专利名称：一种用于防治棉铃疫病的萎缩芽孢杆菌及其微生物菌剂的制作方法
技术领域：
本发明属于农业微生物领域，具体涉及一种用于防治棉铃疫病的萎缩芽孢杆菌和含有该萎缩芽孢杆菌的微生物菌剂，以及它们在防治棉铃疫病上的应用。
背景技术：
棉铃疫病是一种严重的棉花病害，由芒麻疫霉(Phytophthora boehmeriaesawada)引起，它不仅直接为害棉铃，而且为其它病原菌提供了侵染条件。防治棉铃疫病的方法主要是推株并垄、早摘烂铃等栽培措施和化学药剂防治。目前，我国种植棉花的经济效益较低，而且人工费较高，农民不愿投入太多精力来推株并拢；早摘烂铃只能保住部分产量，不足以防控棉铃疫病；化学药剂虽然防治效果较好，但存在容易产生抗药性，化学药剂价格较贵，增加生产成本，以及环境污染等问题。因此，亟需寻找一种省时省力、高效并且成 本低廉的防治方法。利用有益微生物对植物病害进行生物防治，因具有针对性强、防效高且环保等优点越来越受到重视。特别是在蔬菜气传病害和作物土传病害上应用较多。有关棉铃疫病的生物防治方面研究很少。马平等(马平等.生物防治通报.1993.9(3))发现木霉菌和腐霉菌对棉铃疫病具有一定防治效果，并筛选到生防细菌MB-3和MB-7，其发酵液10倍稀释液对棉铃疫病田间防治效果分别为34. 9%和45. 4% (马平等 中国生物防治 1998. 14(2))。芽孢杆菌(Bacillus)具有分布广、易分离培养、能产生抗逆性较强的芽孢、贮藏期长和使用方便等优点，是一种理想的生防微生物，相比其他类型的生防因子，更有利于菌剂的生产，剂型加工，在环境中存活、定殖与繁殖。因此，筛选对病原菌具有抑制作用的芽孢杆菌是防治有关植物病害的最有效方法之一。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于防治棉铃疫病的萎缩芽孢杆菌菌株，该菌株具有高效、广谱杀菌活性等优点。本发明第二目的在于提供一种微生物菌剂。本发明第三目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。本发明第四目的在于提供上述萎缩芽孢杆菌菌株在防治棉铃疫病上的用途。本发明第五目的在于提供上述微生物菌剂在防治棉铃疫病上的用途。本发明通过以下技术方案实现一种萎缩芽抱杆菌(Bacillus atrophaeus)菌株 HMB22922,己于 2011 年 12 月 20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No. 5614。一种微生物菌剂，其活性成分为萎缩芽孢杆菌HMB22922菌体和它的胞外代谢产物。上述微生物菌剂可以为液体制剂。
上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤菌种活化，种子液制备和发酵培养。上述微生物菌剂的制备方法，具体包括如下步骤(I)菌种活化将低温保存的HMB22922菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上30°C培养24 36小时，得活化的菌株；(2)种子液制备用无菌的接种环刮取一环步骤(I)活化的菌株接种到IOOmLLB液体培养基中，在26 34°C、摇床转速为170 210rpm条件下培养22 25小时，得种子液；(3)发酵培养按照体积比为0. 5% 3. 0%的比例将步骤⑵的种子液接入到蔗糖豆饼粉培养基(PH值为5. 8 6. 2)中，在温度为28 34°C、摇床转速为170 210rpm 的条件下发酵培养36 54h，得发酵液；所述的蔗糖豆饼粉培养基，其组成成分及其重量百分比为:蔗糖 2. 0 3. 0%，豆饼粉 I. 6 2. 4%，NaCl 0. I 0. 2%，CaCO3 0. I 0. 3%，KH2PO4 0. 01 0. 03%和 MgSO4 7H20 0. 01 0. 03%，其余为水；(4)检测发酵液中菌体和芽孢数量，待发酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌体总数的90%时停止发酵培养；所得即为HMB22922菌株的液体制剂。上述制备方法步骤(2)和(3)中所述的温度优选为30 32°C ;所述的摇床转速优选为210rpm ;所述的培养时间优选为48h。所述的LB平板培养基、LB斜面培养基和LB液体培养基等按照常规方法制备。所述的蔗糖豆饼培养基的制备方法，按照重量百分比将蔗糖、豆饼粉、NaCl、CaCO3> KH2PO4和MgSO4 7H20混合，再加水，搅拌均匀即可。上述微生物菌剂，其萎缩芽孢杆菌HMB22922的活菌数大于8. 37 X 108cfu/mL。所述的萎缩芽孢杆菌HMB22922在防治棉铃疫病上的应用。上述微生物菌剂在防治棉铃疫病上的应用。本发明微生物菌剂的使用方法将上述所得微生物菌剂用水稀释至活菌数为107cfu/mL，于棉铃疫病发病前进行棉铃表面、中下部叶片喷雾，即可达到控制棉铃疫病的目的。HMB22922菌株的筛选分离过程HMB22922菌株是河北省农林科学院植物保护研究所从河北省辛集市玉米田土壤中分离得到的。2010年河北省农林科学院植物保护研究所从河北省辛集市玉米田中五点采集根际土壤，混勻后称取5g放到250mL的灭菌三角瓶中，加入IOOmL无菌水,放到摇床上，170r/min振荡30min，静置2h，取上清液ImL加无菌水9mL，即成lOmLlO—2倍土壤微生物悬液，继而将土壤悬液稀释成10_3、10_4、10_5、10_6倍稀释液，各浓度取200 u L微生物悬液涂于LB和KB培养基平板上，每个浓度3次重复，在28°C恒温培养ld_3d，进行细菌的分离和纯化。并以棉铃疫病为靶标，利用平板对峙和离体青铃人工接种进行生防菌的筛选。结果从中筛选出一个对靶标病害具有明显防治效果的细菌菌株，定名为HMB22922。HMB22922菌株的分类鉴定(I)形态特征鉴定在LB培养基上培养菌体为杆状，培养IOh后产生芽孢，芽孢中生，椭圆形，孢囊不膨大，抗酸染色阴性，无伴孢晶体，能运动，鞭毛周生。在营养琼脂平板上，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落淡黄色，边缘不整齐，表面干燥有褶皱；在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形；在液体培养基中静止培养，表面形成白色菌膜。与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著，科学出版社，2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断菌株HMB22922属于芽孢杆菌(Bacillus)o(2)利用16S rDNA序列鉴定分类以HMB22922的基因组DNA为模板，以F27和R1492为引物对16S rDNA进行PCR扩增，所述的引物序列为F27 5，AGAGTTTGATCATGGCTCAG3，； (SEQ ID No 2),R1492 :5’ GGCTACCTTGTTACGACTT3’ ； (SEQ ID No 3)；16S rDNA 的扩增反应体系为 50 y L:10XPCR Buffer (Mg2+) 5 u L ；dNTPMixture(2. 5mM) 5 u L ；Taq(5U/u L) I u L, F27(10 u mol/L) I u L, R1492(10 u mol/ L)luL ；HMB22922 的基因组 DNA 50ng ；ddH20 补足至 50 y L。PCR 的反应条件为 95 °C 5min ；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C I. 5min，30个循环-,1 TC IOmin0将所得PCR扩增产物进行凝胶电泳，送交上海生工生物工程有限公司测序，得到HMB22922的16S rDNA序列(见SEQ ID No I)。将所得HMB22922的16S rDNA序列在Genbank中进行同源性比较，结果菌株HMB22922与芽孢杆菌属的16S rDNA同源性达到99% (见图3);构建系统发育树(见图2)，HMB22922与萎缩芽孢杆菌聚合到一起，说明HMB22922是萎缩芽孢杆菌(B. atrophaeus)。(3)利用生理生化特征鉴定分类利用Biolog微生物自动鉴定系统可以测试菌株HMB22922对95种碳源的利用情况从而进一步确定其种属特征，提高菌株鉴定的可靠性。先将待测菌株的纯培养菌落接入无菌水中，振荡器震荡制成细胞悬液，然后用多道移液枪接种于96孔GNIII鉴定板上培养，再用Biolog Microstation软件读取数据,确定碳源利用情况。通过与BIOLOG系统数据库MicroLog software (Release Version 4.20.04)比对，可知待测菌株的分类。将 HMB22922菌株送交中国农业大学，利用Biolog微生物自动鉴定系统进行鉴定分类，鉴定结果表明HMB22922属于萎缩芽抱杆菌(B. atrophaeus)。综合以上形态特征、16S rDNA序列同源性对比分析，以及生理生化特征鉴定的结果，可知HMB22922属于萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus),并且和现有的芽孢杆菌菌株不同，是一个新的萎缩芽孢杆菌菌株。本发明具有的优点和有益效果(I)本发明为防治棉铃疫病提供了一种有效的生物防治途径；(2)本发明对棉铃疫病的防治效果好，平均防效在80%以上，且针对性强；(3)本发明微生物菌剂对人、畜安全，没有环境污染；(4)利用本发明防治棉铃疫病不易产生抗药性；(5)本发明微生物菌剂制备方法简单、成本低、使用方便。
图I.为萎缩芽孢杆菌HMB22922对棉铃疫病菌的拮抗作用图，其中A为萎缩芽孢杆菌HMB22922，B为棉铃疫病菌。图2.为HMB22922菌株根据16S rDNA序列获得的系统发育树图。图3.为本发明HMB22922菌株与萎缩芽孢杆菌1942菌株(B. atrophaeus 1942)的16S rDNA基因序列同源性比较图谱；其中萎缩芽孢杆菌1942菌株序列中表示与HMB22922相应的碱基相同，“g、a、C、t”表示萎缩芽孢杆菌1942菌株序列中与HMB22922相应位点的碱基为g、a、c、t ”表示对应位点的碱基缺失。
具体实施例方式实施例IHMB22922微生物菌剂的制备，按照如下步骤进行(I)菌种活化将保存于-40 °C的菌株HMB22922 (萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)菌株HMB22922已于2011年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5614)在LB平板培养基(其组成成分及其重量比为胰蛋白胨Ig酵母提取物0. 5g，氯化钠lg，琼脂粉15g，水IOOOmL)上进行活化(30°C )，挑取单菌落在LB斜面培养基(其组成成分及其重量比为胰蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g，、氯化钠lg，琼脂粉15g，水IOOOmL)上，在30°C下培养24 36小时；得活化的菌株；(2)种子液的制备按常规方法制作LB液体培养基(其组成成分及其重量比为胰蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g，氯化钠lg，水IOOOmL)，在250mL三角瓶中装入LB液体培养基IOOmL,高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入步骤⑴中一接种环活化好的菌株，在摇床上进行振荡培养，转速190rpm、3(TC下培养24h，所得为种子液；(3)蔗糖豆饼培养基的制备按照重量百分比将蔗糖3.0%，豆饼粉2%，NaClO. I %, CaCO3 0. 3%, KH2PO4 0. 02% 和 MgSO4 7H20 0. 03% 加入水中，搅拌混合均匀，即得蔗糖豆饼培养基；分装于500mL三角瓶中，每瓶200mL ;在121°C对蔗糖豆饼培养基进行灭菌30分钟，再降温到30°C备用；(4)发酵培养向步骤(3)所得每瓶蔗糖豆饼培养基200mL中接种步骤⑵所得种子液2mL ;在30°C、摇床转速190rpm条件下进行发酵培养36h，以后每隔30分钟从三角瓶中取样进行镜检，对视野中的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢率(芽孢率(％)=成熟芽孢数/(成熟芽孢数+菌体数)X 100);芽孢率达到90%即可停止发酵培养；共发酵培养约45 50h，即得萎缩芽孢杆菌HMB22922液体制剂。实施例2萎缩芽孢杆菌HMB22922对棉铃疫病菌的拮抗作用试验(一 )、试验时间和地点2010年8月上旬在河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室内进行。( 二)试验方法(I)供试棉铃疫病菌来源棉铃疫病菌5-1采自河北省沧州市献县河街镇河街村棉株病铃，经河北省农林科学院植物保护研究所分离纯化，河北农业大学植物保护学院植物病理系鉴定为芒麻疫霉(Phytophthora boehmeriae),致病力测定表现为强致病力。(2)平板对峙实验首先将棉铃疫病菌5-1在PDA平板上活化，培养5天后在菌落边缘区域，用打孔器(0=6mm)打孔制成菌片，将棉铃疫病菌菌片转接在另一个PDA平板中央，再将活化后的萎缩芽孢杆菌HMB22922点接在距指示菌菌片2. 0厘米处，设空白对照(不点接HMB22922菌株的棉铃疫病菌生长情况)。25°C恒温培养，待空白对照即将长满整个培养皿时，测量棉铃疫病菌的对照生长量(菌落半径)和处理生长量(接种HMB22922后的抑制生长半径)，用拮抗作用抑菌率(抑菌率)=(对照生长量-处理生长量)/对照生长量X 100)表/Jn o(三)结果(表I)萎缩芽孢杆菌HMB22922对棉铃疫病菌的抑制率达85.71 % ;透明的抑菌带宽10. 0毫米(见图I)。说明萎缩芽孢杆菌HMB22922对棉铃疫病具有明显的抑制作用，具有防治棉铃疫病的生防潜力。表I萎缩芽孢杆菌HMB22922对棉铃疫病菌的拮抗试验结果
权利要求
1.一种萎缩芽抱杆菌(Bacillus atrophaeus)菌株 HMB22922,已于 2011 年 12 月 20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5614。
2.一种微生物菌剂，其特征在于其活性成分为萎缩芽孢杆菌HMB22922菌体和它的胞外代谢产物。
3.按照权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于HMB22922的活菌数大于8.37X 108cfu/mL。
4.按照权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于为液体制剂。
5.权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤 (1)将低温保存的HMB22922菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上30°C培养24 36小时，得活化的菌株； (2)用无菌的接种环刮取一环步骤(I)活化的菌株接种到IOOmLLB液体培养基中，在26 34°C、摇床转速为170 210rpm条件下培养22 25小时，得种子液； (3)按照体积比为0.5% 3.0%的比例将步骤(2)的种子液接入到蔗糖豆饼粉培养基中，在温度为28 34°C、摇床转速为170 210rpm的条件下发酵培养36 54h，得发酵液；所述的蔗糖豆饼粉培养基，其组成成分及其重量百分比为蔗糖2. 0 3. 0%，豆饼粉I.6 2. 4%,NaCl 0. I 0. 2%,CaCO3 0. I 0. 3%,KH2PO4 0. 01 0. 03%和 MgSO4 *7H200.01 0. 03%，其余为水； (4)检测发酵液中菌体和芽孢数量,待发酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌体总数的90%时停止发酵培养。
6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤(3)中所述的温度为30 32。。。
7.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤(3)中所述的摇床转速为210rpmo
8.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤(3)中所述的培养时间为48h。
9.权利要求I所述的萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)菌株HMB22922在防治棉铃疫病上的应用。
10.权利要求2所述的微生物菌剂在防治棉铃疫病上的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于防治棉铃疫病的萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)菌株HMB22922，于2011年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.5614。本发明还公开了利用该菌株生产的微生物菌剂及其制备方法，菌剂的活性成分为HMB22922菌体和它的胞外代谢产物。本发明HMB22922菌株对棉铃疫病有特异的防治作用，而且防效高，平均防效在80％以上；其次，本发明微生物菌剂对人、畜安全，没有环境污染问题；以及利用本发明防治棉铃疫病不易产生抗药性；此外，本发明微生物菌剂制备方法简单、成本低、使用方便。
文档编号A01N63/00GK102747005SQ20121002808
公开日2012年10月24日 申请日期2012年2月9日 优先权日2012年2月9日
发明者李宝庆, 李社增, 郭庆港, 马平, 鹿秀云 申请人:河北省农林科学院植物保护研究所