利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛MyoDⅠ基因核心启动子的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛MyoDⅠ基因核心启动子的方法，包括以下步骤：构建含关岭牛MyoDⅠ基因启动子全长片段和亚克隆片段的重组载体；对骨骼肌生长相关的细胞进行培养和铺板；配制启动子重组子/脂质体的混合物，对步骤2）获得的细胞进行转染；通过双荧光素酶报告基因对步骤3）获得的转染细胞进行双荧光素酶活性检测。本发明具有灵敏度高、检测速度快、费用低、不需使用放射性同位素等优点，使用的pGL3-Basic报告基因，因其无启动子和增强子，可通过荧光素酶报告基因的表达来检测插入启动子的启动活性，并且比较启动子的强弱，进而初步确定核心启动子区域。
【专利说明】利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛办/基因核心启
动子的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子遗传学领域，尤其是一种利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛MyoD /基因核心启动子的方法。
【背景技术】
[0002]/的全称为myogenic differentiation I，其中文名称为生肌决定因子，是骨骼肌生长发育过程中重要的正调控基因，在肌形成肌肉特异基因转录调控中，MyoD /起着总开关的作用，可以结合到肌细胞生成素(myogenin)、肌酸激酶CK、肌球蛋白、结蛋白等基因启动子区发挥重要调控作用，促进它们的转录激活。MyoD /介导的肌分化机制作为研究细胞分化的最佳模型，已成为当前众多学者研究的焦点，尤为重要。目前，国内外对该基因的表达调控在小鼠、鸡和猪的肌细胞生成机理等方面的相关研究较多，在牛上已有一些研究，包括遗传变异及功能研究等，但主要集中在转录后和翻译水平，/基因转录调控的分子机制尚不清楚。因此，基因启动子的研究具有广阔的研究前景，以期为转基因牛的培育和牛肉品质的提高提供理论依据。生肌决定因子I的主要功能包括:(I)促使静止期的肌卫星细胞向成肌细胞转化。(2)能把许多种类型细胞转化为成肌细胞，并可促进成肌细胞进一步融和、分化为成熟的肌纤维。
[0003]pGL3-Basic是一类常用的报告基因，因其无启动子和增强子，可通过荧光素酶报告基因的表达来检测插入片段的启动活性，并且比较启动子的强弱和骨骼肌特异性，进而初步确定核心启动子区域。
【发明内容】
[0004]技术要求
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛I基因核心启动子的方法，它具有灵敏度高、检测速度快、费用低、不需使用放射性同位素等优点。
[0005]本发明是这样实现的:利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛/基因核心启动子的方法，包括以下步骤:
步骤I)、构建含关岭牛MyoD I基因启动子全长片段和亚克隆片段的重组载体；
步骤2)、对骨骼肌生长相关的细胞进行培养和铺板；
步骤3)、配制启动子重组子/脂质体的混合物，对步骤2)获得的细胞进行转染；
步骤4)、通过双荧光素酶报告基因对步骤3)获得的转染细胞进行双荧光素酶活性检测。
[0006]步骤4)中所述的双荧光素酶报告基因为萤火虫荧光素酶基因。
[0007]所述的双荧光素酶活性检测所采用的工作液是通过promega试剂盒配制获得。
[0008]步骤I)中所采用的引物为8对，引物PO的上游引物的序列为:5 ' -ACCTCCCGACATCATACATT-3 '，引物PO的下游引物的序列为:5 ' -GAAACCCAGCCGCATCTA-3 '；引物Pl的上游引物的序列为:5 ' - ACCTCCCGACATCATACATT-3 '，引物Pl的下游引物的序列为:5 '-GGTTTGGGTTGCTAGACG-3';引物 P2 的上游引物的序列为:5' - GTGGAGTTCCGCTTGTTG-3'，引物P2的下游引物的序列为:5 ' - GGTTTGGGTTGCTAGACG-3 ';引物P3的上游引物的序列为:5 ' - GATATGGAGCTGCTGTCGC-3 '，引物P3的下游引物的序列为:5 ^ - AGCCGCTGGTTTGGGTTGC-3 ';引物P4的上游引物的序列为:5 ^ -GTGGAGTTCCGCTTGTTG-3'，引物 P4 的下游引物的序列为:5' - CTCCCCACCCCTACTTTC-3'；引物P5的上游引物的序列为:5 ' - CTCCCTGATTCGGTAGATC-3 '，引物P5的下游引物的序列为:5 ' - CTCCCCACCCCTACTTTC-3 ';引物P6的上游引物的序列为:5 ' - CTCCCTGCTCTGTTCCTATT-3 '，引物P6的下游引物的序列为:5 ' - AAACTTGCTGCTGTTCTGG-3 ';引物P7的上游引物的序列为:5 '-TTAGGCTACTACGGGATAAA-3 '，引物 P7 的下游引物的序列为:5 ' - CTCCCCACCCCTACTTTC_3' o
[0009]有益效果
(I)本发明提供的方法具有灵敏度高、检测速度快、费用低、不需使用放射性同位素等优点。
[0010](2)本发明使用的pGL3-Basic报告基因，因其无启动子和增强子，可通过荧光素酶报告基因的表达来检测插入启动子的启动活性，并且比较启动子的强弱，进而初步确定核心启动子区域。
【专利附图】
【附图说明】·
[0011]图1为本发明所使用的技术路线；
图2为构建构建重组子pUCm-T-1^c^ I pro载体方法示意图；
图3为克隆的启动子片段；
图4为酶切鉴定重组子pUCm-T-loi? I pro载体图；
图5为构建pGL3-Basic-loj I pro真核表达载体示意图；
图6为酶切鉴定重组子pGL3-1(F0i? 1-pro载体图；
图7启动子转染小鼠C2C12细胞双荧光素酶活性检测图；
图8为最终确定的关岭牛/基因核心启动子区域；
图9、图10为图2的放大图；
图11、图12为图5的放大图。
【具体实施方式】
[0012]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0013]本发明的实施例:利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛/基因核心启动子的方法，包括以下步骤:步骤1，含关岭牛/基因启动子全长片段和亚克隆片段的重组载体的构建:构建重组子T载体方法示意图见图2，克隆的启动子片段见图3，酶切T载体鉴定见图4，构建pGL3-BasiC-MyoD I pro真核表达载体见图5,重组子pGL3-1(rc^ 1-pro载体鉴定见图6。
[0014]步骤1.1，对/基因全长启动子和亚克隆片段进行克隆酶切及纯化；
【权利要求】
1.一种利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛/基因核心启动子的方法，其特征在于:包括以下步骤: 步骤I)、构建含关岭牛MyoD I基因启动子全长片段和亚克隆片段的重组载体； 步骤2)、对骨骼肌生长相关的细胞进行培养和铺板； 步骤3)、配制启动子重组子/脂质体的混合物，对步骤2)获得的细胞进行转染； 步骤4)、通过双荧光素酶报告基因对步骤3)获得的转染细胞进行双荧光素酶活性检测。
2.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛/基因核心启动子的方法，其特征在于:步骤4)中所述的双荧光素酶报告基因为萤火虫荧光素酶基因。
3.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛/基因核心启动子的方法，其特征在于:所述的双荧光素酶活性检测所采用的工作液是通过promega试剂盒配制获得。
4.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛/基因核心启动子的方法，其特征在于:步骤I)中所采用的引物为8对，引物PO的上游引物的序列为:5 ^ -ACCTCCCGACATCATACATT-3 '，引物PO的下游引物的序列为:5 ' -GAAACCCAGCCGCATCTA-3 ,;引物Pl的上游引物的序列为:5 ' - ACCTCCCGACATCATACATT-3 '，引物Pl的下游引物的序列为:5 '-GGTTTGGGTTGCTAGACG-3';引物 P2 的上游引物的序列为:5' - GTGGAGTTCCGCTTGTTG-3'，引物P2的下游引物的序列 为:5 ' - GGTTTGGGTTGCTAGACG-3 ';引物P3的上游引物的序列为:5 ' - GATATGGAGCTGCTGTCGC-3 '，引物P3的下游引物的序列为:5 ^ - AGCCGCTGGTTTGGGTTGC-3 ';引物P4的上游引物的序列为:5 ^ -GTGGAGTTCCGCTTGTTG-3'，引物 P4 的下游引物的序列为:5' - CTCCCCACCCCTACTTTC-3'；引物P5的上游引物的序列为:5 ' - CTCCCTGATTCGGTAGATC-3 '，引物P5的下游引物的序列为:5 ' - CTCCCCACCCCTACTTTC-3 ';引物P6的上游引物的序列为:5 ' - CTCCCTGCTCTGTTCCTATT-3 '，引物P6的下游引物的序列为:5 ' - AAACTTGCTGCTGTTCTGG-3 ';引物P7的上游引物的序列为:5 '-TTAGGCTACTACGGGATAAA-3 '，引物 P7 的下游引物的序列为:5 ' - CTCCCCACCCCTACTTTC_3' ο
【文档编号】C12Q1/68GK103571941SQ201310341205
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年8月7日 优先权日:2013年8月7日
【发明者】许厚强, 李飞, 陈伟, 陈祥, 赵佳福 申请人:贵州大学