一种棉铃虫V-ATPase A基因cDNA及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种棉铃虫V-ATPase A基因的cDNA及其应用，设计与合成棉铃虫V-ATPase A siRNA，棉铃虫取食V-ATPase A siRNA后，V-ATPase A基因表达受阻，棉铃虫生长与代谢受抑制，死亡率提高，从而用于棉铃虫的生物防治。
【专利说明】-种棉铃虫V-ATPaseA基因cDNA及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于昆虫分子生物学与生理学领域，具体涉及棉铃虫V型ATP酶A亚基 (V-ATPaseA)cDNA的克隆，棉铃虫V-ATPaseA基因小RNA(siRNA)的设计，合成与对棉铃虫 幼虫的饲喂。
【背景技术】
[0002] 棉铃虫（Helicoverpaarmigera)，夜蛾科昆虫的一种，是棉花蕾铃期重要钻駐性 害虫，主要蛀食蕾、花、铃，也取食嫩叶。棉铃虫是一种世界性分布的害虫，国内各棉区均有 分布和为害，北方棉区比南方棉区受害严重。棉铃虫为多食性害虫，除为害棉花外，还能为 害小麦、玉米、高梁、大豆、豌豆、苜蓿、芝麻、番茄、辣椒、向日葵等作物，寄主植物多达20多 科200余种。20世纪90年代左右，棉铃虫在我国连年暴发成灾，给棉花、玉米和蔬菜等作 物生产带来了严重的威胁。据统计，1992年棉铃虫在我国各种作物上累计发生面积达2192 万公顷，造成直接经济损失逾百亿元。
[0003]目前表达有杀虫剂的转基因植物已成为世界上作物害虫治理的重要手段。2007 年，全世界此类转基因植物的种植面积为4210万公顷，占所有转基因植物总数的37%。其 中转有苏云芽孢杆菌（Bt)中杀虫剂基因的Bt棉全世界种植面积达1400万公顷。我国1997 年开始种植转基因Bt棉，至2007年已达到380万公顷。2011年，全世界转基因抗虫棉的种 植面积达到6600万公顷。
[0004] 但害虫基因突变可能危及转基因作物的抗虫功效，目前至少已发现9种害虫进化 出不同程度的Bt抗性。研究表明，棉铃虫在大田环境中比在实验室条件下更容易产生遗传 突变。中国北方转基因Bt棉田棉铃虫的大部分抗性等位基因为隐性的钙粘蛋白突变，包含 通过实验室筛选鉴定的删除突变。因此，寻找新的杀虫靶标，培育新的抗虫种质，避免或延 缓害虫抗性的产生是一项非常紧迫的工作。
[0005]RNA干扰（RNAInterference，RNAi)是由双链RNA(doublestrandedRNA，dsRNA) 引起的同源mRNA特异性降解的现象，小RNA(siRNA和microRNA)在RNA干涉机制中发挥 关键作用。RNA干涉普遍存在于植物、动物和真菌中，是真核生物中存在的一种抵抗病毒入 侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，在农业害虫生物防治领域具有广阔的应用 前景。1998年，Kennerdell与Carthew首次利用RNAi技术研究了黑腹果蝇frizzled与 frizzled〗基因的功能。随后的众多研究也表明，在注射或进食靶标序列dsRNA后，昆虫靶 标基因的表达也可被有效阻断。通过体外显微注射dsRNA可以成功敲除刺吸式口器害虫稻 飞虱不同表达模式的基因。黄曲条跳甲在注射跨膜气味受体基因PsOrldsRNA后，对十字 花科寄主的偏好性减弱。棉铃虫有一受棉酚诱导的P450基因GIP，当棉铃虫幼虫进食表达 dsGIP的转基因烟草后，幼虫中肠组织中GIP的转录水平被显著抑制并伴随过氧化氢酶活 性的上升，同时由于棉铃虫中肠内的GIP表达的下调而使幼虫生长受到抑制，对棉酚的耐 受性降低。此外，通过dsRNA饲喂对白蚁内源纤维素基因与Hexamerin储存蛋白基因的干 扰具有致死与致畸效应。经dsRNA饲喂后默R比亚按蚊的几丁质酶基因可被有效沉默。在 水稻中表达跨膜转运蛋白基因或羧肽酶基因dsRNA可提高水稻对稻褐飞虱的抗性。目前很 少有通过siRNA沉默害虫靶标基因的报道。
[0006]V型ATP酶（V-ATPase)是一种存在于几乎所有真核生物膜结构上的的质子泵之 一。它能将ATP水解所释放的能量转化为生物膜两侧的H+质子势能。H+质子势能进一步推 动细胞内各种生理反应的进行。例如存在于动物溶酶体膜上的V-ATPase利用ATP水解的能 量将胞质中的H+(氢离子）泵入溶酶体，在溶酶体内形成适宜的酸性环境从而使溶酶体内 的水解酶发挥正常功能。另外，V-ATPase作为质子泵还通过调节膜两侧的矿浓度来平衡膜 两侧阳离子如Na+，Ca2+及Cd2+的浓度在生物神经信号的传导中，H+质子依赖型的运载蛋白 利用质子势能使神经递质在囊泡内不断积累，从而形成有效的神经信号传导。VATPase的 结构由跨膜的％和细胞质内的％两个亚单位组成，前者为H+提供通道，后者能分解ATP，为 逆浓度梯度转运H+提供能量。％和Vi只有在聚合时，VATPase全酶才有功能。Vi位于细胞 质内，包括8种亚基（A-H)，参与ATP水解的主要是A亚基和B亚基。可见，昆虫的V-ATPase 在昆虫的生长、发育、生殖等重要生命活动过程中起着非常重要的作用。
[0007] 研究表明，在人工饲料中添加V型ATP酶A亚基（V-ATPaseA)dsRNA后，玉米根萤 叶甲（Diabroticavirgiferavirgifera)V_ATPaseA的表达明显受抑制，幼虫生长停滞甚 至死亡。其中饲喂12天后死亡率达50%寸所需的V-ATPaseAdsRNA浓度为1.82ng/cm2。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是：提供一种棉铃虫（Helicoverpaarmigera)V型 ATP酶A亚基（V-ATPaseA)的cDNA及其应用，设计与合成棉铃虫V-ATPaseA基因siRNA， 棉铃虫取食siRNA后，V-ATPaseA基因表达受阻，棉铃虫生长与代谢受抑制，死亡率提高， 从而用于棉铃虫的生物防治。
[0009] 本发明提供的技术方案是：一种棉铃虫V-ATPaseA基因的cDNA，其核苷酸序列如 SEQIDNO. 1所示。该序列是发明人首次从棉铃虫中克隆的V-ATPaseA基因，该基因能够 作为RNAi的靶标，在棉铃虫的防治中具有很大的应用价值。
[0010] 本发明还提供所述CDNA编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示。
[0011] 一种所述cDNA的克隆方法，包括以下步骤：
[0012] (1)从棉铃虫幼虫提取总RNA，然后反转录合成cDNA;
[0013] (2)设计简并引物，所述简并引物正向序列如SEQIDNO. 3所示，反向序列如SEQ IDNO. 4 所示；
[0014] (3)以步骤⑴得到的cDNA为模板，用步骤⑵所述的引物进行PCR扩增；
[0015] (4)纯化步骤（3)得到的PCR产物，回收目的片段，取纯化产物连接到pMD18-T载 体上得到pMD18-T-ATPase，然后转化大肠杆菌感受态细胞ToplO,筛选含pMD18-T-ATPase 的阳性克隆；
[0016] (5)将步骤⑷所得的阳性克隆进行序列测定，得到权利要求1所述的cDNA。
[0017] 所述棉铃虫V-ATPaseAcDNA的应用：所述的cDNA用于防治棉铃虫。从所述的 cDNA序列中选取四段19bp序列（见SEQIDN01中第299-317位，899-917位，1034-1052 位，1325-1343位核苷酸）作为干涉靶标，合成双链siRNA，正向序列如SEQIDNO. 5，SEQID NO. 7,SEQIDNO. 9,SEQIDNO. 11 所示，反向序列如SEQIDNO. 6,SEQIDNO. 8,SEQID NO. 10，SEQIDNO. 12所示。同时设计绿色荧光蛋白基因（EGFP)双链siRNA作为对照，正 向序列如SEQIDNO. 13所示，反向序列如SEQIDNO. 14所示。将所述siRNA配制成溶液 施用于烟草表面，棉铃虫取食含有V-ATPaseAsiRNA的烟草后，V-ATPaseA表达受抑制， 正常的代谢与生理过程受破坏，棉铃虫死亡率提高，从而用于棉铃虫的生物防治。
[0018] 上述的应用，所述植物为棉花、烟草、小麦、玉米、高梁、大豆、豌豆、苜蓿、芝麻、番 茄、辣椒、向日葵等棉铃虫寄主植物。
[0019] 本发明具有以下有益效果：
[0020] 本发明首次克隆棉铃虫V-ATPaseA基因cDNA。V-ATPaseA是一种真核生物膜结 构上的质子泵，在真核生物细胞内行使基础的、必不可少的功能，在昆虫的生长、发育、生殖 等生命活动过程中发挥非常重要的作用。V-ATPaseA的沉默会破坏细胞基本的代谢与生理 过程，造成昆虫生长、发育、生殖等一系列生命活动的紊乱与异常。
[0021]目前，RNAi技术已经在害虫生物防治领域展现出广阔的应用前景，以害虫靶基因 dsRNA或siRNA作为有效成分研制生物农药是一个新的发展方向。据报道，dsRNA常被用 于对害虫靶标基因进行敲除，而不是siRNA。本发明人首次以棉铃虫V-ATPaseA为干涉靶 标，设计与合成V-ATPaseAsiRNA，对棉铃虫进行饲喂，以沉默V-ATPaseA的转录表达，抑 制棉铃虫的种群数量，研究基础好，前瞻性高，害虫产生抗性的风险低，是一种防治棉铃虫 的好方法。此外，siRNA与dsRNA相比具有合成成本低，稳定性好的特点，更适合于生物农 药的研制，因此本发明具有重大的应用前景。
[0022] 由于棉铃虫食性杂，寄主广泛，除为害棉花外，还能为害小麦、玉米、高梁、大豆、豌 豆、苜蓿、芝麻、番茄、辣椒、向日葵、烟草等作物，寄主植物多达20多科200余种。因此，本 发明所设计的V-ATPaseAsiRNA可施用于其它寄主植物，同样可用于棉铃虫的生物防治。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图 1 为棉铃虫V-ATPaseA基因的克隆。M:250bpladdermarker;1 :V_ATPaseA cDNA(1667bp)。
[0024] 图2为V-ATPaseAsiRNA饲养第8天时棉铃虫的生长情况。将V-ATPaseAsiRNA 配制成水溶液，以EGFP(绿色荧光蛋白）siRNA为对照，将烟草叶片从植株上剪下置于培养 皿，将siRNA溶液涂布在叶片表面，每个培养皿饲养1头棉铃虫幼虫，及时更换叶片。
[0025] 图3为棉铃虫取食V-ATPaseAsiRNA后死亡率提高。将siRNA溶液涂布在烟草 叶片表面，饲喂棉铃虫，在饲喂的第2天至第10天统计棉铃虫的死亡率。
【具体实施方式】
[0026] 下面通过【具体实施方式】的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限 制，仅仅作示例说明。
[0027] 本发明从棉铃虫克隆到V型ATP酶A亚基（V-ATPaseA)的cDNA，它具有SEQID NO. 1所示的序列：
[0028] (l)SEQIDNO. 1 的信息
[0029] (a)序列特征：
[0030] 序列长度：1667碱基对
[0031] 类型：核酸
[0032] 链型：双链
[0033] 拓扑结构：线性
[0034] (b)分子类型：cDNA
[0035] (c)假设：否
[0036] (d)反义：否
[0037] (e)最初来源：棉铃虫（Helicoverpaarmigera)
[0038] (f)序列描述：SEQIDNO. 1
[0039] (2)SEQIDNO. 2 的信息
[0040] (a)序列特征
[0041]序列长度：555氨基酸
[0042] 类型：氨基酸
[0043] 链型：单链
[0044] 拓扑结构：线性
[0045](b)分子类型：蛋白质
[0046] (c)序列描述：SEQIDN0. 2
[0047] 本发明棉铃虫V-ATPaseA基因cDNA序列SEQIDNO. 1的克隆方法，包括以下步 骤：
[0048] (1)从棉铃虫幼虫提取总RNA，然后反转录合成cDNA;
[0049] (2)根据鳞翅目，鞘翅目，膜翅目，双翅目昆虫V-ATPaseA基因的保守序列设计简 并引物：
【权利要求】
1. 一种棉铃虫V-ATPase A基因的cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 /_J、i 〇
2. -种棉铃虫V-ATPase A基因表达的蛋白，其特征在于，其由权利要求1所述的cDNA 所编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. -种如权利要求1所述cDNA的克隆方法，包括以下步骤： (1) 从棉铃虫幼虫提取总RNA，然后反转录合成cDNA ; (2) 设计简并引物，所述简并引物正向序列如SEQ ID N0.3所示，反向序列如SEG ID NO. 4所示； (3) 以步骤⑴得到的cDNA为模板，用步骤⑵所述的引物进行PCR扩增，得到扩增片 段； (4) 纯化步骤⑶得到的PCR产物，回收目的片段，取纯化产物连接到pMD18-T载体上， 然后转化大肠杆菌感受态细胞，筛选含目的片段的阳性克隆； (5) 将步骤（4)所得的阳性克隆进行序列测定，得到权利要求1所述的cDNA。
4. 一种如权利要求1所述cDNA的应用，其特征在于：从权利要求1所述的cDNA序列中 选取 SEQ ID NO. 1 中第 299-317 位，899-917 位，1034-1052 位，1325-1343 位共四段 19bp 序 列作为干涉靶标合成siRNA，siRNA正向序列如SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 9， SEQ ID NO. 11 所示，反向序列如 SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 12 所示。将合成的siRNA混合配制成溶液涂布在烟草叶片表面对棉铃虫进行饲喂，棉铃虫取 食烟叶后，V-ATPase A基因表达受阻，棉铃虫代谢与生长受抑制，死亡率提高。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物为烟草、棉花、小麦、玉米、高梁、 大豆、豌豆、苜蓿、芝麻、番茄、辣椒、向日葵等棉铃虫寄主植物。
【文档编号】C12N9/14GK104342448SQ201310343150
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月8日 优先权日:2013年8月8日
【发明者】毛建军, 曾凡荣 申请人:中国农业科学院植物保护研究所