通过加强辅酶循环再生速率提高Bacillus amyloliquefaciens 2，3-丁二醇产量的制作方法
【专利摘要】本发明从B.amyloliqefaciens?B10-127中克隆出参与2,3-丁二醇合成途径中辅酶循环再生的关键酶基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)和3-羟基-2-丁酮还原酶(acr)，并将该基因与穿梭表达质粒pMA5-HpaII连接，成功构建了携带基因gapdh和acr基因的穿梭表达质粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gapdh，并转入解淀粉芽孢杆菌B10-127中，获得加强gapdh和acr基因表达的解淀粉芽孢杆菌pMA5-HpaII-acr-HapII-gapdh／B.amyloliquefaciens。原始菌株相比，重组菌2,3-丁二醇产量提高了14.7％，副产物如3-羟基-2-丁酮、乳酸和丁二酸的积累分别降低65.6％、43.8％和42.4％，且发酵周期有所缩短。通过补料流加发酵，2,3-丁二醇产量达到121.3g／L。
【专利说明】通过加强辅酶循环再生速率提高Baci Ilusamy 1li quefac i ens 2，3-丁二酉孚产量
【技术领域】
[0001]通过加强辅酶循环再生速率提高Bacillus amyloliquefaciens合成2, 3_ 丁二醇
产量，属于基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]随着能源资源的日益短缺和环境问题的日益严重，开发可再生的生物质资源为原料，经过化学、生物及其集成方法生产各种化学品、功能材料和能源物质的生物炼制技术越来越受到国内外的高度重视。2，3-丁二醇是重要的化工原料和液体燃料，广泛应用于化工、食品、燃料及航空航天等领域。2，3- 丁二醇脱氢生成双乙酰，是一种高价值食品风味剂，具有一定的抑菌效果；在脱氢酶的作用下，生成的3-羟基-2- 丁酮(乙偶姻)是一种应用广泛的天然食用香料；脱水生成的甲乙酮可作为一种高价值的液体燃料添加剂，亦是重要的低沸点溶剂，应用于涂料、粘结剂、润滑剂、燃料、油墨等行业；脱水生成的1，3_ 丁二烯可用于合成橡胶、ABS树脂及SBS弹性体等；酯化产品是合成聚酯和聚氨酯的前体。而且2，3-丁二醇是一种极具价值的液体燃料，其燃烧值与甲醇(22.1kJ / g)、乙醇(29.0kJ / g)相当。由于2，3- 丁二醇的高辛烷值，它可作为汽油的辛烷值提升剂或航空燃料另外，2，3- 丁二醇及其衍生物亦可广泛用于药用载体、增塑剂、柔软剂等的生产。
[0003]近年来用糖质原料发酵生产2，3_ 丁二醇取得了较好的实验室研究结果，但生物法生产2，3- 丁二醇尚未实现工业化。目前报道的2，3- 丁二醇生产菌株多为克雷伯氏菌属(Klebsiella)肠杆菌属(Enterobacter)和沙雷氏菌属(Serratia)等，这些菌种具有潜在致病性，不符合符合工业化 安全生产的要求。因此，使用安全菌种利用葡萄糖发酵生产2，3-丁二醇具有良好的工业化前景。本发明人在前期研究中筛选得到一株安全菌株Bacillusamyloliquefaciens,该菌具有良好的2,3- 丁二醇生产潜力，但是发酵过程中积累较多的副产物如3-羟基-2- 丁酮、乳酸和丁二酸等。葡萄糖代谢合成2，3- 丁二醇的过程也是一个氧化还原反应，该反应途径中需要辅酶NADH和NAD+的参与。葡萄糖首先经过EMP途径生产丙酮酸，此途径中的关键酶3-磷酸甘油醛脱氢酶氧化3-磷酸甘油醛合成磷酸烯醇式丙酮酸，需要氧化型辅酶NAD+的参与；随后丙酮酸经过三个关键酶催化合成2，3_ 丁二醇，而2，3-丁二醇的合成最后一步是乙偶姻还原酶催化还原乙偶姻合成2，3-丁二醇，此反应需要还原型辅酶NADH的参与。3-磷酸甘油醛脱氢酶和乙偶姻还原酶组成一个辅酶循环再生体系。为进一步提高该菌株2，3_ 丁二醇合成能力，并减少副产物的积累，发明人提出了一种通过加强辅酶循环再生速率提高Bacillus amyloliquefaciens合成2, 3_ 丁二醇能力的方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种通过加强辅酶循环再生速率提高Bacillusamyloliquefaciens合成2, 3_ 丁二醇能力的方法。[0005]本发明所使用菌种为Bacillus amyloliquefaciens B10-127 (已保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址:中国.武汉.武汉大学；保藏日期:2012年9月14日；保藏编号为:CCTCC NO:M2012349)。本发明首先从解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B10-127中克隆出参与2, 3_ 丁二醇合成途径中辅酶循环再生的关键酶基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)和3-羟基-2-丁酮还原酶(acr)，并将该基因与穿梭表达质粒pMA5_HpaII连接，成功构建了携带基因gapA和acr基因的穿梭表达质粒pMA5-Hpa 11 -acr-Hap 11 -gap dh,并转入解淀粉芽孢杆菌B10-127中，获得加强gapdh和acr基因表达的解淀粉芽抱杆菌 pMA5-HpaI1-acr-HapI1-gapdh / B.amyloliquefaciens (重新命名为PAG)。并对原始菌及重组菌pAG进行2，3- 丁二醇发酵性能检测，说明加强gapdh和acr基因的表达能够提高2，3- 丁二醇产量，降低副产物如3-羟基-2- 丁酮、乳酸和丁二酸的积累。[0006]基于以上研究，对原始菌以及重组菌pAG进行发酵实验，结果表明，与原始菌株相t匕，重组菌2，3- 丁二醇产量提高了 14.7%，副产物如3-羟基-2- 丁酮、乳酸和丁二酸的积累分别降低65.6%、43.8%和42.4%，且发酵周期有所缩短。为了进一步提高重组菌的发酵性能，我们采用补料流加，发酵48h，发酵液中2，3- 丁二醇积累量达到121.3g/L，这是现有技术所不能达到的结果。
[0007]本发明的有益效果:
[0008]本发明人所用菌株是一株安全菌株B.amyloliquefaciens,通过加强辅酶循环再生速率提高B.amyloliquefaciens合成2, 3_ 丁二醇效率,并减少发酵过程中副产物如3-羟基-2-丁酮、乙酸、乳酸和丁二酸等的积累，这有利于提高生产效率，降低生产成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1 质粒 pMA5-HpaI1-acr_HapI1-gapdh 构建不意图
[0010]图2SDS-PAGE分析蛋白表达情况
【具体实施方式】
[0011]实施例1:目的基因的扩增及重组解淀粉芽孢杆菌的构建
[0012]质粒pMA5-HpaI1-acr_HapI1-gapdh构建示意图如图1所示,具体过程如下:
[0013]首先，以菌株B10-127的染色体DNA为模板，利用引物Pl和P2，通过PCR技术扩增得到一段901bp大小的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的acr基因，将纯化后的acr基因经限制性内切酶NdeI和BamHI消化后，与同样经过上述两种限制性内切酶消化的质粒pMA5-HapII 连接(pMA5-HapII 序列如 SED ID NO:3 所示)，构建重组质粒 pMA5-HapII_acr，经双酶切验证后，表明该重组质粒构建成功。随后，利用引物P3和P4通过PCR扩增得到核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的基因gapdh，将纯化后的acr基因经限制性内切酶MluI和BamHI消化后，与同样经过上述两种限制性内切酶消化的质粒pMA5_HapII连接，构建另一个重组载体pMA5-HapI1-gapdh ;然后以重组载体pMA5-HapI1-gapdh为模板，利用引物P4和P5通过PCR技术扩增出带有启动子HapII的基因片段HapI1-gapdh ;最后，将该基因片段通过限制性内切酶Mlu I处理后，与同样经过Mlu I处理和去磷酸化处理的载体pMA5-HapI1-acr在T4DNA连接酶的作用下16°C过夜连接，将连接液转化至大肠杆菌感受态E.coli JM109中，挑取阳性转化子，提取转化子中的质粒，经酶切验证并确认重组质粒 pMA5-HapI1-acr_HapI1-gapdh 构建成功。将重组质粒 pMA5-HapI1-acr_HapI1-gapdh以电击转化的方法转化至解淀粉芽孢杆菌，挑取阳性转化子，即得到重组解淀粉芽孢杆菌pMA5-HpaI1-acr-HapI1-gapdh / B.amyloliquefaciens。对原始菌以及重组菌 pAG 胞内蛋白表达分析可以看出，基因gapdh和acr在重组菌pAG成功实现过量表达。
[0014]以B.amyloliquefaciens基因组总DNA为模板,设计两条引物,PCR扩增引物设计如下:
[0015]Pl:5? -CGCATATGATGAAAGCGGCAAGATGGC-3’ (Nde I),
[0016]P2:5’ -CGGGATCCTTAATTCGGTTTTACTAAG-3’ (BamH I)。
[0017]P3:5， -CGGGATCCATGAAGGTAAAAGTAGC-3， (BamHI),
[0018]P4:5’ -CGACGCGTCTACACAGCTGACGGGTG-3’ (Mlu I),
[0019]P5:5’ -CGACGCGTTTTTGAGTGATCTTCTC-3’ (MluI)
[0020]实施例3:菌原始菌及重组菌的发酵性能验证
[0021](I)种子培养
[0022]从活化平板上挑取单菌落接种于种子培养基中，种子培养温度37°C，摇床转速160r / min，培养时间为12h左右`，种子培养基组成:酵母提取物5g / L，胰蛋白胨IOg /L, NaCllOg / L0
[0023](2)发酵培养
[0024]初始发酵培养体积为2.5L，采用的发酵培养基成分如下:
[0025]发酵培养基成分:葡萄糖160g/L,玉米衆5g / L,尿素3g/L,柠檬酸钠6g/L,K2HP044g / L，MgSO40.2g/L ;将上述发酵培养基用5mol / L的NaOH调节其pH至6.5，在121 °C下高温灭菌30min。
[0026]发酵发酵条件:将上述培养好的种子液按4%接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度37°C，空气流量为120m3 / h*m3培养基，搅拌转速为350r / min。定时取样测定细胞浓度、底物残留量和3-羟基-2- 丁酮产量。发酵结束后，发酵液中产物2，3- 丁二醇和乙偶姻用气相色谱测定(GC-1690J气相色谱仪，杭州科晓化工仪器公司)。色谱条件如下:毛细管柱，30mX0.32mn色谱柱中固定液为AT.SE-30，，检测器为FID，柱温150°C，汽化室与检测器的温度均为250°C，载气为N2，流速0.1Mpa,进样量2 u L，采用外标法定量。利用液相色谱分析发酵液中有机酸含量。色谱条件:色谱柱为KC-811，流动相A为4mM高氯酸，流动相B为超纯水，流动相梯度为0~7.5min25%~75% A，7.51~15min75% A，流动相流速为1.0mL / min，紫外检测波长为210nn，进样量为20iU，柱温为60°C。结果如表I所示，与原始菌株相比，重组菌2，3- 丁二醇产量提高了 14.7%，副产物如3-羟基-2- 丁酮、乳酸和丁二酸的积累分别降低65.6%,43.8%和42.4%，且发酵周期有所缩短。
[0027](3)补料流加发酵培养
[0028]种子培养基发酵培养条件和实施例3(1)和3(2)相同，当发酵液中葡萄糖残留浓度低于20g/L，通过补料泵一次性补加60-70g/L左右的葡萄糖，当葡萄糖消耗速率低于6g / L *h时停止补料，当残留在发酵液中的葡萄糖被消耗完时结束发酵。通过补料流加发酵，2，3-丁二醇产量达到121.3g/L。
[0029]表1原始菌以及重组菌pAG发酵生产2，3- 丁二醇性能比较
【权利要求】
1.一种加强辅酶循环再生速率的重组解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens),其特征在于:将SEQ ID NO:1所示的3-羟基-2- 丁酮还原酶基因acr和SEQ ID NO:2所示的3-磷酸甘油醛脱羧酶基因gapdh共同克隆到穿梭载体pMA5-HpaII构建成为重组穿梭表达质粒pMA5-HpaI1-acr-HapI1-gapdh并转化至保藏编号为CCTCC NO:M2012349的解淀粉芽孢杆菌中，从而提高解淀粉芽孢杆菌合成2，3- 丁二醇的能力。
2.将权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌用于2，3_丁二醇发酵上的应用，其特征是与原始的解淀粉芽孢杆菌相比，重组菌2，3_ 丁二醇产量提高了约14.7%，副产物如3-羟基-2- 丁酮、乳酸和丁二酸的积累分别降低65.6%、43.8%和42.4%，且发酵周期有所缩短。通过补料流加 发酵，2，3- 丁二醇产量达到121.3g/L。
【文档编号】C12R1/07GK103602624SQ201310342415
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年8月8日 优先权日:2013年8月8日
【发明者】饶志明, 杨套伟, 张显, 徐美娟, 满在伟 申请人:江南大学