一种副溶血弧菌vp核酸恒温扩增方法

一种副溶血弧菌vp核酸恒温扩增方法
【专利摘要】本发明公开了一种副溶血弧菌VP核酸恒温扩增方法，具体地，本发明方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有扩增副溶血弧菌VP的特异性引物对。本发明方法能够高特异性、高灵敏度、低污染、避免假阳性、快速（常规50分钟完成检测）地对含有VPRNA的待测样品进行扩增，具有检测效率高，准确度高的特点，具有广阔的应用前景。
【专利说明】—种副溶血弧菌VP核酸恒温扩增方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及食源致病性微生物的生物检测【技术领域】，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的副溶血弧菌(VP)的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。
【背景技术】
[0002]副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus,VP)是一种革兰氏阴性嗜盐杆菌,该菌是引起食源性疾病的重要病原之一，可导致患者腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应。在多种食物如水产品、腌制品中常会发生副溶血性弧菌污染。1998年以来的资料显示，副溶血弧菌引发的食物中毒的发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，均己超过沙门氏菌食物中毒，跃居首位。
[0003]目前副溶血弧菌检测方法主要有分离培养方法及分子生物学方法。分离培养法操作步骤繁琐，检测周期长，一般需要5~7天完成，不能满足快速检测的要求。分子生物学方法有PCR方法和LAMP方法。PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点，但这类方法通常检测成本高，需要比较昂贵的PCR仪，对实验环境和操作者技术要求也比较高。LAMP方法不需要昂贵仪器，操作也简便。但以上两种方法检测靶标均为DNA，不能区分活菌与死菌，容易发生假阳性结果。
[0004]实时突光核酸恒温扩增检测技术(SimultaneousAmplification and Testing,简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42°C)，无需热循环。SAT技术直接以病原微生物特异性RNA为扩增靶标，以扩增产物RNA为检测靶标，在自然界中病原微生物死亡后靶`标RNA会快速降解，而DNA会存在一段时间，通过对目标RNA的检测，可实现食品致病菌活菌检测，降低假阳性。

【发明内容】

[0005]本发明的目的是提供一种快速，高准确度，污染易控，避免假阳性，设备简单，成本低的VP RNA检测方法。
[0006]本发明的第一方面，提供了一种副溶血弧菌VP的扩增方法，所述扩增方法包括步骤:在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有副溶血弧菌VP的特异性引物对，所述引物对包括:
T7引物:序列如SEQ ID NO: 3所示；和 nT7引物:序列如SEQ ID NO: 4所示。
[0007]在另一优选例中，所述反应体系中还包括M-MLV反转录酶和Τ7 RNA聚合酶。
[0008]在另一优选例中，所述反应体系还包括副溶血弧菌VP的捕获探针。
[0009]在另一优选例中，所述反应体系还包括副溶血弧菌VP的检测探针。
[0010]在另一优选例中，所述的捕获探针的一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团。[0011]在另一优选例中，所述的检测探针的5’端标记FAM荧光基团，且检测探针的3’端标记DABCYL淬灭基团。
[0012]在另一优选例中，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示。
[0013]在另一优选例中，所述的捕获探针可与副溶血弧菌VP的靶标核酸(VP RNA)序列特异结合。
[0014]在另一优选例中，所述方法还包括:在另一阳性(对照)反应体系或阴性(对照)反应体系中进行扩增反应。
[0015]在另一优选例中，所述的对照反应体系中含有所述特异性引物对、VP内标(VP ICRNA)、所述捕获探针和所述检测探针。
[0016]在另一优选例中，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0017]在另一优选例中，所述的检测探针用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述VP靶标核酸(VP RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合。
[0018]在另一优选例中，所述方法还包括步骤:在扩增反应过程之中或之后，检测副溶血弧菌VP的特异性探针发出的荧光信号。
[0019]在另一优选例中，所述方法为实时荧光核酸恒温扩增法。
[0020]在另一优选例中，所述反应体系中还含有待测的副溶血弧菌或衍生自所述副溶血弧菌核酸。
[0021]在另一优选例中，所述的待测核酸是来自各类鲜冻水产品及腌制食品。
[0022]本发明的第二方面，提供了一种副溶血弧菌VP的非诊断性检测方法，其特征在于，所述检测方法包括:
用如本发明第一方面中所述的扩增方法扩增待测样品；和
在扩增反应过程之中或之后，检测副溶血弧菌VP的特异性探针发出的荧光信号。
[0023]在另一优选例中，所述方法还包括设置一个或多个对照组。
[0024]在另一优选例中，所述对照组包括:VP阳性对照组、VP阴性对照组、VP内标对照组。
[0025]本发明的第三方面，提供了一种副溶血弧菌VP的检测试剂盒，所述试剂盒包括: (a)第一容器，以及位于所述容器内的扩增副 溶血弧菌的特异性引物对，所述引物对
包括:
T7引物:序列如SEQ ID NO: 3所示；和 nT7引物:序列如SEQ ID NO: 4所示;
以及使用说明书。
[0026]在另一优选例中，所述的试剂盒还含有选自下组的一种或多种组分:
(b)捕获探针；
(C)检测探针；
(d)EV内标序列；和/或
(e)内标检测探针。
[0027]在另一优选例中，所述试剂盒中还包括一种或多种酶。
[0028]在另一优选例中，所述的酶是M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶。
[0029]在另一优选例中，所述M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于一酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和EV检测探针存在于一检测液中。
[0030]在另一优选例中，所述的内标检测探针存在于VP检测液中。
[0031]在另一优选例中，所述VP内标为竞争性内标，并与VP靶标核苷酸(VP RNA)使用同一对引物(Τ7和ηΤ7)。
[0032]在另一优选例中，所述试剂盒中还包括VP阳性对照和/或VP阴性对照。
[0033]在另一优选例中，所述捕获探针是与副溶血弧菌的靶标核酸(VP RNA)序列特异结合的捕获探针；和/或
所述检测探针是与根据所述VP靶标核酸(VP RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的VP检测探针。
[0034]在另一优选例中，所述的捕获探针和/或所述的检测探针还可与副溶血弧菌VP的靶标核酸(VP RNA)序列特异结合。
[0035]在另一优选例中，所述的试剂盒还包括选自下组的一个或多个特征:
所述检测探针包括如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列；和/或
所述的捕获探针包括如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列；和/或 所述的VP内标序列包括如SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列；和/或 所述的内标检测探针包括如S EQ ID NO: 6所示的核苷酸序列。
[0036]在另一优选例中，所述试剂盒包含以下组分:裂解液、核酸提取液、洗涤液、VP反应液、VP检测液、SAT酶液、VP阳性对照、VP阴性对照和VP内标；
其中，
所述裂解液包括硫酸铵((NH4)2SO4)和HEPES ；
所述核酸提取液包括捕获探针和磁珠；
所述洗涤液包括NaCl和SDS ；
所述VP反应液包括dNTP和NTP ；
所述VP检测液包括T7引物、nT7引物、EV检测探针和内标检测探针；
所述SAT酶液包括M-MLV反转录酶、Τ7 RNA聚合酶；
所述VP阳性对照包括副溶血弧菌5’端的toxR基因的体外转录RNA稀释物；
所述的VP阴性对照是不含有副溶血弧菌靶标核酸(VP RNA)序列或不含有副溶血弧菌的溶液，较佳地，所述的阴性对照是生理盐水；
VP内标:含VP内标RNA(VP IC RNA,序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示)稀释物。
[0037]在另一优选例中，所述试剂盒包括A盒和B盒，其中，
A盒为标本处理单元，包括所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗涤液；
B盒为核酸扩增检测单元，包括所述VP反应液、VP检测液、SAT酶液、VP阳性对照、VP阴性对照及VP内标。
[0038]本发明的第四方面，提供了一种扩增肠道病毒的特异性引物对，所述引物对 包括:
T7引物:序列如SEQ ID NO: 3所示；和 nT7引物:序列如SEQ ID NO: 4所示。
[0039]本发明的第五方面，提供了一种如本发明第三方面所述的试剂盒或如本发明第四方面所述的引物对的用途，其特征在于，对鲜冻水产品及腌制食品样品中是否存在副溶血弧菌VP进行定性检测，和对是否存在副溶血弧菌VP活菌进行判定。
[0040]在另一优选例中，所述的鲜冻水产品样品包括贝类、鱼类、虾类、蟹类、海草等及其相应加工产品等；所述的腌制产品包括各类蔬菜、禽肉蛋类腌制后的食品。
[0041]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【专利附图】

【附图说明】
[0042]图1为副溶血弧菌的灵敏度Fl通道检测结果 图2为副溶血弧菌的灵敏度F2通道检测结果
图3为实施列4中SAT检测B管VP的检测结果 图4为实施列4中PCR检测B管VP的检测结果 图5为实施列4中SAT检测A管VP的Fl通道检测结果 图6为实施列4中SAT检测A管VP的F2通道检测结果 图7为实施列4中PCR检测A管VP的检测结果 【具体实施方式】
本发明人经过长期而深入的研究，经过大量筛选和验证，开发了高特异性，高灵敏的专用引物对。使用该特定的引物序列对副溶血弧菌VP的核酸进行扩增时，具有高特异性，高灵敏等优异优点，可以用于准确地检测副溶血弧菌VP。基于上述发现，发明人完成了本发明。
[0043]引物和探针
如本文所用，术语“扩增引物和探针副溶血弧菌VP的特异性引物”指这样的引物(对)，它扩增出的扩增产物具有副溶血弧菌VP的互补链序列。
`[0044]在引物设计上，为了能够更好地满足目前对副溶血弧菌VP检测的需要，本发明人选择了 VP病毒5’端的toxR基因中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)。优选的引物序列包括如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的引物对。
[0045]在本发明的扩增方法中，除引物外，反应体系中还可以包括一个或多个探针，如检测探针，捕获探针等。
[0046]如本文所用，术语“副溶血弧菌VP的捕获探针”指可与副溶血弧菌VP的靶标核酸(VP RNA)序列特异结合的核苷酸序列。本发明的一种优选的捕获探针具有如SEQID NO:2所示的核苷酸序列。更佳地，所述的捕获探针特异结合于副溶血弧菌VP的靶标核酸(VPRNA)序列。在另一优选例中，当所述副溶血弧菌VP含有VP内标(VP IC RNA)时，所述捕获探针还可以与所述VP内标序列特异结合，用于设计阴性对照组。
[0047]VP检测探针为分子信标，是一类高特异性、高敏感性的分子探针，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎，分子信标探针与线性的TaqMan探针相比，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而特异性要好于线性探针。本发明的一种优选的检测探针具有如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列。[0048]本发明的引物序列和探针序列根据引物探针设计原理，使用DNAStar、DNAMAN软件和人工设计用于实时荧光核酸恒温扩增检测副溶血弧菌VP的专用引物和检测探针序列。通过大量实验筛选比对靶标检测探针，选取灵敏度较优者。在内标检测探针设计中，需选取与靶标RNA无交叉反应的竞争性内标(VP RNA)及相应内标探针，确保该内标检测探针与靶标检测探针分别对VP RNA与VP IC RNA无交叉信号，且对内标RNA检测灵敏度较优者。本发明的一种优选的内标检测真具有如SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。
[0049]对照物
由于SAT扩增易受多种因素影响而使扩增失败，使试剂盒使用人员判断失误得出错误的结论，因此，在本发明的试剂盒中还可以设置对照物，以排除检测结果失真的情况。
[0050]本发明中可以设置的参照物包括:VP阳性对照、VP阴性对照和VP内标中的一个或多个对照物。 [0051]VP阳性对照可以是为体外转录的RNA，不具有生物学活性。通过检测阳性对照，可证明试剂盒检测方法及材料无误，保证检测的准确性，同时可以监测每次检测的重复性和稳定性及试剂盒批次间的差异。
[0052]此外，通过阳性对照品可制备临界弱阳对照(以生理盐水和裂解液按1:1混合成为稀释液，稀释阳性对照100倍作为临界弱阳对照)，可以提示处于临界值状态时的检验操作情况，通过临界弱阳对照定期检测SAT实验室，可进行室内质量控制，以防止检测过程出现漏检(假阴性)的情况。
[0053]VP内标可以是体外转录的RNA，不具有生物学活性。VP内标作为VP RNA的竞争性内标，可以作为参照物，用于防止假阴性结果的发生，通过检测加入有内标的样本，可了解整个扩增反应体系是否受抑制，更好的提示假阴性。
[0054]阴性对照可排除假阳性，在正确使用试剂盒检测方法和材料情况下，可保证检测的特异性。
[0055]在另一优选例中，所述体外转录的VP RNA通过以下述方法制备:
(1)用化学合成法合成VP5’端的iwR基因片段(VP阳性片断，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 8所示)；
(2)将VP5’端的iozR基因片段插入到pGEM?-T载体中，构建VP阳性对照质粒；
(3)VP阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5 α中，命名为pGEM?_T_VP菌株，贮存于-70。。；
(4)从pGEM?-T-VP菌株中提取pGEM?-T-VP质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。
[0056]在另一优选例中，所述VP内标中的体外转录的VP IC RNA以下述方法制备:
(I)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同VP靶标序列区域(VP内标片断，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 9所示)；
(2)将片段克隆到pGEM?-T载体中，构建VP内标质粒；
(3)EV内标质粒转化到大肠杆菌DH5a中，命名为pGEM?_T_ VP IC菌株，贮存于_70°C;
(4)从pGEM?-T-VP IC菌株中提取pGEM?_T_VP IC质粒，将质粒进行转录RNA纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA。[0057]检测方法
本发明还提供了副溶血弧菌VP的检测方法，包括用本发明所述的特异性引物对待测样品进行扩增；和
在扩增反应过程中或之后，检测副溶血弧菌VP的扩增产物，例如通过检测特异性探针发出的突光信号。
[0058]所述方法还可以任选地包括设置一个或多个对照组，如VP阳性对照组、VP阴性对照组、VP内标组等。
[0059]在本发明中，检测方法可以用常规的PCR方法，也可用实时荧光检测法等不同的方法。一种特别优选的方法是实时荧光核酸恒温扩增法。
[0060]实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)
核酸恒温扩增实时荧光检测技术，其原理是将RNA恒温扩增和实时荧光检测相结合的一种新型核酸检测技术。首先通过M-MLV反转录酶、T7 RNA多聚酶和优化探针(optimalprobe, patent pending)技术来同时实现。反转录酶用于产生祀标核酸(RNA)的一个DNA拷贝，T7 RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和这些RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。检验结果根据实时荧光信号的出现时间和强度，结合阳性对照、阴性对照和内标信号对检验结果进行判定。
[0061]在本发明中，副溶血弧菌VP检测技术通过使用高特异性和高灵敏度的专用引物对，并配合使用专用的捕获探针，可高效、特异性捕获VP的RNA。核酸扩增使用M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶来同时实现，反转录酶用于产生5靶标核酸RNA的一个DNA拷贝，T7RNA聚合酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化检测探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。
[0062]试剂盒
本发明提供了一种副溶血弧菌VP的检测试剂盒，包括:
(a)扩增副溶血弧菌的特异性引物对，所述引物扩增出的扩增产物具有副溶血弧菌VP的互补链序列；
(b)捕获探针；和 (b)检测探针。
[0063]所述的引物对是一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生VP靶标核酸(VP RNA)的DNA拷贝的VP扩增引物，在本发明的一个优选例中，所述的VP扩增引物包括:T7引物:SEQID NO: 3;和 nT7 引物:SEQ ID NO: 4。
[0064]所述的捕获探针是与副溶血弧菌的靶标核酸(VP RNA)序列特异结合的捕获探针；所述的检测探针是与根据所述VP靶标核酸(VP RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的VP检测探针。在另一优选例中，所述的捕获探针和/或所述的检测探针还可与副溶血弧菌VP的靶标核酸(VP RNA)序列特异结合。
[0065]所述的副溶血弧菌VP还可以被设计为含有VP内标(VP IC RNA)，较佳地，当副溶血弧菌含有VP内标时，所述捕获探针和检测探针被设计为还可以与所述VP内标序列特异结合，形成VP内标对照组。在另一优选例中，所述VP内标为竞争性内标，并与VP靶标核苷酸(VP RNA)使用同一对引物(T7和nT7)。
[0066]所述试剂盒中还可以包括一种或多种酶。如M-MLV反转录酶和Τ7 RNA聚合酶。在另一优选例中，所述M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于一酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和VP检测探针存在于一检测液中。
[0067]在另一优选例中，所述试剂盒包含以下组分:裂解液、核酸提取液、洗涤液、VP反应液、VP检测液、SAT酶液、VP阳性对照、VP阴性对照和VP内标；其中，所述裂解液包括硫酸铵((NH4)2SO4)和 HEPES ；
所述核酸提取液包括捕获探针和磁珠；
所述洗涤液包括NaCl和SDS ；
所述VP反应液包括dNTP和NTP ；
5所述VP检测液包括T7引物、nT7引物、VP检测探针和内标检测探针；
所述SAT酶液包括M-MLV反转录酶、Τ7 RNA聚合酶；
所述VP阳性对照包括副溶血弧菌5’端的iwR基因的体外转录RNA稀释物；
所述的VP阴性对照是不含有副溶血弧菌靶标核酸(VP RNA)序列或不含有副溶血弧菌的溶液，较佳地，所述的阴性对照是生理盐水；
VP内标:含VP内标RNA (VP IC RNA，序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示)的体外转录RNA稀释物。
[0068]在另一优选例中，所述试剂盒的一个反应单位中各种试剂组成如下:
(1)裂解液:HEPES25-250mM, (NH4)2SO4 5-50mM ；
(2)核酸提取液:HEPES50-400mM, EDTA 40-200mM, LiCl 400-2000mM,捕获探针1-50 μ M (优选为 5-25 μ Μ),磁珠 50_500mg/L (优选为 50-250mg/L)；
(3)洗涤液:HEPES5-50mM, NaCl 50-500 mM, lwt% SDS, EDTA 1-1OmM ；
(4)VP 反应液:Tris 10-50mM, MgCl2 10-40mM, dNTP 0.1-1OmM(优选为 0.5_5mM)，NTP
l-20mM (优选为 1-1OmM)，PVP40 1-10%, KCl 5-40mM ；
(5)VP检测液:将VP扩增引物和VP检测探针溶解在TE溶液(IOmM Tris和I mM EDTA的混合液)中配制而成，各引物和探针浓度在5-lOpmol/反应均可；
其中T7引物浓度优选为5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，VP检测探针浓度优选为5pmol/反应’内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；
(6)SAT 酶液=M-MLV 反转录酶 400-4000U/ 反应(优选为 500-1500U/ 反应)、T7 RNA聚合酶 200-2000U/反应(优选为 500-1000U/反应)、2_10mM ΗΕΡΕ、ρΗ7.5、10-100 mMN-acetyl_L-cysteine、0.04-0.4 mM zinc acetate、10-100 mM trehalose>40-200 mMTris-HCl pH 8.0、40_200mM KCU0.01-0.5mM EDTA、0.1-1% (v/v) Triton X-100 和20-50% (v/v) glycerol ；
(7)VP阳性对照；含IO5-1O8拷贝/mL副溶血弧菌(VP) toxR基因的体外转录RNA稀释
物；
(S)VP阴性对照:不含有副溶血弧菌(VP)靶标核酸(EV RNA)序列或不含有副溶血弧菌(VP)的溶液；
(9)EV内标:含IO5-1O8拷贝/mL VP IC RNA(序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示)。
[0069]在另一优选例中，所述的试剂盒还包括一个或多个容器，且上述的各个组分可分别位于一个或多个容器中，在另一优选例中，所述试剂盒包括A盒和B盒，其中，
A盒为标本处理单元，包括所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗涤液；B盒为核酸扩增检测单元，包括所述VP反应液、VP检测液、SAT酶液、VP阳性对照、VP阴性对照及VP内标。
[0070]在另一优选例中，所述的检测探针包括如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列,和/或所述的捕获探针包括如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。
[0071]利用以上试剂盒对副溶血弧菌进行实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下步骤:
1)用裂解液裂解待测样品中的副溶血弧菌，得到含有副溶血弧菌核酸的裂解液；
2)向步骤I)的裂解液中加入核酸提取液和和VPIC RNA，使捕获探针与靶标或内标核酸特异结合后再 与磁珠结合，用洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到副溶血弧菌的核酸(RNA)和 VP IC RNA ；
3)将步骤2)提取的副溶血弧菌的核酸(RNA)和VPIC RNA加入由VP反应液和VP检测液组成的第一阶段反应物中，在60°C下温育10分钟后，再在42°C下温育5分钟，然后加入第二阶段酶反应物SAT酶液，由此开始在42°C下继续温育50分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为3:1 ；
4)根据荧光信号产生的时间和强度参照VP阳性对照、VP阴性对照和VP内标检测结果对待测样品进行定性检测。
[0072]与现有的VP检测相比，本发明具有以下优点:
(I)高特异性、高纯度、低污染:针对VP靶核酸设计的优选捕获探针，可高效、特异性捕获VP的RNA。同时，由于采取封闭式的恒温放大检测系统，整个反应过程中无需打开反应体系，因而避免了扩增子的污染。
[0073](2)快速检测:将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，而且整个过程中没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，扩增检测只需要50分钟。
[0074](3)污染易控:与实时荧光PCR相比，本发明的扩增产物是RNA，RNA在自然界中极易降解，所以污染控制较容易。
[0075](4)能有效区别检测物中的死菌和活菌，检测更准确，更科学，避免假阳性。
[0076](5)设备简单，成本低:与实时荧光定量PCR相比，本发明所用的仪器无需升降温循环，因而设计和生产成本大幅降低。
[0077]综上所述，本发明试剂盒能够检测鲜冻水产品及腌制食品中的VP RNA，具有特异性高、灵敏度高(可达1000CFU/mL)、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)、避免假阳性及快速检测(50分钟完成扩增检测)的特点，将在副溶血弧菌快速检测中发挥重要作用，应用前景广阔。
[0078]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0079]实施例中所用主要原料SAT酶液、阳性对照及内标的体外转录RNA由美国RDBiosciences公司提供，7500型PCR仪为美国ABI公司产品，NTPs, dNTPs等试剂和其他仪器均为常规可商购产品。
[0080]实施例1、用于实时荧光核酸恒温扩增检测副溶血弧菌(VP)的专用引物和探针的设计
本发明选择VP toxR基因中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域(其核苷酸序列如序列表中序列I所示)，根据引物探针设计原理，使用DNA ATAR、DNAman软件和人工设计用于实时荧光核酸恒温扩增检测副溶血弧菌(VP)的专用引物和探针序列，得到如下具体序列:
(1)一条可与如序列表中序列I所示的副溶血弧菌(VP)的靶标核酸(VP RNA)序列特异结合的捕获探针(TCO, Target Capture Oligo),所述捕获探针的核苷酸序列为5’_aucyuccagucucugcgcgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’(Y 为简并喊基，代表 C/T,序列表中序列2)； (2)—对用于在M-MLV反转录酶作用下产生VP靶标核酸(VPRNA)的DNA拷贝的VP检测引物，所述VP检测引物由T7引物和nT7引物组成，Τ7引物序列为5，- aatttaatacgactcactatagggagacagtacgcaaatcggtagta-3，(序列表中序列 3), nT7 引物序列为5’ -gtagtagtacctgaaaaagca _3’(序列表中序列 4)；
(3)—条用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述VP靶标核酸(VP RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的VP检测探针，所述VP检测探针的核苷酸序列为5’-cguccugcugugaauccuuggacg_3’(序列表中序列 5), 5’端用 FAM 突光标记，3’端用 DABCYL突光标记。
[0081](4)为便于进行结果分析，还配合试剂盒中增加的竞争性VP内标(序列7)，设计了竞争性内标检测探针，VP内标与VP靶标核苷酸(VP RNA)拥有相同的引物结合区，两引物之间的核酸序列或排列不同，使其不能与检测探针结合，但能与内标探针结合，所述VP内标可通过VP靶标模板定点突变构建获得，可与捕获探针特异性结合，所述内标检测探针为与VP检测探针序列、突光标记不同，但碱基数一致的探针，所述的内标检测探针的核苷酸序列为5’ -ccagGUAAUUCGGCACGUGGccugg-3’(序列表中序列6), 5’端标记HEX突光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。
[0082]实施例2制备副溶血弧菌VP的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
利用实施例1所提供的专用引物和探针，得到本发明副溶血弧菌VP的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。该试剂盒包含有捕获探针(TC0，Target Capture Oligo)、T7引物、nT7引物、VP检测探针、内标检测探针、内标、M-MLV反转录酶和Τ7 RNA聚合酶等组分。
[0083]其中，捕获探针序列如SEQ ID NO: 2 ；
Τ7引物序列如SEQ ID NO: 3 ；
ηΤ7引物序列如SEQ ID NO: 4 ；
EV检测探针序列如SEQ ID NO: 5 ；
内标检测探针序列如SEQ ID NO: 6 ；
内标序列如SEQ ID NO: 7 ；
所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述Τ7引物、ηΤ7引物和VP检测探针、内标检测探针存在于VP检测液中，所述M-MLV反转录酶和Τ7 RNA聚合酶存在于SAT酶液中，具体来讲，所述试剂盒分为2-30°C储存的A盒(标本处理单元)和-15- _35°C储存的B盒(核酸扩增检测单元)，A盒包括裂解液、核酸提取液和洗涤液，B盒包括VP反应液、VP检测液、SAT酶液、VP阳性对照、VP阴性对照和VP内标，主要成分如下:A盒(标本处理单元)组成为:
裂解液；含硫酸铵((NH4)2SO4)和HEPES ；
核酸提取液:含捕获探针1-50 μ M (优选为5-25 μ Μ)和磁珠50_500mg/L (优选为50-250mg/L)；
洗涤液:主要含lwt% SDS0
[0084]B盒(核酸扩增检测单元)组成为:
VP 反应液:含 dNTP 0.1-1OmM (优选为 0.5_5mM)，NTP l-20mM (优选为 1-lOmM)；
VP检测液:含引物和探针，各引物和探针的浓度在5-lOpmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，VP检测探针浓度优选为5pmol/反应’内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；
SAT酶液:含M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)，T7 RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)；
VP阳性对照；含IO5-1O8拷贝/mL副溶血弧菌(VP) toxR基因的体外转录RNA稀释物；VP阴性对照:不含有副溶血弧菌(VP)靶标核酸(VP RNA)序列或不含有副溶血弧菌的溶液,如生理盐水；
VP 内标:含 IO5-1O8 拷贝 /mL VP IC RNA 稀释物(SEQ ID NO: 7)。
[0085]试剂盒中所包含的所有试剂均可按提示以常规方法制备取得或商业购买得到。
·[0086]具体来讲，每一反应单位中，所述试剂盒各种试剂的具体组配如下:
(1)裂解液:为裂解和保存食品样本中的副溶血弧菌(VP)，含有硫酸铵和HEPES缓冲液的溶液，具体包含 HEPES 25-250mM, (NH4)2SO4 5-50mM ；
(2)核酸提取液:为提取副溶血弧菌(VP)RNA的含有oligo (dT)包被的磁珠和特异结合靶标核酸(VP RNA)的一段RNA序列的溶液，具体包含HEPES 50-400mM, EDTA 40-200mM,LiCl 400-2000mM，捕获探针 1-50 μ M (优选为 5-25 μ M )，磁珠 50_500mg/L (优选为50-250mg/L)；
(3)洗涤液:为含SDS、NaCl 的溶液，具体包含 HEPES 5-50mM, NaCl 50-500Mm, 1% SDSImM, EDTA 1-1OmM ；
(4)VP反应液:为含dNTPs和NTPs扩增所需组份，具体包含Tris 10-50mM, MgCl210-40mM, dNTP 0.1-1OmM (优选为 0.5_5mM)，NTP l-20mM (优选为 1-lOmM)，PVP40 1-10%,KCl 5-40mM ；
(5)VP检测液:将恒温扩增时必需的VP检测引物和VP检测探针溶解在TE溶液(IOmMTris和ImM EDTA的混合液)中配制而成，引物和探针浓度在5-10pmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，VP检测探针浓度优选为5pmol/反应’内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；
(6)SAT酶液:为恒温扩增时必需的多酶组分体系，含M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)、T7 RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)、
2-10mM HEPES ρΗ7.5、10_100 mM N-acetyl-L_cysteine、0.04_0.4 mM zinc acetate、10-100 mM trehalose、40-200 mM Tris-HCl pH 8.0、40_200mM KC1、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1% (v/v) Triton X-100 和 20-50% (v/v) glycerol ；
(7)VP阳性对照；含IO5-1O8拷贝/mL副溶血弧菌(VP) idR基因的体外转录RNA稀释物；
(8)VP阴性对照:不含有副溶血弧菌(VP)靶标核酸(VP RNA)序列或不含有副溶血弧菌的溶液；
(9)VP 内标:含 IO5-1O8 拷贝 /mL VP 内标 RNA。
[0087]VP阳性对照中的体外转录的VP RNA，可以通过多种方法制备所得，其中一种制备方法如下:
(I)用化学合成法合成VP toxR基因中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示)；
(2)将片段克隆到pGEM?-T载体中，构建VP阳性对照质粒；
(3)VP阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5a中，命名为PGEM?_T_VP菌株，贮存于-70。。；
4)从pGEM?-T-VP菌株中提取pGEM?-T-VP质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。
[0088]VP内标中的体外转录的VP IC RNA，可以通过多种方法制备所得，其中一种制备方法如下:
(1)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同VP靶标序列区域(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示)；
(2)将片段克隆到pGEM?-T载体中，构建VP内标质粒；
(3)VP内标质粒转化到大肠杆菌DH5a中，命名为pGEM?_T_VP IC菌株，贮存于_70°C;
(4)从pGEM?-T-VPIC菌株中提取pGEM?_T_VP IC质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA。
[0089]实施例3纯菌灵敏度检测
用本发明试剂盒(组成见实施例2)检测浓度为IO2 CFU/mL、103 CFU/mL、104CFU/mL、IO5 CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL的食品样品中的副溶血弧菌(VP)，另设一个阴性对照。具体方法包括以下步骤:
(I)菌液培养，计数和稀释
取副溶血弧菌标准菌株划线碱性蛋白胨水(APW)平板，37°C培养12h后，比浊法计数，生理盐水稀释定量到107CFU/mL，并用生理盐水10倍倍比稀释到102CFU/mL。
[0090](2)核酸提取
2.1在样品处理管(1.5mL离心管)中加入200 μ I裂解液(含HEPES 35mM, (NH4) 2S0420mM),200yl样品溶液，用裂解液裂解待测样品中的副溶血弧菌(VP)，得到含有副溶血弧菌(VP)核酸的裂解液。
[0091]2.2在样品处理管(1.5mL离心管)中加入100 μ I核酸提取液(含HEPES IOOmM,EDTA 50mM, LiCl 500mM，捕获探针20μΜ，磁珠250mg/L)，加入10 μ I内标溶液，混匀，60°C保温5分钟，室温放置10分钟。
[0092]2.3将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5-10分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入ImL洗涤液(含HEPES 50mM,NaCl IOOmM, I % SDS, EDTA 5mM)振荡均匀后静置5_10分钟，弃液体，保留磁珠，反复2次。
[0093]2.4将样品处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用(此步应清晰可见磁珠)。
[0094](3) SAT核酸扩增检测
3.1向样品处理管中加入40μ I反应检测液(40μ I VP反应液+2.5μ1 VP检测液)洗涤磁珠。VP 反应液具体包含 Tris 30mM, MgCl2 IOmM, dNTP 4mM, NTP 8mM, PVP40 5%,KCl 25mM ；VP检测液中T7引物浓度为5pmol，nT7引物浓度为7.5pmol,VP检测探针浓度为5pmolο
[0095]3.2取振荡混匀的上述反应检测液30 μ I加至洁净微量反应管，用7500型PCR仪(美国ABI公司产品)60°C保温10分钟，42°C保温5分钟；向微量反应管中加入10 μ I已预热至42°C的SAT酶液，1200rpm振荡15秒钟混匀。SAT酶液中含M-MLV反转录酶1200U，T7RNA 聚合酶 1200U/ 反应，IOmM HEPES ρΗ7.5,20 mM N-acetyl-L-cysteine (N-乙酰-L-半胱氨酸)，0.4 mM zinc acetate (乙酸锋)、30 mM trehalose (海藻糖)、100 mM Tris-HClpH 8.0, 200mM KC1,0.1mM EDTA,0.8% (v/v)Triton X-100 和 40% (v/v) glycerol (丙二醇)；
3.3将微量反应管快速转至恒温荧光检测仪器(FAM通道)，42°C反应50分钟，设定每I分钟检测一次荧光，共检测50次。
[0096](4)结果判定
根据PCR扩增结果得到的曲线，设定阀值线，读取dt值，判定结果。
[0097]阈值设定:以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数 (与一般实时荧光PCR实验结果的Ct值类似)。
[0098]阳性结果判定:
Fl通道(FAX通道):dt ( 45的样本为阳性；45 < dt < 50的样本建议重新检测，检测结果Fl通道:dt < 50的样本为阳性。
[0099]阴性结果判定:
Fl通道dt无数值或为50，同时F2通道(VIC通道，ABI仪器只可选VIC通道，但VIC与HEX波长相近):dt≤45，则为阴性。
[0100]质量控制:每次检测均设置阳性对照和阴性对照，且结果应同时满足阳性对照Fl通道:dt < 45 ;阴性对照Fl通道:dt无数值或为50，同时F2通道:dt < 45，否则此次检测结果视为无效。
[0101](5)结果
从图1(F1荧光通道)、图2(F2荧光通道)可看到，本发明试剂盒最低检出限为IO3 CFU/mL，各浓度均可检出内标，表示反应体系没有受抑制影响。
[0102]实施例4 SAT与PCR对活菌死菌的检测比对
本次检测为本发明的另一个应用:试剂盒组成，检测方法及试剂用量同实施例3，具体方法包括如下步骤:
(I)样本处理
取25 g (mL)食品样本，加入225mL碱性蛋白胨水(APW)中进行匀浆；37°C培养12h，取上清分为A、B管(B管为活菌对照组)；将A管置于75度水浴锅中10分钟，并通过显微镜观察显示A管菌体已破裂；然后将加热(A管)与不加热处理的菌液(B管)分别进行10倍梯度稀释10、ΙΟ2、ΙΟ3、104、IO5UO6倍，分别取50ul稀释菌液涂平板(LB)进行过夜培养。第二天，A管的菌液对应的LB平板无菌落，B管的菌液对应的LB平板有菌落，说明加热后的菌(A管)全被灭活，A管为死菌，B管为活菌。
[0103](2)提取、扩增与检测
SAT检测方法同实施例3 ；PCR检测市面上常规检测副溶血弧菌的PCR试剂盒进行提取和扩增检测。
[0104](3)检测结果:
对B管副溶血弧菌各梯度浓度进行检测，SAT方法均可检出KT1到10_6 (图3)浓度，PCR可检出10-1到10-5 (图4)，可见本发明所形成的试剂盒具有较高的灵敏度。
[0105]对A管各梯度浓度进行检测，SAT的Fl通道检测除阳性对照外均为阴性(图5)，同时F2通道(图6)显示各梯度有内标信号，说明SAT反应体系未受抑制，结果可靠；同时A管的PCR检测结果(图7)同B管PCR结果，IO-1到10_5显示均为阳性，表明其不能区分死菌和活菌，这是因为副溶血弧菌的DNA在环境中稳定所致。通过对RNA的检测，可有效区分食品中的副溶血弧菌活菌死菌情况，避免假阳性。
【权利要求】
1.一种副溶血弧菌VP的方法，其特征在于，所述扩增方法包括步骤:在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有扩增副溶血弧菌VP的特异性引物对，所述引物对包括: T7引物:序列如SEQ ID NO: 3所示；和 nT7引物:序列如SEQ ID NO: 4所示。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系还包括副溶血弧菌VP的捕获探针。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系还包括副溶血弧菌VP的检测探针。
4.如权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤:在扩增反应过程之中或之后，检测副溶血弧菌VP的特异性探针发出的荧光信号。
5.一种副溶血弧菌VP的非诊断性检测方法，其特征在于，所述检测方法包括: 用如权利要求1中所述的扩增方法扩增待测样品；和 在扩增反应过程之中或之后，检测副溶血弧菌VP的特异性探针发出的荧光信号。
6.一种副溶血弧菌VP的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: (a)第一容器，以及位于所述容器内的扩增副溶血弧菌的特异性引物对，所述引物对包括: T7引物:序列如SEQ ID NO: 3所示；和 nT7引物:序列如SEQ ID NO: 4所示; 以及使用说明书。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还含有选自下组的一种或多种组分: (b)捕获探针； (C)检测探针； (d)EV内标序列；和/或 (e)内标检测探针。
8. 如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，包括选自下组的一个或多个特征: 所述检测探针包括如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列；和/或 所述的捕获探针包括如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列；和/或 所述的VP内标序列包括如SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列；和/或 所述的内标检测探针包括如SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列。
9.一种扩增副溶血弧菌的特异性引物对，其特征在于，所述引物对包括: T7引物:序列如SEQ ID NO: 3所示；和 nT7引物:序列如SEQ ID NO: 4所示。
10.如权利要求6所述的试剂盒或权利要求9所述的引物对的用途，其特征在于，对鲜冻水产品及腌制食品样品中是否存在副溶血弧菌VP进行定性检测，和/或 对是否存在副溶血弧菌VP活菌进行判定。
【文档编号】C12Q1/04GK103571942SQ201310342094
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年8月7日 优先权日:2012年8月7日
【发明者】张长明, 于明辉, 尹华立, 朱凤, 居金良 申请人:上海仁度生物科技有限公司