专利名称：高产杆状病毒的棉铃虫幼虫脂肪体细胞系及其构建和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种昆虫细胞系，尤其是一种来源于昆虫脂肪体组织，并且对杆状病毒高敏感的细胞系，本发明还涉及该细胞系的建立方法，以及该细胞系在杆状病毒规模化生长上的用途。
背景技术：
据报道，在1965年第一株昆虫细胞系成功建立后至今，近40年的时间内，已经建立的昆虫细胞系超过500种。它们分别来源于鳞翅目、双翅目、同翅目、膜翅目、直翅目和鞘翅目等170多种昆虫，其中大部分来源于鳞翅目和双翅目昆虫。昆虫细胞系作为研究材料，一直是生理学、发育生物学、细胞生物学、分子生物学和生物化学等科学研究的重要工具，而且昆虫细胞作为杆状病毒表达载体系统的重要组成部分，表达了大量的具有重大经济意义或科学意义的外源蛋白质；同时作为生物反应器，扩增昆虫杆状病毒用作生物杀虫剂，特别是扩增含有外源基因的重组杆状病毒杀虫剂，昆虫细胞也发挥了重要的作用。
大量的来源于鳞翅目昆虫商品化的细胞系已得到人们广泛的应用，比如，来源于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf-21和其克隆株Sf-9，来源于粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的Tn-368和其克隆株Tn-5B1-4(商品名为High Five)等，已经成功的应用于表达和生产重组蛋白。
鳞翅目的细胞系来源于很多组织，包括卵巢、胚胎、血细胞、脂肪体等。然而，值得一提的是，由于昆虫细胞不完全的去分化，有的已经建立的昆虫细胞系仍然保持一定原始组织和器官的特征。来源于不同种类昆虫的细胞系或来源于同一种昆虫不同组织部位的细胞系扩增病毒或重组蛋白的表达能力各有不同。因此建立和筛选新的、更多的杆状病毒敏感细胞系(株)是一项非常有必要而且有理论和实践意义的工作。
到目前为止，来自棉铃虫(Helicoverpa armigera(Hbn.))的细胞系共有约10株(McIntosh，1983；Yang and Xie，1983；Su D.M.，1987；Kolokol`tsova，1995；McIntosh，1999；SudeepA.B.，2002A；Sudeep，2002B)McIntosh，A.H.等(McIntosh，A.H.，et al.InVitro 1983，19589～590)使用雌蛹的卵巢为材料，首先建立了棉铃虫细胞系BCIRL-HA-AM1。通过接种试验发现，此细胞系不能复制美洲棉铃虫单粒包埋核多角体病毒(HzSNPV)、棉铃虫多粒包埋核多角体病毒(HaMNPV)和苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核多角体病毒(AcMNPV)，既没有多角体出现，病毒的浓度也没有增加。Lenz等(L-7，Lenz，C.J.，et al.，J.Invertebr.Pathol.57227～233；1991)于1991年克隆了此细胞系，得到了细胞株CSIRO-BCIRL-HA1，此细胞株对HaMNPV非常敏感。杨淑艳等(杨淑艳，谢荣栋.In中国科学院上海昆虫研究所，ed.昆虫学研究集刊(第三集)上海上海科学技术出版社.1983129-136)也建立了两株来自雌蛹卵巢的细胞系(SIE-Ha-798和SIE-Ha-806)。Su D.M.等(Su D.M.，et al.In“Biotechonology inInvertebrate Pathology and Cell Culture”(K.Maramorosh，ed.)New YorkAcademicPress，1987，375-383)发表了另一株来自雌蛹卵巢的细胞系(SFE-HA-831)。1995年，俄国学者Kolokol`tsova T.D.等(Kolokol`tsova T.D.，et al.，Vopr Virusol 1995，40135～138)也使用棉铃虫雌蛹的卵巢建立了一株细胞系。McIntosh，A.H.等(McIntosh，A.H.，et al.，In vitro Cell.Dev.Biol.1999，35(2)94～97)后来从棉铃虫雌成虫的卵巢组织中建立了三株细胞系CSIRO-BCIRL-HA1，CSIRO-BCIRL-HA2，CSIRO-BCIRL-HA3。三株细胞系虽然对HzNPV敏感，但复制产生病毒的量并不如细胞株BCIRL-HA-AM1-A11多。细胞系NIV-HA-1195(Sudeep A.B.，et al.，Indian J.Exptl.Biol.2002，4069-73)是通过棉铃虫幼虫血细胞建立的，该细胞系对AcNPV，斜纹夜蛾核多角体病毒(SpltNPV)和HaNPV敏感。Sudeep A.B.等(Sudeep A.B.et al.，In Vitro Cell Dev.Biol.-Animal 2002，38262～264)建立了细胞系NIV-HA-197，它来自棉铃虫的胚胎，对AcNPV，SpltNPV和HaSNPV敏感，90％的细胞能够感染HaSNPV。
尽管前述文献已有棉铃虫细胞系的有关报道，然而到目前为止，还没有来源于棉铃虫脂肪体的细胞系。昆虫的脂肪体同哺乳动物的肝脏具有相似的功能，是重要的生理代谢组织，也是是杆状病毒主要的侵染、复制部位之一。更多种类的昆虫细胞系仍存在很大的需求，建立新的来源于昆虫脂肪体的细胞系，构建更加高效的杆状病毒表达载体系统是十分有意义的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的棉铃虫脂肪体组织来源的、并具有高度病毒敏感性的、高产杆状病毒的棉铃虫幼虫脂肪体细胞系。
本发明的另一目的在于提供一种所述高产杆状病毒的棉铃虫幼虫脂肪体细胞系的构建方法。
本发明的又一目的在于提供所述的高产杆状病毒的棉铃虫幼虫脂肪体细胞系的用途。
本发明提供的高产杆状病毒的棉铃虫幼虫脂肪体细胞系的名称为IOZCAS-Ha-I，已于2006年4月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1690。
本发明提供一种所述高产杆状病毒的棉铃虫幼虫脂肪体细胞系的构建方法，其为利用棉铃虫幼虫脂肪体细胞为实验材料，采用一种能够快速建立昆虫细胞系的方法，建成了一株对棉铃虫核型多角体病毒高敏感的棉铃虫脂肪体细胞系，命名为IOZCAS-Ha-I。保藏号为CGMCC No.1690。
本发明建立该细胞系的具体方法如下(1)将棉铃虫末龄幼虫浸没在乙醇溶液中10～20分钟，进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水清洗昆虫，再吸干虫体表面；(2)解剖昆虫，取出完整棉铃虫脂肪体组织；(3)用生理盐水清洗(2)中获得的组织2～3次，再用细胞培养液清洗，清洗后把该组织放入含有1mL细胞培养液润洗过的细胞培养瓶中，盖紧瓶盖，放入27℃无光照的细胞培养箱中培养24小时；(4)加入适量的细胞培养液，使组织块完全或大部分浸没在该培养液中，在与步骤(3)同样条件下培养；(5)每7～10天吸出半量的培养液，并同时换入半量新的细胞培养液，直至观察到不断扩展并开始增殖的细胞充满了整个培养瓶；(6)把含有新增殖出的单个细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培养瓶中，并加入新的细胞培养液，而原含有组织块的培养瓶中再加入同吸出量同样多新的细胞培养液，两个培养瓶放入培养箱中培养，细胞开始传代，细胞系建立成功，得到本发明的高产杆状病毒的棉铃虫幼虫脂肪体细胞系；整个过程都是在无菌条件下进行的。
本发明上述方法中所使用细胞培养液是常规采用的昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素和胎牛血清的混合物，配成的细胞培养液pH在6.0-6.5之间。昆虫细胞培养液可以是各种商品化的昆虫细胞培养液，如TNM-FH，Grace’s，Sf900，TC-100，IPL-41，Ex-Cell 400等等。
通常，细胞培养液中青霉素含量为100U/mL；链霉素含量为优选100U/mL；动物血清含量为细胞培养液的5～10％(体积比)。
本发明中两株棉铃虫脂肪体细胞系的生物学特征观察和测定1.经实验观察，该细胞系大部分悬浮于培养液中，也有部分贴壁细胞。细胞的形状有3种类型大部分细胞圆形、少部分梭形，较少似巨噬细胞形(图1)。
2.按照McIntosh and Ignoffo，1989(McIntosh，A.H.and C.M.Ignoffo J.Invertebr.Pathol.1989，5497～102)的方法，测定第10代细胞生长曲线和群体倍增时间。以2×105细胞/mL的浓度接种到T-12.5cm2培养瓶中，27℃培养，每24h测定细胞浓度，绘制生长曲线，并按公式T＝tlg2/[lg(N/N0)]计算，第10代的细胞群体倍增时间为65.2小时。
其中 T＝在对数期平均增长一倍所需的时间t＝接种到测定细胞数的时间N0＝接种时的细胞数N＝时刻t所测定的细胞总数3.按照Takahashi et al.(Takahashi，Mitsuhashi and Ohtaki(1980)Develop.Growth and Differ.2211-19)的方法，测定了第7代细胞的核型。IOZCAS-Ha-I的染色体数目在58～239之间，大约有52％的细胞染色体数目在80～119之间，38％的细胞染色体数目在160～199之间(图2)。
4.使用DAF-PCR的方法(McIntosh，Grasela and Matteri(1996)，Insect Mol.Biol.5187～195)鉴定了细胞系IOZCAS-Ha-I确是来源于棉铃虫，而非其它细胞系的污染(图3)。由IOZCAS-Ha-I提取的DNA与棉铃虫幼虫DNA扩增后主要的带型相同，而与对照来源于果蝇的SL2、本实验室自建甜菜夜蛾的IOZCAS-Spex II，IOZCAS-Spex III细胞带型明显不同。
5.IOZCAS-Ha-I对棉铃虫核型多角体病毒敏感，可以观察到典型的细胞病理特征，即细胞核增大，内含大量的多角体颗粒(图4)。并且至少可以连续传代3代。使用细胞系生产的病毒多角体进行生物测定，得到LC50＝5.88×105PIB/mL，类似于用虫体生产的病毒多角体测定的结果。
6.使用传统细胞冻存的方法对一定代次的部分细胞进行冻存处理，保存细胞的种资，并成功复苏。
本发明提供的高产杆状病毒的棉铃虫幼虫脂肪体细胞系可以用来复制杆状病毒，用于杆状病毒或杆状病毒杀虫剂的规模化生产；该细胞系还可应用于使用杆状病毒表达载体表达重组蛋白，这种重组蛋白具有极高的商业和科研价值。
图1为IOZCAS-Ha-I的培养形态；图2为IOZCAS-Ha-I的核型；图3为DAF-PCR鉴定IOZCAS-Ha-I的DNA指纹扩增图谱，同于棉铃虫H.armigera的DNA指纹扩增图谱，而不同于果蝇的细胞系SL2和IOZCAS-Spex II、IOZCAS-Spex III的图谱；图4为IOZCAS-Ha-I感染棉铃虫核型多角体病毒后获得大量的病毒多角体。
具体实施例方式
实施例1.棉铃虫幼虫脂肪体细胞系的建立取末龄的棉铃虫幼虫浸没在70％的乙醇溶液中10分钟，进行表面消毒。解剖该昆虫取出脂肪体组织，操作时尽量保持其完整。用生理盐水清洗该组织2-3次，再用细胞培养液(以TNM-FH为主，含100U/mL的青霉素，100U/mL的链霉素和10％(v/v)的胎牛血清，pH＝6.2)清洗1-2次，放入使用1mL培养液润洗过的25cm2的细胞培养瓶中，放入摄氏27℃无光照的细胞培养箱中培养24小时。然后加入3mL上述细胞培养液，放入同样条件下培养。注意该方法成功建立细胞系的关键是要使组织块紧贴在细胞培养瓶底，勿使组织块悬浮在细胞培养液中。以后每7-10天左右吸出半量的培养液，并同时换入半量的新培养液。在此操作第7-10天后可以观察到组织块周围游离出大量单个的细胞，并逐渐向外围扩展。第28天后见到细胞不断增殖并充满整个培养瓶，把含有新增殖出的细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培养瓶中，并加入2mL新的细胞培养液。细胞系建立初步成功。在细胞开始传代的第7天后开始第二次分瓶传代，以后传代时间逐渐缩短，传到第8代时，细胞生长开始稳定，最终该细胞系被命名为IOZCAS-Ha-I。IOZCAS-Ha-I于2006年4月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1690。
实施例2.IOZCAS-Ha-I的生物学特性观察和测定(1)形态特征经显微镜观察，该细胞系通常悬浮于培养液中，细胞的形状有3种类型圆形、梭形和似巨噬细胞形(图1)。IOZCAS-Ha-I中圆形细胞占85.6％，平均直径14.57μm；梭形细胞占9.5％，长约16.6-42.0μm(平均23.95μm)，宽约8.0-15.2μm(平均11.53μm)；约4.9％的细胞为似巨噬细胞，直径范围在21.7-28.2μm之间。
(2)细胞的生长27℃下，2个细胞系第10代在含10％胎牛血清、100U/mL的青霉素、100U/mL的链霉素的TNM-FH培养液中，第9代细胞群体倍增时间为65.2 hr。细胞最高密度约可达8×105个细胞/mL。
(3)核型分析IOZCAS-Ha-I第7代细胞染色体数目在58-239之间，大约有52％的细胞染色体数目在80-119之间，38％的细胞染色体数目在160-199之间，见图2。
(4)DAF-PCR鉴定细胞系IOZCAS-Ha-I确是来源于棉铃虫，而非其它细胞系的污染(图3)。由IOZCAS-Ha-I提取的DNA与棉铃虫幼虫DNA扩增后主要的带型相同，而与对照来源于果蝇的SL2(Schneider′s Drosophila Line 2，ATCC保藏号CRL-1963)、本实验室自建甜菜夜蛾的IOZCAS-Spex II，IOZCAS-Spex III(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.1690)细胞的带型明显不同。
(5)冻存和复苏使用传统细胞冻存的方法对一定代次的部分细胞进行冻存处理，保存细胞的种资，并可以成功复苏。
实施例3.病毒敏感性和产量的测定IOZCAS-Ha-I对棉铃虫核型多角体病毒敏感将HaNPV出芽型病毒粒子BV以0.001幼虫当量/毫升的浓度接种IOZCAS-Ha-I，培养10天后，收获细胞及病毒多角体，用血球计数板在显微镜下计数病毒多角体数目，结果IOZCAS-Ha-I扩增HaNPV可达到每毫升培养液生产7.3×107PIB的产量。同时可以观察到典型的细胞病理特征，即细胞核增大，内含大量的多角体颗粒(图4)。并且至少可以连续传代3代。
使用细胞系用上述方法生产的病毒多角体，对2龄末期的棉铃虫幼虫进行生物测定。其方法如下IOZCAS-Ha-I接种HaNPV病毒10天后，收集细胞及其培养液，加入十分之一体积的10％十二烷基硫酸钠(SDS)，剧烈震荡，5000g离心5分钟，沉淀用少量1％SDS悬浮，血球计数板计数HaNPV多角体的含量。用蒸馏水将获得的HaNPV悬液配制成1×107pIB/mL、5×106PIB/mL、1×106PIB/mL、5×105PIB/mL、1×105PIB/mL、1×104pIB/mL的六个浓度的浓度梯度，用蒸馏水作空白对照。将棉铃虫的饲料分别浸没在不同浓度的病毒悬液中1分钟，取出饲料，用吸水纸吸干饲料表面的液体，放入24格养虫盒中，每格接入1头2龄末期的棉铃虫幼虫，放入26℃、14小时光照10小时黑暗的光照培养箱中培养。24小时后换入新鲜的不含病毒的饲料继续培养，每个浓度实验72头棉铃虫。实验五天后调查棉铃虫的死亡率，计算LC50。结果第五天的LC50为5.88×105PIB/mL，而用由棉铃虫幼虫扩增的多角体进行生物测定，其LC50为6.60×105PIB/mL。用IOZCAS-Ha-I细胞扩增的HaNPV同用虫体扩增的HaNPV，其LC50在统计学意义上没有显著差异，说明用IOZCAS-Ha-I生产的棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)的毒力没有改变，可以用于HaNPV的生产。
权利要求
1.一种高产杆状病毒的棉铃虫幼虫脂肪体细胞系，其名称为IOZCAS-Ha-I，于2006年4月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1690。
2.一种权利要求1所述的高产杆状病毒的棉铃虫幼虫脂肪体细胞系的构建方法，步骤如下(1)将棉铃虫末龄幼虫浸没在乙醇溶液中10～20分钟，进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水清洗昆虫，再吸干虫体表面；(2)解剖昆虫，取出完整棉铃虫脂肪体组织；(3)用生理盐水清洗(2)中获得的组织2～3次，再用细胞培养液清洗，清洗后把该组织放入含有1mL细胞培养液润洗过的细胞培养瓶中，盖紧瓶盖，放入27℃无光照的细胞培养箱中培养24小时；(4)加入适量的细胞培养液，使组织块完全或大部分浸没在该培养液中，在与步骤(3)同样条件下培养；(5)每7～10天吸出半量的培养液，并同时换入半量新的细胞培养液，直至观察到不断扩展并开始增殖的细胞充满了整个培养瓶；(6)把含有新增殖出的单个细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培养瓶中，并加入新的细胞培养液，而原含有组织块的培养瓶中再加入同吸出量同样多的新鲜细胞培养液，两个培养瓶放入培养箱中培养，细胞开始传代，细胞系建立成功；整个过程都是在无菌条件下进行的；其中所述的细胞培养液是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素和胎牛血清的混合物，配成的细胞培养液pH在6.0-6.8之间。
3.如权利要求2所述的高产杆状病毒的棉铃虫幼虫脂肪体细胞系的构建方法，其特征在于所述的昆虫细胞培养液选自商品化的昆虫细胞培养液TNM-FH，Grace’s，Sf900，TC-100，IPL-41，或Ex-Cell 400。
4.如权利要求2所述的高产杆状病毒的棉铃虫幼虫脂肪体细胞系的构建方法，其特征在于所述的细胞培养液中的青霉素含量为100U/mL；链霉素含量为100U/mL；动物血清含量为细胞培养液的10％(体积比)。
5.一种权利要求1所述的高产杆状病毒的棉铃虫幼虫脂肪体细胞系在杆状病毒的大规模生产上的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其中的杆状病毒是棉铃虫核型多角体病毒。
全文摘要
本发明公开了一种来源于昆虫脂肪体组织，并且对杆状病毒高敏感的细胞系，本发明还公开了该细胞系的建立方法，以及该细胞系在杆状病毒规模化生长上的用途。该细胞系可以用来复制这类病毒，用于杆状病毒杀虫剂的规模化生产，以及构建杆状病毒表达载体系统，表达具商业或科学价值的蛋白质。因而具有极高的商业和科研价值。
文档编号C12N15/866GK101070533SQ20061007834
公开日2007年11月14日 申请日期2006年5月11日 优先权日2006年5月11日
发明者张寰, 秦启联, 李瑄, 苗麟, 殷珍仙, 张爱君, 丁翠 申请人:中国科学院动物研究所