一种植物耐盐相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：一种植物耐盐相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物耐盐相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
土壤盐碱化是一个世界性的问题，全世界盐碱地面积近10亿公顷。根据我国第二次土壤普查资料盐碱地资源面积约5.27亿亩，其中盐碱耕地0.88亿亩，主要分布在华北、西北和东北这些干旱和半干旱地区。盐碱对植物生长和发育有重要影响，是限制作物产量的重要因素。因此培育耐盐碱的作物是育种的一个重要目标。提高植物耐盐性的一个重要手段是将耐盐相关基因通过转基因方法导入植物，因此植物耐盐相关基因的克隆具有重大应用前景。
SOS(Salt Overly Sensitive)途径在拟南芥盐胁迫应答中起重要作用。在盐胁迫下，SOS3，一种钙结合蛋白，能够激活蛋白激酶SOS2，进而激活细胞膜上的Na+/H+反向转运蛋白SOS1活性，将Na+泵到胞外，从而减轻细胞质中Na+的毒害。在拟南芥基因组中SOS3家族(SOS3 likeCalciumBindingProteins)具有10个成员，目前仍不清楚其家族中大部分成员的功能。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种拟南芥抗盐相关蛋白及其编码基因与应用。
本发明所提供的植物耐盐相关蛋白，名称为SCaBP8(SOS3 likeCalciumBindingProtein8)，来源于拟南芥，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐性相关的蛋白质。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
序列表中的SEQ ID №1由246个氨基酸残基组成。
上述植物耐盐相关蛋白SCaBP8的编码基因(SCaBP8)也属于本发明的保护范围。
植物耐盐相关蛋白SCaBP8的编码基因包括基因组基因和cDNA。
植物耐盐相关蛋白SCaBP8的基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一
1)序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的DNA；3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №3由3783个核苷酸组成，自5’端第1到第1671位为启动子，自5’端第1672到第1754位为第一外显子，自5’端第1846到第2014位为第二外显子，自5’端第2163到第2245位为第三外显子，自5’端第2436到第2495位为第四外显子，自5’端第2573到第2681位为第五外显子，自5’端第2754到第2806位为第六外显子，自5’端第2876到第2956位为第七外显子，自5’端第3057到第3169位为第八外显子，自5’端第3260到第3545位为第八外显子；自5’端第1755到第1845位为第一内含子，自5’端第2015到第2162位为第二内含子，自5’端第2246到第2435位为第三内含子，自5’端第2496到第2572位为第四内含子，自5’端第2682到第2753位为第五内含子，自5’端第2807到第2875位为第六内含子，自5’端第2957到第3056位为第七内含子，自5’端第3170到第3259位为第八内含子。该序列编码具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质。
植物耐盐相关蛋白SCaBP8的cDNA，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的DNA；3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％ SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由741个核苷酸组成，其编码框为自5’端第1到第741位脱氧核苷酸。
含有拟南芥耐盐相关基因SCaBP8的表达载体、转基因细胞系和宿主菌也属于本发明的保护范围。
实验表明，将本发明的植物耐盐相关蛋白SCaBP8的基因组基因及其cDNA基因转入对盐敏感的拟南芥突变植株中，表达该基因的突变株对盐具有耐性。本发明的植物耐盐相关蛋白SCaBP8的基因组基因及其cDNA基因为培育其他有经济价值的耐盐植物提供了基础。


图1为SCaBP8 T-DNA插入突变体及其互补植株的耐盐性检测。
图2为对scabp8-T突变株PCR检测的结果图3为转pCAMBIA-SCaBP8C水稻植株耐盐情况测试照片具体实施方式
实施例中的方法如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、拟南芥SCaBP8及其基因的获得1、SCaBP8 cDNA的克隆设计引物F15’-CGGGATCCTGGAACAAGTTTCCTCTAG-3’BamHI和R15’-GC TCAGTCTTCAACCTCAGTG-3’ ，取拟南芥植株0.5g，液氮研磨，以TRIzol(Invitrogen)提取总RNA。取2μg总RNA用MLV反转录酶(Promega公司)进行反转录，得到的cDNA片段为模板进行PCR扩增反应。PCR反应体系为1μl一链cDNA、1μl引物(10μM)、5μl 10×PCR缓冲液、1μl dNTP(10mM)和5U Pfu DNA聚合酶，用超纯水补足50μl。反应在MJ100型PCR仪上进行，其程序为94℃变性5min；再94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 2min，共40个循环；然后72℃延伸10min。PCR产物经电泳回收后用BamHI和SalI双酶切后，克隆到pGEX-6P-1(GE Healthcare)的BamHI和SalI酶切位点之间，测序表明该片段具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列，自序列表中序列1的5′端的第1-741位核苷酸为编码序列，其编码序列表中SEQ ID NO.2的氨基酸残基序列。
2、SCaBP8基因组基因的获得以XbaI和PstI消化BAC质粒F26P21(购自ABRC，http//www.arabidopsis.org)，获得包含SCaBP8基因翻译起始点上游1736bp、终止密码下游469bp的SCaBP8基因组序列(见SEQ ID NO.3)，自序列表中序列3的5’端第1到第1671位为启动子，自5’端第1672到第1754位为第一外显子，自5’端第1846到第2014位为第二外显子，自5’端第2163到第2245位为第三外显子，自5’端第2436到第2495位为第四外显子，自5’端第2573到第2681位为第五外显子，自5’端第2754到第2806位为第六外显子，自5’端第2876到第2956位为第七外显子，自5’端第3057到第3169位为第八外显子，自5’端第3260到第3545位为第八外显子；自5’端第1755到第1845位为第一内含子，自5’端第2015到第2162位为第二内含子，自5’端第2246到第2435位为第三内含子，自5’端第2496到第2572位为第四内含子，自5’端第2682到第2753位为第五内含子，自5’端第2807到第2875位为第六内含子，自5’端第2957到第3056位为第七内含子，自5’端第3170到第3259位为第八内含子。
3、SCaBP8基因的功能验证(1)拟南芥SCaBP8 T-DNA插入突变体的获得SCaBP8 T-DNA插入突变体购自ABRC(Arabidopsis Biological ResourceCenter，http//www.arabidopsis.org，seed stock no.SALK_056042)，将该SCaBP8T-DNA插入突变体命名为scabp8-T突变株。从scabp8-T突变株纯合体基因组DNA为模板，以引物对LBa1 5’TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 3’和S8R 5’GCGTCGACTCAGTCTTCAACCTCAGTG 3’及引物对LBb1 5’GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT 3’和S8R 5’GCGTCGACTCAGTCTTCAACCTCAGTG 3’进行扩增反应，结果扩增得到700和500bp条带(图2中泳道5和泳道6)，以引物对S8F 5’CAGGAGAAGACCGATTGTAAGG 3’和S8R 5’GCGTCGACTCAGTCTTCAACCTCAGTG 3’对scabp8-T突变株纯合体基因组DNA进行扩增反应，结果没有扩增产物(图2中泳道4)。而以野生型拟南芥基因组DNA为模板，只有引物对S8F和S8R能够扩增出700bp条带(图2中泳道1)，引物对LBa1和S8R 5及引物对LBb1和S8R没有扩增产物(图2中泳道2和3)。由于用T-DNA特异引物LBa1和LBb1均能与SCaBP8特异的反向引物S8R在scabp8-T突变纯合体基因组DNA中扩增出特异的PCR产物，此PCR产物的测序结果证明T-DNA的Leftborder插入了SCaBP8基因。同时SCaBP8特异的引物S8F和S8R不能得到扩增产物说明了有大片断的DNA插入SCaBP8基因中。而用同样的引物在相同的反应条件下，用野生型DNA扩增出相反的结果也证明了这一点。
将萌发后4天的拟南芥scabp8-T突变株和野生型拟南芥幼苗分别转到MS和含50mM NaCl的MS培养基上，温度23℃、每天光照24小时，生长10天后，结果表明scabp8-T突变株和野生型在MS培养基上生长没有差异；而在含50mM NaCl的MS培养基上，与野生型拟南芥相比，scabp8-T突变株茎和叶生长缓慢，根的生长没有表现明显不同(图1中A)。
(2)将SCaBP8基因组基因转入scabp8-T突变株可以互补其低盐敏感表型步骤2中得到的SCaBP8基因组基因插入到双元载体pCAMBIA1200(http//www.cambia.org，GENBANK登录号AF234292)的XbaI和PstI酶切位点之间，得到表达载体pCAMBIA-SCaBP8，将pCAMBIA-SCaBP8通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101的介导转入scabp8-T突变株，筛选得到转pCAMBIA-SCaBP8的scabp8-T突变株(PST)，即T0代转基因植株。T0代转基因植株所结的种子和由该种子长成的植株为T1代。T1代转基因植株所结的种子和由该种子长成的植株为T2代。
将分别萌发后4天的拟南芥PST的T2代转基因植株和野生型拟南芥幼苗转到MS和含50mM NaCl的MS培养基上，温度23℃、光照24小时/天，生长10天后，结果表明无论在MS培养基还是在含50mM NaCl的MS培养基上，PST T2代转基因植株的表型均与野生型对照相同(图1中B)。
(3)用SCaBP8 cDNA(SEQ ID NO 1)互补scabp8 T-DNA插入突变体低盐敏感表型将SCaBP8 cDNA插入pCAMBIA1200载体EcoRI和HindIII的酶切位点之间，置于CaMV 35S启动子和35S poly(A)之间得到表达载体pCAMBIA-SCaBP8C。将pCAMBIA-SCaBP8C通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101的介导转入scabp8-T突变株，筛选得到转pCAMBIA-SCaBP8C的scabp8-T突变株(PCT)，即T0代转基因植株。T0代转基因植株所结的种子和由该种子长成的植株为T1代。T1代转基因植株所结的种子和由该种子长成的植株为T2代。
将分别萌发后4天的拟南芥PCT的T2代植株和野生型拟南芥幼苗转到MS和含50mM NaCl的MS培养基上，温度23℃、每天光照24小时，生长10天后，结果表明无论在MS培养基还是在含50mM NaCl的MS培养基上，PCT的T2代植株的表型均与野生型对照相同(图1中C)。
步骤(2)和(3)结果显示，拟南芥SCaBP8基因缺失突变后，植株对盐胁迫敏感性显著增加，而在SCaBP8突变体导入正常的SCaBP8基因组序列或表达SCaBP8cDNA均能使突变体恢复正常。这表明SCaBP8基因在拟南芥对盐胁迫的应答中起重要调节作用。
实施例2、转pCAMBIA-SCaBP8C水稻的获得及其功能验证一、转pCAMBIA-SCaBP8C水稻的获得NB愈伤组织培养基，其配方如表1所示表1.用于组织培养和转化的培养基水稻


分化培养基1L上述NB愈伤组织培养基中加入5ml NAA(0.2mg/ml)，0.5-1mlTDZ(1mg/ml)，15ml 6-BA(0.2mg/ml)，pH5.8。
壮苗培养基(1/2MS培养基)1L含有2.17g MS粉剂，10ml B5有机100×，2.5mlNAA(0.2mg/ml)，5ml MET(0.2mg/ml)，20g蔗糖，3g琼脂(phytagel)，pH5.8。
将实施例1中制备的pCAMBIA-SCaBP8C通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101的介导转入水稻，并筛选转pCAMBIA-SCaBP8C水稻具体步骤如下(1)水稻种子的灭菌和愈伤组织的培养和继代将去好壳的水稻种子先用70％乙醇表面消毒2min，再用0.1％升汞溶液灭菌15-20min，最后用无菌水冲洗6-7次，然后将其接种到NB愈伤组织培养基上进行愈伤组织的诱导，于26±1℃暗培养10天左右。将长好的愈伤组织去掉芽和种子后，转到继代培养基(NB愈伤组织培养基)上继续暗培养，为根癌农杆菌侵染作准备。
(2)根癌农杆菌的培养将实施例1中制备的pCAMBIA-SCaBP8C转化根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101，将提取质粒酶切验证含有pCAMBIA-SCaBP8C的根癌农杆菌GV3101，命名为GV-pCAMBIA-SCaBP8C，用于转化水稻。在愈伤组织转接的第三天就开始培养菌株GV-pCAMBIA-SCaBP8C，在含有34mg/L的氯霉素和50mg/L的利富平LB(Traptone 10g，NaCl 10g，Yeast extract 5g)培养基于28℃摇床培养过夜，第二天转接大瓶，大瓶培养基中含同样浓度的抗生素和100μmol乙酰丁香酮(AS)，培养到OD600＝0.5时收集菌体，以备转化之用。
(3)共培养取待转化的愈伤组织于灭菌三角瓶中，加入以上备好的根癌农杆菌菌液，浸泡20分钟后倒去菌液，把愈伤组织倒入无菌培养皿中，再用无菌滤纸吸干多余的菌液，转接到共培养基(NB培养基加10mg/L乙酰丁香酮)上(上附无菌滤纸一张)，28℃暗培养3天。
(4)预培养取共培养3天后的愈伤组织于无菌三角瓶中，用含400μg/ml Cef的无菌水洗2次，再浸泡30分钟。用无菌滤纸吸干后转接于筛选培养基中26℃暗培养5-7天。
(5)筛选培养将预培养的愈伤组织转接于筛选培养基(NB培养基+50mg/L潮酶素+500mg/L头孢酶素)上继续培养2-3周，继代2次(每周转接一次)。
(6)抗性愈伤组织再分化取胚性抗性愈伤组织转接于分化培养基上，26℃暗培养10天，见绿点分化，再光照培养至长出小芽，转接于1/2MS培养基，26℃光照培养2-3周可见长成小苗。
提取叶片DNA，用引物F1和R1对筛选得到的转基因植株进行PCR检测，表明，其中有17株检测为阳性，即T0代转基因植株。T0代转基因植株所结的种子和由该种子长成的植株为T1代。T1代转基因植株所结的种子和由该种子长成的植株为T2代。
二、转pCAMBIA-SCaBP8C水稻对NaCl的抗性检测将生长10天的转pCAMBIA-SCaBP8C T2代水稻植株以及野生型水稻(对照)植株分别在含有1.5％NaCl的1/2MS培养基上，培养1个月后，结果如图3所示，结果表明，对照全部死亡，而转基因植株只是表现为老叶死亡，但有新芽长出，且根系发育正常，说明转SCaBP8基因在水稻中可以正常表达，它的转入使水稻具有一定的耐受盐胁迫功能，可作为目的基因以提高水稻等植物对盐胁迫的耐受性。
序列表<160>3<210>1<211>741<212>DNA<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1atggaacaag tttcctctag atcaagctct ctcactgtcg gagagcaatt ctgcgccgtc 60tttatacctt tctttgccat tatcgatgtc ctagtttcct ccgtcggaca atgcttcgat120tgccgcagca catcgcctcg gacatgtcag cacgcggatc tggaacgtct tgctcgtgaa180tctcaatttt cagtcaatga agttgaagct ttgtatgagc tattcaagaa attgagctgt240tcaattattg atgacggctt gattcacaag gaagagctta gactggcgct gttccaagct300ccatatggtg agaacctctt tcttgatagg gtttttgatt tgttcgatga aaagaagaat360ggggttattg agtttgagga attcatccat gcactcagtg tctttcatcc ctatgcatca420atccaggaga agaccgattt tgcatttagg ctctatgatc taagacaaac tggattcatt480gagcgagaag aggtgcaaca aatggtttct gctattctct tggaatctga tatgatgcta540tccgatgaac ttctgaccat gattattgat aaaacatttg ctgatgcaga ttctgacaaa600gacggtaaaa ttagtaagga tgaatggaat gtctatgtgc ataaacatcc tagcttgttg660aagaatatga ctcttcctta cctaaaggat gtgacgacag cattcccaag ttttatattc720aacactgagg ttgaagactg a 741<210>2<211>246<212>PRT<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>2Met Glu Gln Val Ser Ser Arg Ser Ser Ser Leu Thr Val Gly Glu Gln1 5 10 15Phe Cys Ala Val Phe Ile Pro Phe Phe Ala Ile Ile Asp Val Leu Val
20 25 30Ser Ser Val Gly Gln Cys Phe Asp Cys Arg Ser Thr Ser Pro Arg Thr35 40 45Cys Gln His Ala Asp Leu Glu Arg Leu Ala Arg Glu Ser Gln Phe Ser50 55 60Val Asn Glu Val Glu Ala Leu Tyr Glu Leu Phe Lys Lys Leu Ser Cys65 70 75 80Ser Ile Ile Asp Asp Gly Leu Ile His Lys Glu Glu Leu Arg Leu Ala85 90 95Leu Phe Gln Ala Pro Tyr Gly Glu Asn Leu Phe Leu Asp Arg Val Phe100 105 110Asp Leu Phe Asp Glu Lys Lys Asn Gly Val Ile Glu Phe Glu Glu Phe115 120 125Ile His Ala Leu Ser Val Phe His Pro Tyr Ala Ser Ile Gln Glu Lys130 135 140Thr Asp Phe Ala Phe Arg Leu Tyr Asp Leu Arg Gln Thr Gly Phe Ile145 150 155 160Glu Arg Glu Glu Val Gln Gln Met Val Ser Ala Ile Leu Leu Glu Ser165 170 175Asp Met Met Leu Ser Asp Glu Leu Leu Thr Met Ile Ile Asp Lys Thr180 185 190Phe Ala Asp Ala Asp Ser Asp Lys Asp Gly Lys Ile Ser Lys Asp Glu195 200 205Trp Asn Val Tyr Val His Lys His Pro Ser Leu Leu Lys Asn Met Thr210 215 220Leu Pro Tyr Leu Lys Asp Val Thr Thr Ala Phe Pro Ser Phe Ile Phe225 230 235 240Asn Thr Glu Val Glu Asp245<210>3
<211>3783<212>DNA<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>3ctagaagaaa aatacttttt atttattttt atttattttt gataaaaaat taaaaataaa 60ttaattaatt ttaccaaaat aataaaataa caaaatatac cgcaaaataa tataacaaaa 120tagacaacaa attcttttta taaatacaat ggtgttatat atataaatgt atttggtata 180tactctaaat ttaataattc aaaagccatt ttctttttaa aaacaccata atcatatata 240aatatatata tatatatata catatataac tcatcttgaa tatataaaaa gaaaactgaa 300tctataaaga aaaataaatt tataaatacc ataagatata ctttgattgt ggtgtttatg 360gatatctata aaaataaatt tggcatatat tttgaatttt attacatata tagagttcaa 420aggtcatata ttatgatttc aagaaaaatg aatatttttg tttaaaaaaa gacatagctt 480taaatttata aaaaaatata aatgattgcc aaaaggaaaa tgtatatgtt tgtatattat 540caaaatttta taacaaaatg tagctcaaaa tataatttgg ggtatatttt gtcatattaa 600gttttgctaa aattaagtaa taatttaata tttttaattg tttatcacaa atacaaatta 660ataaaaatac ttttacttct taataagaca atttatttac attttgtgtg ggtcaaaatt 720aggctaaaat agagtcaaaa tcagattagt ttcggttaaa ttaggggtaa atcaaatcgg 780atgtataatt atcggttaac tggtcggttc aattggaggc gtagttttaa gaataaatcc 840gaaagtacat gtagttttat cgagattaaa attgtttatg gaggtttttc aagtggctaa 900aagtttaggg tggaaagttg agattccaac tagtatatgg ctgaaaattc aggcaaccca 960attaaaaaga aagattatga gttttgttga gaagaaaaca cgtgcaataa agagcttttt1020ggtttcttct tttgtgttca ctctggaaaa gatgtttcag aaacagagga attgcagagt1080gtagcacacc cactcttatt agcatcgtgc aaaccgcaaa aaaaaaaaga tccttaatct1140tttgcgtcgt ctaatccact ttgtgtatgg aaatattgga atggctaaag ttgctaaaat1200taatcaatta gctcttcaac tatagagttt gataagacat gatcgtcatc gactaagttg1260atccatgaca actggccgac caaataatat tttagcattg aaaatttcta ctgtatatgt1320attttcaaaa ttacattcaa tgataggata gtgacaaata ttaatctgaa aatataacat1380tgtctattgt tttatttcta agttgaatgt aattttgaaa atacatatac gtagaaaata1440atattttagc caataaaaac taaaaagctc tatatttatt cttgttcttt tttttcttct1500tcaccaatat atatgtttac cagtttagcc attccataat atattatttt gtttaaaaaa1560
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1.一种植物耐盐相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐性相关的蛋白质。
2.权利要求1所述植物耐盐相关蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述植物耐盐相关蛋白的基因组基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的DNA；3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述植物耐盐相关蛋白的cDNA基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的DNA；3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
5.含有权利要求2、3或4所述的基因的表达载体。
6.含有权利要求2、3或4所述的基因的细胞系。
7.含有权利要求2、3或4所述的基因的宿主菌。
8.权利要求2、3或4所述的基因在培育抗盐植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种植物耐盐相关蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐性相关的蛋白质。本发明的植物耐盐相关蛋白及其编码基因为培育其他有经济价值的耐盐植物提供了基础。
文档编号C12N15/82GK1844143SQ20061007820
公开日2006年10月11日 申请日期2006年5月12日 优先权日2006年5月12日
发明者郭岩, 权瑞党, 林慧馨, 曹宛虹, 张玉国, 尚梅, 张军, 储成才, 曹守云 申请人:北京生命科学研究所