鼠均未出现异常情况，未发生振颤、痉挛、运动失调、姿态异常，无眼球突出，排尿正常，皮肤、呼吸正常，无死亡情况，且凸腹真杆菌组、两形真杆菌组的体重增加显著高于未给药组(P < O. 05)，表明凸腹真杆菌和两形真杆菌有促进生长发育作用，说明两菌株效果良好，未见中毒反应，结果见表I。
·
表I小鼠体重增加情况
服用时间凸腹真杆菌组两形真杆菌组未给药组
开始 18. 25士O. 3018. 34±0. 4118. 31 ±0.25
服用 I 个月 39.13±1_1238.67±1.5435. 13±1.28
服用 2 个月 45. 67土I. 5945. 57土 I. 6739.68±1.58
服用 3 个月 47. 16±2. 5847. 10±2·4241.25±3. 15
服用 4 个月 49. 21±3·6850·11±4. 13Φ1. 15±3. 67
服用 5 个月 51.65±5. 0151.29±4. 3545. 89±4. 65
服用 6 个月_52. 56土4. 9552.45±4. 2846. 98±4. 635制备成散剂等剂型根据上述步骤和方法分离鉴定凸腹真杆菌和两形真杆菌后，经实验检验产丁酸、不产毒素、无毒性，就可制成菌粉，然后按照需要添加相关辅料制成各种剂型，优选据凸腹真杆菌和两形真杆菌菌粉的活菌数，按比例添加脱脂奶粉、葡萄糖制成散剂，使总活菌数不低于I X IO7CFU,然后将两菌的菌粉单独或组合装袋，制成口服凸腹真杆菌活菌散剂、口服两形真杆菌活菌散剂和二联活菌散齐 。应用效果实施例说明虽然凸腹真杆菌和两形真杆菌有许多菌株，但按上述方法分离的不同菌株具有相同的生物学特性，且作用机理相同，包括进入肠道分泌大量丁酸、补充肠道有益菌恢复肠道菌群平衡、提高机体和粘膜免疫等，因此本发明选用按上述方法分离的凸腹真杆菌和两形真杆菌菌株为研究对象，介绍凸腹真杆菌和两形真杆菌的应用效果O实施例I、凸腹真杆菌和两形真杆菌对肠粘膜的修复作用研究I材料与方法I. I 材料I. I. I药物凸腹真杆菌菌液(107CFU/mL);两形真杆菌菌液(107CFU/mL) ; 二联活菌菌液(107CFU/mL);双歧杆菌菌液(107CFU/mL);右旋葡聚糖硫酸钠(DSS，IOg/瓶，Sino-American Biotec);爱尔新蓝(lg/ 瓶，Sino-American Biotec)。I. I. 2动物SD雄性大白鼠70只，体重80 100g，标准2级，购自中国药品生物制品检定所实验动物中心。I. 2 方法I. 2. I肠粘膜损伤造型和治疗
大鼠70只，10只大鼠作为正常对照组，另60只大鼠用3% DSS溶液给空腹大鼠灌胃(lmL/100g)，每天I次，共7天，最后一次从肛门加注DSS ImL/只至直肠内。然后处死其中10只(模型对照组)，剖腹取结直肠，测定结直肠湿重(g/100g.体重)，甲醛固定，用爱尔新蓝溶液染色，肉眼观测溃疡和糜烂部分的点数，用卡尺测量蓝染点的蓝染面积(cm2)，证实溃疡形成后，将其余50只模型大鼠随机分为5组，每组10只，分别灌胃生理盐水、凸腹真杆菌菌液(107CFU/mL)、两形真杆菌菌液(107CFU/mL)、二联活菌菌液(107CFU/mL)、双歧杆菌菌液(107CFU/mL)，ImL/次，每天2次，共21天。21天后处死全部大鼠，按上法处理结直肠标本，检测相应指标。I. 2. 2统计学分析各组间的数据差异的统计学显著性检验，用t-student’t检验，差异显著性界限为P < O. 05。2 结果2. I结直肠溃疡(或糜烂)点数与面积
用DSS灌胃，加直肠给DSS后可在整个结直肠形成典型的大鼠肠粘膜损伤，尤其结肠下端和直肠的肠标本用爱尔新蓝染色后，肠粘膜可见明显深染的不规则的溃疡点或糜烂点。结直肠溃疡(糜烂)点数及溃疡面积凸腹真杆菌治疗组、两形真杆菌治疗组、二联活菌治疗组与模型对照组、生理盐水模型对照组或双歧杆菌治疗组比较均有很显著性差异(P
<0.01)，而凸腹真杆菌治疗组、两形真杆菌治疗组、二联活菌治疗组之间无显著性差异(P
>O. 05)，凸腹真杆菌治疗组、两形真杆菌治疗组、二联活菌治疗组和模型对照组治疗前排稀便，偶尔带血，治疗后凸腹真杆菌治疗组、两形真杆菌治疗组、二联活菌治疗组均排正常便，模型对照组仍然排稀便。见表2。表2各种菌对肠粘膜的修复作用
权利要求
1.一种新型微生态制剂，其特征在于该微生态制剂是用两形真杆菌作为活性成份制成制剂。
2.按权利要求I所述微生态制剂，其特征在于有效剂量的两形真杆菌作为活性成份制成药品组合物、保健品、饮品、兽药和饲料添加剂。
3.按权利要求I所述应用，其特征在于两形真杆菌指活的生物个体。
4.按权利要求I所述应用，其特征在于两形真杆菌QE-Ol保藏编号CGMCC2466。
5.按权利要求I所述微生态制剂，其特征在于在制备治疗消化系统疾病、营养吸收障碍性疾病、自身免疫性疾病、心脑血管疾病、变态反应性疾病、提高免疫力、抗癌、手足口病组合物中的应用。
6.按权利要求5所述应用，其特征在于消化系统疾病包括腹泻、肠易激综合征、冷凉泻、喝酒泻、溃疡性结肠炎、克罗恩病、抗生素相关性腹泻、伪膜性肠炎、小儿肺炎继发性腹泻、肠癌、肿瘤放化疗辅助治疗、腹胀和消化不良、便秘、便臭、便臭中毒综合征、养颜美容、肝胆疾病、病毒性腹泻、喂养不耐受、坏死性小肠结肠炎、黄疸、口腔溃疡、鹅口疮、促进小儿肠道发育成熟、促进消化吸收、营养保健和生长发育。
7.按权利要求5所述应用，其特征在于营养吸收障碍性疾病包括佝偻病。
8.按权利要求5所述应用，其特征在于自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、强直性脊柱炎。
9.按权利要求5所述应用，其特征在于心脑血管疾病包括高脂血症、高血压、脑血栓、脑栓塞、脑缺血、心肌梗塞、冠心病、脑梗死、脑出血、心绞痛、心肌炎、动脉粥样硬化。
10.按权利要求5所述应用，其特征在于变态反应性疾病包括变态反应性皮肤病，进一步包括湿疹。
11.按权利要求5所述应用，其特征在于提高免疫力包括治疗反复呼吸道感染。
全文摘要
本发明涉及两形真杆菌制剂及其应用，具体涉及两形真杆菌作为主要活性成份制成微生态制剂，及该微生态制剂在治疗相关疾病中的应用，该微生态制剂包括药品组合物、保健品、饮品、兽药和饲料添加剂。
文档编号A61K35/74GK102940652SQ20121022856
公开日2013年2月27日 申请日期2008年5月28日 优先权日2008年5月28日
发明者崔云龙, 李洪福, 王发合 申请人:青岛东海药业有限公司, 北京普尔康医药高科技有限公司