专利名称：棉铃虫对Cry1Ac 毒素非隐性抗性钙粘蛋白胞质区缺失突变的分子检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，涉及棉铃虫对CrylAc毒素非隐性抗性钙粘蛋白胞质区缺失突变的分子检测方法。
背景技术：
表达CrylAc毒素蛋白的转Bt基因棉花，从1997年开始在我国推广应用，目前已大规模种植于黄河流域和长江流域棉区，平均占到全国棉花种植面积的75%左右。由于转基因Bt棉花的大规模推广应用的高强度选择压力导致其祀标害虫棉铃虫(Helicoverpa armigera)对CrylAc毒素产生抗性,是Bt棉花使用中面临的最大威胁。目前研究表明棉铃虫中肠肠壁细胞钙粘蛋白基因突变是抗性形成的主要原因。钙粘蛋白是一类对细胞粘结起决定作用的依赖Ca2+的糖蛋白，参与多种细胞活动，是由12个重复子的胞外区、跨膜区和较小的胞内区组成。以往发现的基因突变部位均位于钙粘蛋白胞外区结构域，通过转座子的插入或片段缺失导致钙粘蛋白翻译提前终止，丧失了毒素结合区，从而对CrylAc产生抗性，这种功能丧失性突变产生的抗性通常呈隐性。2009年利用Fl单对检测法共检测230头山东夏津田间棉铃虫，检测到携带抗性基因的个体有67头。根据Fl检测的原理(Zhang等，Diverse genetic basis offield-evolved resistance to Bt cotton in cotton boIlworm from China. PNAS,2012,109(26) :10275-10280)，这些抗性个体与室内抗性品系SCD_rl单对杂交(Yang等，Introgression of a disrupted cadherin gene enables susceptible Helicoverpaarmigera to obtain resistance to Bacillus thuringiensis toxin CrylAc. Bulletinof Entomological Research, 200, 99 (2) : 175-181), F1 代经诊断剂量(I μ g/cm2CrylAc)处理存活个体应含有两个钙粘蛋白等位基因，一个来自SCD-rl品系G1) (Yang等，Identification and molecular detection of a deletion mutation responsiblefor a truncated casherin of Helicoverpa armigera.1nsect Biochemistry andMolecular Biology, 2006，36 (9) : 735-740)，另一个来自田间个体(rx)。SCD-rl 品系的抗性是由钙粘蛋白突变基因A引起的，Γι缺失大部分胞外区和整个跨膜区及胞质区，因此可以通过4组特异性引物选择性的克隆出田间抗性个体的钙粘蛋白基因rx (Zhao等，Diverse cadherin mutations conferring resistance to toxin CrylAc in Helicoverpaarimgera.，2010，40(2) : 113-118)。克隆了 20个田间抗性个体的钙粘蛋白基因序列，鉴定至IJI个新的钙粘蛋白突变基因r15。测序结果表明位于钙粘蛋白胞质区的第32号外显子缺失165个碱基，导致其编码的55个氨基酸发生缺失，这种钙粘蛋白胞质区突变能够使CrylAc毒力显著降低，从而导致抗性产生。(见附图1、见附图2)。多年多点的田间监测表明，虽然棉铃虫对Bt棉花的抗性水平没有明显上升，但田间对CrylAc毒素抗性基因频率在逐年增加，特别是新发现的非隐性抗性基因频率增加明显。目前主要的抗性监测技术包括剂量对数-死亡机率值法(抗性倍数法)、F1检测法、F2检测法、诊断剂量检测法及分子检测法。但前面四种抗性监测方法在棉铃虫对Bt棉花的抗性监测中都有明显的缺点，如不能检测抗性基因类型，难以确定合适的诊断剂量，室内必须有相应抗性品系，成本高，花费时间长等，导致对抗性监测的不准确和延后，严重影响后续有效抗性治理的开展和实施。而分子检测方法可以直接检测抗性基因型，精确性高，对待测样本的状态无要求，对抗性基因显隐性无要求，具有灵活性和稳定性。
发明内容
田间棉铃虫由于钙粘蛋白胞质区缺失突变导致的非隐性抗性基因频率增加明显，且在基因组DNA水平上有三种不同的类型。本发明的目的在于，利于PCR方法，根据钙粘蛋白胞质区缺失突变序列特点，建立快速、准确的分子检测方法，明确由此类突变导致的非隐性抗性基因频率，对棉铃虫对Bt棉花的抗性监测和治理提供指导，具有实用价值。棉铃虫对CrylAc毒素非隐性抗性的钙粘蛋白胞质区缺失突变的三种基因型DNA分子检测方法，设计特异性引物，采用PCR技术，检测棉铃虫种群内各个体钙粘蛋白胞质区 是否存在由于三种不同的插入或缺失导致胞内区32号外显子缺失55个氨基酸的情况。本发明棉铃虫对CrylAc毒素非隐性抗性的钙粘蛋白胞质区缺失突变的三种基因型DNA分子检测方法优选包含以下三个步骤第一步提取棉铃虫幼虫或成虫的基因组DNA ；第二步利用SEQ ID NO.1所示的引物A和SEQ ID NO. 2所示的引物B，PCR扩增上一步提取的棉铃虫基因组DNA ；第三步将上一步PCR获得产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，根据电泳图谱准确鉴定棉铃虫个体其钙粘蛋白胞质区缺失突变及其具体类型，一次性区分出抗性纯合子、抗性杂合子及敏感个体。r15_i突变是由第32号外显子上插入了 1459bp的片段，得到的PCR扩增产物的大小为2500bp左右，这个片段与I个棉铃虫羧酸胆碱酯酶基因(GenBank登录号为FJ997310.1)的3’端非编码区有95%的相似性，如果电泳结果只显示这一条带，则为钙粘蛋白胞内区基因组DNA插入而导致的mRNA缺失突变的抗性纯合子，如果电泳有2500bp和IOOObp两个条带，则为抗性杂合子(如附图3，泳道I和泳道2)。r15_2突变的等位基因在第32号外显子上缺失82bp的DNA序列，得到的扩增产物为750bp，如果电泳结果只显示这一条带，则为钙粘蛋白胞内区基因组DNA缺失而导致的mRNA第32号外显子缺失突变的抗性纯合子，如果电泳有750bp和IOOObp两个条带，则为抗性杂合子(如附图3，泳道3和泳道4)。r15_3突变是由第32号外显子上插入了约4000bp的片段形成，扩增产物约为5000bp，如果电泳结果只显示这一条带，则为钙粘蛋白胞内区基因组DNA插入而导致的mRNA缺失突变的抗性纯合子，如果电泳有5000bp和两个条带，则为抗性杂合子(如附图3，泳道5和泳道6)。如果PCR扩增片段只有IOOObp (如附图3，泳道7)，则为敏感个体。本发明方法还可包括基于第三步的结果判断种群内抗性基因频率。有益效果本发明就是基于室内前期研究的基础，开发了针对钙粘蛋白胞质区缺失突变的基因组DNA分子检测技术，它具有(I)快速、准确及同时检测钙粘蛋白胞质区突变基因组DNA水平上的三种不同类型，(2)判断出发生突变个体的基因型，计算出与突变有关的非隐性抗性基因个体频率，(3)全过程耗时5-8小时等特点。
与传统的抗性监测技术相比，此方法无需将田间试虫饲养至适宜虫龄，再进行生物测定以确定抗性水平，以后再通过与室内现有的抗性和敏感品系进行遗传杂交以决定抗性的显、隐性水平，最后再进行基因型鉴定。如果完成上述工作需数月甚至更长时间，其结果对生产实际的指导意义严重滞后。而本发明方法不需饲养试虫，节省劳动力和资源，可以快速、准确检测出棉铃虫对CrylAc毒素非隐性抗性钙粘蛋白胞质区缺失突变，以及具体DNA的变化类型，单个试虫仅需数小时。如果采集鉴定田间的代表性试虫种群，也只需几周时间就可以得到种群内抗性基因频率，鉴定结果可及时对棉铃虫的有效抗性治理提供正确指导。
图1棉铃虫SCD品系钙粘蛋白基因与rl5等位基因氨基酸序列比较相同序列用圆点表示，水平箭头表示推测的结构域起始点。SIG，信号肽区；EC，钙粘蛋白重复区；MPR，近膜区；TM，跨膜区；CYT，胞质区。黑色方框表示缺失片段。S⑶钙粘蛋白基因序列GenBank登录号 JN836544. 1，rl5 序列 GenBank 登录号 JN898956.1。 图2棉铃虫钙粘蛋白结构示意图。A :棉铃虫钙粘蛋白结构，分为胞外区、跨膜区和胞内区，其中胞外区又包括信号肽区(SIG)，11个钙粘蛋白重复子区(1-11)和近膜区(MPR)。B :棉铃虫钙粘蛋白基因组结构。胞内区缺失突变是由于在其基因组DNA第33个外显子上插入了 1459bp或4000bp或缺失了 82bp的DNA片段，导致胞内区缺失55个氨基酸。图3实施例1PCR扩增电泳结果图，用于验证棉铃虫钙粘蛋白胞质区的缺失突变及相应的基因组DNA突变类型。不同的泳道表示突变不同的基因型，其中各泳道分别表示l:r15_iri5_1;2:ri5_lS;3:ri5-2ri5-2; 4:r15_2s; 5:r15_3r15_3; 6 :r15_3s; 7: ss ；M:DNA Ladder。r15_!突变扩增片段为 2500bp，r15_2突变扩增片段为750bp，r15_3突变扩增片段为5000bp，ss扩增片段为lOOObp。图4实施例2PCR扩增电泳结果图，用于判断棉铃虫田间种群内个体发生钙粘蛋白胞质区的缺失突变及相应的基因组DNA突变类型的情况。不同的泳道表示突变不同的基因型，其中各泳道分别表示1，2:r15_2r15_2，为抗性纯合子；3，4，5:r15_2s,为抗性杂合子6，7: ss,为敏感个体；M:DNA Ladder。
具体实施例方式实施例1第一步单头棉铃虫幼虫或成虫基因组DNA的提取。(I)分别获取室内通过生物测定方法和与敏感品系遗传杂交证实其确为抗性纯合子、抗性杂合子和敏感个体的棉铃虫幼虫。(2)采用市售的DNA提取试剂盒提取幼虫基因组DNA。本方法采用爱思进生物技术(杭州)有限公司的AxyPr印基因组DNA小量试剂盒。(3)取棉铃虫3-4龄幼虫或成虫的腹部组织30毫克，于1. 5mL离心管中，加入O. 01mol/LPH7. 4的磷酸缓冲液350mL和O. 9 μ L RNaseA(50mg/mL)溶液研磨均匀。收集350 μ L组织匀浆液于2mL离心管。(4)加入150 μ L裂解液(Buffer C-L)和20 μ L蛋白酶K(15mg/mL)溶液，涡漩振荡I分钟后，短暂离心，再将其置于56度水浴10分钟。(5)加入350 μ L蛋白去除液(Buffer P-D),涡漩振荡30秒，12，OOOXg离心10分钟。(6)将DNA制备管置于另一 2m L离心管中，将(5)中的上清液移至制备管中，12，000 Xg离心I分钟。(7)弃滤液，将制备管放回原来的2mL离心管，加入500 μ L洗涤液(Buffer W1),12，000 Xg离心I分钟。(8)弃滤液，将制备管放回原来的2mL离心管，加入700 μ L去盐液(Buffer W2),12，000 Xg离心I分钟。(9)弃滤液，将制备管放回原来的2mL离心管，12，OOOXg离心I分钟。(10)弃滤液，将制备管放到另一洁净的1. 5mL离心管，在制备管膜中央加100-200 μ L2. 5mmol/L 的 Tris-HCL 溶液，12，000 Xg 离心 I 分钟，得到基因组 DNA 溶液，-20
度保存备用。第二步，对第一步中提取的基因组DNA模板进行钙粘蛋白特定基因片段的PCR扩
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>曰ο(I)根据棉铃虫钙粘蛋白胞质区32号外显子缺失后的序列特征，设计出特异性PCR引物，可以通过扩增同时检测出基因组DNA水平上三种不同的插入或缺失。上游引物A 的序列为TGATTGTTGTTGTGCTGCTTATTGTG (SEQ ID NO.1)下游引物B 的序列为CGATCAGGTCTGAGTCGTATGAC (SEQ ID NO. 2)(2)在O. 2mLPCR管中建立总反应体积为25 μ L的PCR反应体系。
IOXLA FCR BufTerII Clgs* Free) 2. 5Pl MgCI, C25minoi/L)2. nML
JXTP Mixture ( 1() ibo1/L each)0. 5μ|.
A (10μ iioi/L)L OlC
B (IOpboI/L)1. OA
(ienomi c DXAI, Ol1L
LA Taq DKA 聚合_ (5 / μ I)0. 25Λ
ddH2()(灭菌双蒸水)16· 25μΙ.
总体积25μ (3) PCR反应条件为94V预变性3分钟，94V变性30秒，57V退火30秒，72°C延伸5分30秒，循环数30，最后72°C延伸10分钟。反应结束后在4°C保存反应产物，用于后续琼脂糖凝胶电脉检测。第三步，对第二步得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电脉检测。(I)准备1% (g/mL)的琼脂糖凝胶。
(2)取IOyL PCR扩增产物进行电泳，稳流80mA，1. 5小时后在紫外光下观察。从电泳结果可以看到此对PCR引物针对棉铃虫钙粘蛋白基因在胞内区55个氨基酸的缺失突变扩增出三种类型，根据电泳条带的大小可以进行同时鉴定，并能一次区分出抗性纯合子、抗性杂合子及敏感个体，结果见附图3。由DNA的插入或缺失引起的3种突变导致钙粘蛋白胞质区mRNA水平上32号外显子的缺失。r15_i突变是由第32号外显子上插入了 1459bp的片段，得到的PCR扩增产物的大小为2500bp左右，这个片段与I个棉铃虫羧酸胆碱酯酶基因(GenBank登录号为FJ997310.1)的3’端非编码区有95%的相似性，抗性纯合子电泳结果只显示这一条带(如附图3，泳道I )，抗性杂合子电泳有2500bp和IOOObp两个条带(如附图3，泳道2)。r15_2突变的等位基因 在第32号外显子上缺失82bp的DNA序列，得到的扩增产物为750bp (如附图3，泳道3)，抗性纯合子电泳结果只显示这一条带，抗性杂合子电泳有750bp和IOOObp两个条带(如附图3，泳道4)。r15_3突变是由第32号外显子上插入了约4000bp的片段形成，扩增产物约为5000bp (如附图3，泳道5)，抗性纯合子电泳结果只显示这一条带，抗性杂合子电泳有5000bp和IOOObp两个条带(如附图3，泳道6)。敏感个体PCR扩增片段只有IOOObp (如附图3，泳道7)。实施例2下面说明本发明优选的技术方案用于棉铃虫种群内钙粘蛋白胞内区缺失突变基因频率的检测方法第一步单头棉铃虫幼虫或成虫基因组DNA的提取。(I)直接从田间采集棉铃虫幼虫或采用高压汞灯诱集棉铃虫成虫，将得到的试虫浸泡在95%的乙醇中带回实验室，随机抽取100头棉铃虫幼虫或成虫个体供基因频率检测。(2)采用市售的DNA提取试剂盒提取幼虫或成虫的基因组DNA。本方法采用爱思进生物技术(杭州)有限公司的AxyPr印基因组DNA小量试剂盒。(3)取棉铃虫3-4龄幼虫或成虫的腹部组织30毫克，于1. 5mL离心管中，加入O. 01mol/LPH7. 4的磷酸缓冲液350mL和O. 9 μ L RNaseA(50mg/mL)溶液研磨均匀。收集350 μ L组织匀浆液于2mL离心管。(4)加入150 μ L裂解液(Buffer C-L)和20 μ L蛋白酶K(15mg/mL)溶液，涡漩振荡I分钟后，短暂离心，再将其置于56度水浴10分钟。(5)加入350 μ L蛋白去除液(Buffer P-D),涡漩振荡30秒，12，OOOXg离心10分钟。(6)将DNA制备管置于另一 2mL离心管中，将(5)中的上清液移至制备管中，12，000 Xg离心I分钟。(7)弃滤液，将制备管放回原来的2mL离心管，加入500 μ L洗涤液(Buffer W1),12，000 Xg离心I分钟。(8)弃滤液，将制备管放回原来的2mL离心管，加入700 μ L去盐液(Buffer W2),12，000 Xg离心I分钟。(9)弃滤液，将制备管放回原来的2mL离心管，12，OOOXg离心I分钟。(10)弃滤液，将制备管放到另一洁净的1. 5mL离心管，在制备管膜中央加100-200 μ L2. 5mmol/L 的 Tris-HCL 溶液，12，000 Xg 离心 I 分钟，得到基因组 DNA 溶液，-20
度保存备用。第二步，对第一步中提取的基因组DNA模板进行钙粘蛋白特定基因片段的PCR扩
(I)根据棉铃虫钙粘蛋白胞质区32号外显子缺失后的序列特征，设计出特异性PCR引物，可以通过扩增同时检测出基因组DNA水平上三种不同的插入或缺失。上游引物A 的序列为TGATTGTTGTTGTGCTGCTTATTGTG (SEQ ID NO.1) 下游引物B 的序列为CGATCAGGTCTGAGTCGTATGAC (SEQ ID NO. 2)(2)在O. 2mLPCR管中建立总反应体积为25 μ L的PCR反应体系。
权利要求
1.棉铃虫对CrylAc毒素非隐性抗性的钙粘蛋白胞质区缺失突变的三种基因型DNA分子检测方法，其特征在于设计特异性引物，采用PCR技术，检测棉铃虫种群内各个体钙粘蛋白胞质区是否存在由于三种不同的插入或缺失导致胞内区32号外显子缺失55个氨基酸的情况。
2.根据权利要求1所述的分子检测方法，其特征在于该方法包含以下三个步骤 第一步提取棉铃虫幼虫或成虫的基因组DNA ； 第二步利用SEQ ID NO.1所示的引物A和SEQ ID NO. 2所示的引物B，PCR扩增上一步提取的棉铃虫基因组DNA ； 第三步将上一步PCR获得产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，根据电泳图谱准确鉴定棉铃虫个体其钙粘蛋白胞质区缺失突变及其具体类型，一次性区分出抗性纯合子、抗性杂合子及敏感个体。
3.根据权利要求2所述的分子检测方法，其特征在于所述的分子检测方法还包括根据第三步的结果判断种群内抗性基因频率。
4.根据权利要求1所述的分子检测方法，其特征在于所述的根据电泳图谱准确鉴定棉铃虫个体其钙粘蛋白胞质区缺失突变及其具体类型，一次性区分出抗性纯合子、抗性杂合子及敏感个体的方法是如果电泳结果只显示2500bp条带，则表明该棉铃虫为钙粘蛋白胞内区基因组DNA插入而导致的mRNA缺失突变的抗性纯合子；如果电泳结果显示2500bp和IOOObp两个条带，则该棉铃虫为抗性杂合子；如果电泳结果只显示750bp条带，则表明该棉铃虫为钙粘蛋白胞内区基因组DNA缺失而导致的mRNA第32号外显子缺失突变的抗性纯合子；如果电泳结果显示750bp和IOOObp两个条带,则表明该棉铃虫为抗性杂合子；如果电泳结果只显示5000bp条带，则表明该棉铃虫为钙粘蛋白胞内区基因组DNA插入而导致的mRNA缺失突变的抗性纯合子；如果电泳结果显示5000bp和IOOObp两个条带，则表明该棉铃虫为抗性杂合子；如果电泳结果只显示lOOObp，则表明该棉铃虫为CrylAc毒素敏感个体。
全文摘要
本发明公开了棉铃虫对Cry1Ac毒素非隐性抗性钙粘蛋白胞质区缺失突变的分子检测方法。该检测方法共分3个主要步骤，第一步分别提取棉铃虫样品的基因组DNA；第二步进行特定钙粘蛋白胞质区片段的PCR扩增；第三步将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳图谱，可以准确鉴定基因型，并以此判断不同种群的抗性基因频率。本发明方法不需饲养试虫，节省劳动力和资源，可以快速、准确检测出棉铃虫的基因型，单个试虫仅需数小时，采集鉴定田间种群的抗性个体频率也只需几周时间，鉴定结果可及时对棉铃虫的有效抗性治理提供正确指导。
文档编号C12Q1/68GK103014159SQ201210524000
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月7日 优先权日2012年12月7日
发明者吴益东, 张浩男, 杨亦桦, 武淑文 申请人:南京农业大学