一种对柑橘木虱具致病力的蜡蚧菌属真菌新种的制作方法

一种对柑橘木虱具致病力的蜡蚧菌属真菌新种的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种对柑橘木虱具致病力的蜡蚧菌属真菌新种。蜡蚧菌（Lecanicilliumsp.）ZJLSP07，已于2013年6月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC?No.7803。本发明的蜡蚧菌ZJLSP07对柑橘木虱具有致病力，与同属的蜡蚧轮枝菌菌株相比，蜡蚧菌ZJLSP07对柑橘木虱具有更强的作用效果，可被开发为生防菌制剂用于对柑橘木虱的生物防治。与目前防治柑橘木虱的化学药剂相比，具有高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性等特征，具有良好的市场应用前景。
【专利说明】一种对柑橘木虱具致病力的蜡蚧菌属真菌新种
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】，具体涉及一种对柑橘木虱具致病力的蜡蚧菌属(.LecaniciIlium )真菌新种。 【背景技术】
[0002]柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing, HLB)是当前柑橘生产上防治最难、威胁最大的一种毁灭性病害，广泛分布在亚洲、非洲和美洲等多个国家和地区。该病害的猖獗发生和蔓延危害，给人们带来了巨大的经济损失，已成为柑橘产业稳定发展的重大障碍。尽管从发现该病害至今已有百余年的历史，但目前尚缺乏有效的防治药剂和理想的抗病品种，因此主要采取以治虫防病为主的综合防控措施来控制该病害的发生和流行。该病害的病原物为韧皮部杆菌属Liberibacter)细菌,在自然条件下主要通过柑橘木風(.Diaphorina ci tri )传播扩散。柑橘木風除作为唯一自然虫媒传播黄龙病外，还是柑橘、朽1檬、黄皮、九里香、枸杞等芸香科植物新梢期的主要害虫，可直接取食危害新梢嫩叶及产生分泌物诱发煤烟病等。因此，加强对柑橘木虱的防治，无论对于控制柑橘黄龙病的流行还是降低虫体本身对柑橘的危害都具有重要的意义。
[0003]目前对于柑橘木虱的防治多采用化学防治措施，然而化学农药的频繁使用造成了农药残留、环境污染、生物多样性破坏和柑橘木虱产生抗药性等诸多问题，而生物农药以其高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性和原料易得等特性被人们认为是未来化学农药的理想替代药剂。因此，利用生物农药防治柑橘木虱也逐渐引起人们的重视。已有报道对柑橘木風具有致病效果的真菌有檬形被毛孢(Mirsu tella ci tri formi s )、宛氏拟青霉 ipaecilomyces variο ii )、玫烟色拟青霉{Paecilomyces fumosoroseus )、球抱白僵菌iBeauveria bassiana )、虫牙笑顶?包霉(乂crostalagmus aphit/ia?)、黄色键刀菌 QFusariumcuImorum)和腊阶轮枝菌(.LecaniciIlium Iecanii )等。
[0004]腊阶菌属是从先前的Ke_riici77itt? 属的section Prostrata离出来的一个属。最初Gams等根据菌株的培养特征和形态学特征将Verticillium属真菌分为 5 个部分，分另 Il 为 section Verticillium^ section Nigrescen tia > sectionProstrata、section Albo~erecta 及 residual group。 其中 section Verticillium只包括一个菌种 Verticillium tenerum ；section Nigrescentia 包括模式菌种Verticillium nigrescens 及 Verticillium albo_atrum、Verticillium dahliae、Verticillium nubiIum、Verticillium tricorpus、Verticillium theobromae ；sectionProstrata包括18个菌种，模式菌种为Cordyceps mi Ii tar is的无性型，及最常见的菌f中 Verticillium Iecanii 矛口 Verticillium psalliotae ;section Albo—erecta 的模式菌种为VerticiIliumfungicola ;剩余未划入上述部分中的VerticiIlia?属真菌菌种则归入到residual group。之后Zare等和Gams等又根据菌种的形态学特征和核糖体DNA内转录间隔区(ITS)、核糖体大亚基(LSU)、核糖体小亚基(SSU)、β-tubulin等基因序列及菌种的寄主种类，对属真菌重新进行了归类，而尚未重新进行分类的属真菌菌种仍然沿用以前的名字。洛Verticillium sectionVerticillium 中的 Verticillium tenerum (同义 Verticillium Iuteoalbum^ 归入^lJ Acrostalagmus 属中；嘗 Verticillium section Nigrescentia 中的 Verticilliumnigrescens 归入到 Gibellulopsis 属中；嘗 Verticillium section Nigrescentia 中白勺 Verticillium theobromae 归入至Ij M Musicillium 中；M Verticillium sectionNigrescentia 中作为植物病原菌的 Verticillium dahliae、Verticillium 1ngisporum^Verticillium albo-atrum、Verticillium nub Hum 矛口 Verticillium tri corpus 仍保留在 Verticillium 属中，形成狭义上的 Verticillium 属 Verticillium s.str.；将Verticillium section Prostrata 划分成 5 个属，% LecaniciIliumΛSimpliciIliumΛPochonia、Haptoc i I Iium 取 Rot iferophthora，其中 Verticillium section Prostrata一大部分菌种划入到LecaniciIli —属中，LecaniciIli训?属真菌多为侵染昆虫和真菌的菌种，Simplicillium属真菌多为腐生菌和真菌的重寄生菌，Pochonia属真菌多寄生孢囊线虫和黏菌，Haptocillium属真菌的寄主多为自由生活型线虫，Rotiferophthora属真菌多侵染轮虫。之后，随着人们研究的进展，不断有新发现和命名的菌种归入到上述各属中，如Patrik Inderbitzin等将新发现的5种植物病原菌Verticillium isaaci1、Verticillium klebahni1、Verticillium z are gam si an um, Verticillium alfalfae 矛口Verticillium nonalfalfae 归入到 Verticillium 属中；Kenichi Nonaka 等将新发现的 5 f中 M Simplicilliumcylindrosporum^ SimpliciIlium minatense^ Simplicilliumsubtropicum^ SimpliciIlium aogashimaense 矛口 Simplicillium sympodiophorum归入到 Simplicillium 属中；Nampi ah Sukarno 等将新发现的菌种 Lecanicillium3,Τ3,--θ?οοΙο,Λ Lecanicillium kalimantanense, Satoru Kaifuchi 等将新发现的菌种Lecanicillium primulInumj 及 Kope 等将新发现的菌种 LecaniciIlium pissodis,全都归入到LecaniciIli训?属中。目前LecaniciIli训?属共包含22已命名的菌种，分别为 Lecan i c i 11 iumacerosum、Lecanicillium anti I Ianum、Lecanicilliumaphanocladi1、LecaniciIliumaranearum、LecaniciIliumaraneicola、LecaniciIliuma t tenua turn、Lecani ci Ili umdimorphu m、Lecani cilli umfla vi dum、Lecani ci Ili umfungi cola var.fungi cola Λ Lecani ci Ili umfungi cola var.aleophilum、Lecani ci Ili umfusi sporum ΛLecaniciIliumkaliman tanense、LecaniciIliumlecani1、LecaniciIliumlongisporum、Lecanicilliummuscarium、LecaniciIliumnodulosum、Lecanicilliumpissodis、Lecani ci Ili umpri mu I in um、Lecani ci Ili umpsalli o tae、Lecani ci Ili umsaksenae、LecaniciIliumtenuipes、LecaniciIliumwallacei，及 4 个未具体命名的菌种，分别为Lecanicillium sp.X^Lecanicillium sp.!^Lecanicillium sp.^Lecanici I Hum sp.4。
[0005]目前已有研究报道的对柑橘木虱具有致病力的蜡蚧菌属真菌有蜡蚧轮枝菌{Lecanicillium和刀抱轮枝菌psalliotae)。对于柑橘木風生防菌的研究多处于实验室阶段，在农业生产中利用生防菌制剂成功防治柑橘木虱的实例尚未有见报道。因此，对柑橘木虱虫生真菌进行进一步分离筛选和生防潜能深入研究，对于促进将来柑橘木虱生物防治的顺利开展具有重要的意义。
[0006]
【发明内容】

[0007]本发明的目的在于提供一种对柑橘木虱具致病力的蜡蚧菌属真菌新种，该菌种具有被开发为生物农药的潜能，具有良好的市场应用前景。
[0008]一种对柑橘木虱具致病力的蜡蚧菌属真菌新种，其特征在于该真菌菌株为蜡蚧菌Uecanicilliuni sp.) ZJLSP07,已于2013年6月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC N0.7803。
[0009]蜡蚧菌Z几SP07是从浙江省台州市黄岩区的橘园中采集的柑橘木虱虫体上分离获得的，该菌株的形态特征、培养特性、ITS1-5.8S rDNA-1TS2 (核糖体DNA内转录间隔区
1-5.8S rDNA-核糖体DNA内转录间隔区2)序列和菌种分类结果如下:
1、菌株ZJLSP07的形态特征:如图1所示，菌株ZJLSP07在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上生长良好，25°C下暗培养7 d其菌落直径可达2.6-2.7 cm，菌落呈圆形，菌落正面为白色丝绒状，背面呈浅黄色，具放射状皱褶，无渗出液和色素产生。如图2所示，在光学显微镜下观察其菌丝透明，有分隔，宽为1.2-2.2 μ m ;瓶梗着生于匍匐状气生菌丝上，单生或对生，少数为轮生，瓶梗从基部向顶端逐渐变细，直立，大小为12.5-28X0.5-1.9 μ m ;分生孢子单生于瓶梗顶端，壁光滑，大小不一，呈椭圆形、纺锤形或镰刀形，其中大分生孢子大小为
5.5-8.5X1.5-2.5 μ m，小分生孢子大小为3.0-4.5X 1.0-2.0 μ m;未见厚垣孢子。
[0010]2、菌株ZJLSP07的生物学特性:菌株ZJLSP07在马铃薯葡萄糖琼脂培养基、马铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基、沙氏葡萄糖酵母浸膏琼脂(SDAY)培养基、察氏(CDA)培养基、麦芽浸膏琼脂(MEA)培养基、LCA培养基和沙氏葡萄糖琼脂(SDA)培养基上均生长良好，其中在LCA和PDA等培养基上生长 较快，而在PSA培养基上生长相对较慢。在LCA培养基上菌丝相对稀疏，菌落背面无皱褶，而在其他培养基上菌丝较为致密，菌落背面具不同程度的放射状皱褶。菌株ZJLSP07在10°C~35°C的温度条件下均可生长，其中25°C~30°C为其适宜生长温度，10°C条件下生长极为缓慢，5°C和40°C条件下不生长。光照时间长短对菌株ZJLSP07的生长影响不显著。沙氏葡萄糖酵母浸膏(SDY)液体培养基和沙氏葡萄糖(SD)液体培养基为菌株ZJLSP07最佳产孢培养基。菌株ZJLSP07的分生孢子在10°C~35°C的温度条件下均能萌发，其中25°C~30°C为其孢子萌发的适宜温度。
[0011]3、菌株ZJLSP07的基因序列特征:测序所得菌株ZJLSP07的18S rDNA部分序列如 SEQ ID NO:1 所示，ITS1-5.8S rDNA_ITS2 完整序列如 SEQ ID N0:2 所示，β -tubulin基因部分序列如SEQ ID N0:3所示。利用NCBI Blast进行比对分析发现，菌株ZJLSP07的18S rDNA部分序列与GenBank中多个不同菌种对应序列的相似性达99%~100% ；在GenBank中与其ITS1-5.8S rDNA_ITS2序列相似性较高的真菌为含蜡蚧菌属在内的肉座菌目(Hypocreales)真菌，但在序列覆盖率100%的条件下，菌株ZJLSP07与GenBank中已确定种名的真菌的序列相似性最高仅为94% ;而其β -tubulin基因的部分DNA序列与GenBank中菌种对应序列的相似性最高仅为87%，该基因的编码区序列(⑶S)与GenBank中菌种的相应序列的相似性最高为95%。利用EMBOSS Needle在线工具对菌株ZJLSP07的基因序列与蜡蚧菌属各菌种的对应序列进行比对，结果显示菌株Z几SP07与蜡蚧菌属真菌具有较高的同源性，其18S rDNA部分序列的相似性在97.8%和98.7%之间；而其ITS1-5.8S rDNA-1TS2完整序列与蜡蚧菌属真菌的对应序列相似性最高仅为93.9%。系统发育分析显示(如图3)，菌株ZJLSP07与所有的蜡蚧菌属真菌聚成一个大的分支，且其与Lecani ci Ili umkaliman tanense 和 Lecanicilliumwallacei 具有最近的亲缘关系，但在置信度95%下，菌株ZJLSP07与这两种菌又归属于两个不同的小的分支中。菌株ZJLSP07与蜡蚧菌属真菌已知的β -tubulin基因的DNA序列相似性最高为84.0%，编码区序列相似性最高为93.8%。
[0012]参考相关文献中关于蜡蚧菌属及属内各菌种的详细描述，结合以上对于菌株ZJLSP07的形态特征、生物学特性及寄主种类的研究结果，明确菌株ZJLSP07具备蜡蚧菌属真菌的典型特征，因此将其鉴定为肉座菌目虫草菌科(Cordycipitaceae)腊阶菌属的真菌，但其与该属中已知种的特征又存在差异。对菌株ZJLSP07的ITS1-5.8S rDNA_ITS2序列分析结果亦表明，菌株ZJLSP07与蜡蚧菌属真菌具有较高的同源性，在系统发育树中与该属的所有菌种聚为一个分支，进一步表明菌株ZJLSP07为蜡蚧菌属真菌。但菌株ZJLSP07与蜡蚧菌属中菌种的ITS1-5.8S rDNA_ITS2序列相似性最高仅为93.9%，远低于97%这一真菌种间序列相似性的阈值。在系统发育树上，菌株ZJLSP07与其亲缘关系最近的 LecaniciIliumkaliman tanense 和 LecaniciIliumwallacei 也分处于两个不同的小的分支中。且其β-tubulin基因的DNA序列与GenBank中已知菌种具有较低的相似性。综合以上研究和分析结果，我们确定菌株ZJLSP07为肉座菌目虫草菌科蜡蚧菌属真菌的一个新种，将其命名为蜡蚧菌ZJLSP07。
[0013]进一步的，所述的蜡蚧菌属真菌新种，其特征在于制备用于防治柑橘木虱的生物药剂。
[0014]蜡蚧菌ZJLSP07在制备用于防治柑橘木虱的生物农药中的应用，蜡蚧菌ZJLSP07的分生孢子悬浮液对柑橘木虱具有致病力，接种后第3 d，蜡蚧菌Z几SP07对柑橘木虱的LC5。为 5.25 X IO9 spores/mL,腊阶菌 ZJLSP07 浓度为 LOXlO8 spores/mL 抱子悬浮液对柑橘木虱的LT50为3.25 d。温室条件下以浓度为1.0X108 spores/mL的蜡蚧菌ZJLSP07的分生孢子悬浮液处理柑橘木虱，在第9 d其校正死亡率可达100%。
[0015]
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为:
(1)本发明所提供的蜡蚧菌Z几SP07为蜡蚧菌属真菌的一个新种，国内外无相关的研究报道；
(2)本发明提供的蜡蚧菌Z几SP07是从浙江省台州市黄岩区柑橘园中被侵染的柑橘木虱虫体上分离获得的，经测定其对柑橘木虱具有致病力；
(3)同等条件下，本发明所提供的蜡蚧菌Z几SP07较与之同属的蜡蚧轮枝菌菌株对柑橘木虱具有更强的作用效果，同时间内对柑橘木虱的致死率更高；
(4)本发明所提供的蜡蚧菌Z几SP07是一种昆虫病原真菌，其分生孢子悬浮液可直接作用于柑橘木虱，较目前防治柑橘木虱的化学药剂相比，具有高效、低毒、低残留、无污染和不易产生抗药性的特征；
(5)蜡蚧菌ZJLSP07培养快，产孢量大，孢子萌发率高，易于制备。
[0016]因此蜡蚧菌ZJLSP07在被开发为生防菌制剂用于对柑橘木虱的生物防治上，具有良好的市场应用前景。
[0017]【专利附图】

【附图说明】
[0018]图1为蜡蚧菌ZJLSP07在PDA培养基上培养7 d后的菌落特征。
[0019]图2为光学显微镜下观察的蜡蚧菌ZJLSP07的菌丝、分生孢子梗和分生孢子的形态特征。
[0020]图3为基于ITS1-5.8S rDNA_ITS2基因序列构建的蜡蚧菌ZJLSP07的系统发育树，图中“Z.”为蜡蚧菌属名“LecimicUliumv的缩写，“V.”为属名“Verticillium”的缩写，“义”为属名“SimpliciIlium”的缩写，“H.”为属名“HaptociIlium”的缩写，“/?.”为属名“Rotiferophthora” 的缩写，“P.” 为属名 “Pochonia” 的缩写，“M.” 为属名 “MusiciIlium”的缩写，”为戳名“Acrostalagmis”的缩写，”为属名“Gibellulopsis”的缩写，括号中的号码为对应菌种在GenBank中的登录号。
[0021]图4为体视显微镜下观察的蜡蚧菌ZJLSP07对柑橘木虱的侵染情况。
[0022]图5为扫描电子显微镜下观察的蜡蚧菌ZJLSP07的菌丝体在柑橘木虱体表的覆盖情况及新形成的分生孢子。
[0023]图6为光学显微镜下观察的蜡蚧菌ZJLSP07的菌丝在柑橘木虱体腔内的分布。【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
[0025]一种对柑橘木虱具致病力的蜡蚧菌属真菌新种，菌种命名为ZJLSP07，分类命名:蜡蚧菌(Zeca/?ici77i應sp.)，其保藏编号:CGMCC N0.7803，保藏日期:2013年6月24日，保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微 生物研究所。
[0026]实施例1:昆虫病原菌的分离和筛选
1、病菌的分离纯化:从浙江省台州市黄岩区柑橘园内采集柑橘木虱虫尸，于实验室超净工作台中进行如下操作:先将虫体放于70%乙醇中浸泡30 S，再经过0.1%升汞浸泡3min，最后用无菌水冲洗3次。用无菌滤纸吸干虫体上的水分，然后将其放于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(配制方法为:称取200 g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000 mL煮沸半个小时，纱布过滤，再加20 g葡萄糖和20 g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装至锥形瓶或玻璃试管中，121°C，高压灭菌20 min)中。将培养皿置于微生物培养箱中25°C恒温培养，至虫体周围长出菌丝后，挑取菌丝转至新的PDA平板上培养(重复此操作2~3次)，持续培养10 d左右，待菌落上产生分生孢子，用无菌水洗脱分生孢子制备成分生孢子悬浮液，然后参照《植病研究方法》中所述的稀释纯化法(方中达.植病研究方法(第三版)[M].北京:中国农业出版社，1998: 122-140)对病菌进行单孢分离。最后将分离纯化获得的菌株保存于PDA斜面培养基中，培养5 d左右，置于4 °C冰箱保存。
[0027]2、致病菌的筛选:将上述分离纯化保存的菌株接种到PDA平板上，于25°C恒温培养10 d左右后，以无菌水洗脱菌落上产生的分生孢子，制备获得分生孢子悬浮液，向其中加入适量的吐温-80至终浓度为0.1%。取于温室饲养的30头健康柑橘木虱成虫(本说明书实施例均以柑橘木虱成虫为测试对象)浸没于含0.1%吐温-80的分生孢子悬浮液中1(T15 s，挑取处理后仍能自由活动的柑橘木虱置于培养皿中的九里香叶片上(培养皿底部铺有2层用无菌水湿润过的滤纸，其上放置一个带10个左右叶片的九里香嫩枝，枝条底端以无菌水湿润的脱脂棉包裹)，然后放于25°c光照培养箱中(每天14 h光照/10 h黑暗，湿度95%以上)培养，同时设立含0.1%吐温-80的无菌水处理柑橘木虱为对照，培养7 d后观察病菌对柑橘木虱的侵染和致死情况。之后再按步骤I中的方法从处理后的柑橘木虱虫体中分离病菌，比较再分尚的病菌与初始接种的病菌的形态特征和培养特征。
[0028]通过以上操作，筛选出符合科赫氏法则的对柑橘木虱具致病性的菌株，排除从柑橘木虱虫体上分离到的腐生菌等非致病菌。通过筛选，获得I株对柑橘木虱具有致病力的菌株，将其命名ZJLSP07。
[0029]3、菌株的复壮:制备上述筛选到的对柑橘木虱具致病力的菌株ZJLSP07的分生孢子悬浮液，接种到健康柑橘木虱虫体上，然后再从发病的柑橘木虱虫体上分离纯化病菌，具体操作方法同上。最后获得分离纯化的菌株ZJLSP07。
[0030]实施例2:菌株ZJLSP07的鉴定
1、菌株ZJLSP07的形态特征:将上述分离纯化的菌株ZJLSP07接种到PDA培养基平板中央，置于25°C恒温培养，每天观察菌落生长情况并记录菌落颜色和形态。将菌株ZJLSP07接种到另一 PDA培养基平板中央，同时将灭菌后的盖玻片(I cmXl cm)斜插入距接种点约I cm左右处的培养基内，置于25 1:恒温培养7 d左右待菌丝爬到盖玻片上后，取出盖玻片置于光学显微镜下观察菌株ZJLSP07的菌丝和孢子形态。
[0031]图1是菌株ZJLSP07在PDA培养基上25 1:恒温培养7 d后的形态特征，可见菌株ZJLSP07菌落呈圆形，菌落正面为白色丝绒状，菌落背面呈浅黄色，具放射状皱褶，无渗出液和色素产生。在光学显微镜下观察菌株ZJLSP07的形态特征如图2所示，可见其菌丝透明，有分隔，宽为1.2-2.2 μ m;瓶梗着生于匍匐状气生菌丝上，单生或对生，少数为轮生，瓶梗从基部向顶端逐渐变细，直立，大小为12.5-28X0.5-1.9 um ;分生孢子单生于瓶梗顶端，壁光滑，大小不一，呈椭圆形、纺锤形或镰刀形，其中大分生孢子大小为
5.5-8.5X1.5-2.5 μ m，小分生孢子大小为3.0-4.5X 1.0-2.0 μπι;未见厚垣孢子。参考相关文献(Zare R, et al.A revision of Verticillium sect.Prostrata.1I1.Generic classification.Nova Hedwigia.2001， 72:329-337; Zare R， et al.Arevision of Verticillium section Prostrata.1V.The genera Lecanicillium andSimpliciIlium gen nov.Nova Hedwigia, 2001，73:1 - 50; Kope H H，et al.A newspecies of Lecanicillium isolated from the white pine weevil, Pissodesstrobi.Mycotaxonj 2005， 94:331 - 340; Zare R，et al.A revision of the Verticilliumfungi cola species complex and its affinity with the genus Lecanicillium.Mycological Research, 2008，112:811-824; Sukarno H et al.LecaniciIlium andVerticillium species from Indonesia and Japan including three new species.Mycosciencej 2009， 50:369—379; Kaifuchi S， et al.Lecanicillium primulinum, anew hyphomycete (Cordycipitaceae) from soils in the Okinawa’s main island andthe Bonin Islands, Japan.Mycosciencej 2013，54:291-296.)关于錯阶菌属及属内各种的描述，结合菌株ZJLSP07的形态学特征和侵染柑橘木虱的特性，明确菌株ZJLSP07具备蜡蚧菌属真菌的典型特征，因此将其鉴定为肉座菌目虫草菌科蜡蚧菌属的真菌，但其与该属已知菌种的形态特征又存在差别。[0032]2、菌株ZJLSP07的序列分析:将菌株ZJLSP07接种至PDA培养基平板，置于25 °C恒温培养10 d左右，以无菌药匙刮取PDA平板上生长的真菌菌丝于无菌研钵中，加入液氮研磨至粉末状，采用改良的CTAB法提取菌株ZJLSP07的总DNA。以纯化的DNA为模板，用真菌通用引物NSl (5 ' -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3 ')和NS2(5 ' -GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3 ')扩增菌株 ZJLSP07 的 18S rDNA,利用真菌通用弓丨物ITS5 (5' -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')和 ITS4(5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')扩增菌株ZJLSP07的ITS1-5.8S rDNA_ITS2，利用真菌通用引物Bt2a(5' -GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3')和 Bt2b(5' -ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3')扩±曾菌株ZJLSP07 的 β-tubulin基因。PCR反应体系为:10XBuffer 2.5 yL,dNTPs 2 μ L,上下游引物(10 ymol/L>^1.5 μ L，Taq DNA聚合酶0.2 yL，DNA模板I yL，无菌水补足至总体积 25 μ L。反应条件为:94°C 5 min ；94°C I min,55°C I min,72°C I min，35 个循环；最后72°C延伸10 min JCTAB法提取DNA等具体操作方法参考:鹿连明等.柑橘黄龙病菌核糖体蛋白基因的多态性及系统发育分析.浙江大学学报，2011，37(2): 125-132)。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶回收试剂盒回收目的条带后送交公司测序。将所测得序列整理后，利用NCBI Blast在线工具进行比对，分析其与与GenBank中菌种的对应序列的相似性；选取GenBank中登录的蜡蚧菌属各菌种的模式菌株或代表菌株的序列，利用EMBOSS Needle在线工具将其与菌株ZJLSP07的序列进行比对，分析其相似性；选取GenBank中登录的腊阶菌属及先前分类为KeriiciWiw?属的各菌种的模式菌株或代表菌株的ITS1-5.8S rDNA-1TS2序列，与菌株ZJLSP07的相应序列，利用Clustal X进行多重比对后，使用MEGA5.05软件，通过Neighbor joining方法构建系统发育树，在构建系统发育树时进行自举检验,重复抽样的次数为1000。 [0033]测序所得菌株ZJLSP07的18S rDNA部分序列如SEQ ID NO:1所示，ITS1-5.8SrDNA-1TS2完整序列如SEQ ID NO:2所示，β-tubulin基因部分序列如SEQ ID N0:3所示。利用NCBI Blast进行比对分析发现，菌株ZJLSP07的18S rDNA部分序列与GenBank中多个不同菌种对应序列的相似性达99%~100% ;与其ITS1-5.8S rDNA_ITS2序列相似性较高的真菌为含蜡蚧菌属在内的肉座菌目真菌，其中相似性最高的3个菌株为肉座菌目真菌，但作者只将其归类到目或科，未对其进一步分类到属和种，且相关文献中也未有关于该菌株的形态描述。在覆盖率100%的条件下，菌株ZJLSP07与GenBank中已确定种名的真菌的ITS1-5.8S rDNA-1TS2序列相似性最高仅为94% ;而其β -tubulin基因的部分DNA序列与GenBank中菌种对应序列的相似性最高仅为87%，该基因的编码区序列(⑶S)与GenBank中菌种的相应序列的相似性最高为95%。利用EMBOSS Needle在线工具对菌株ZJLSP07的基因序列与蜡蚧菌属各菌种的对应序列进行比对，结果详见表1和表2，可见菌株Z几SP07与蜡蚧菌属各菌种的18S rDNA序列具有较高的相似性；而其ITS1-5.8S rDNA_ITS2完整序列与蜡蚧菌属真菌的对应序列相似性最高仅为93.9% ;其β -tubulin基因的DNA序列(含内含子)与GenBank中已登录的蜡蚧菌属真菌的相似性最高仅为84.0%，其编码区序列的相似性最高仅为93.8%。在基于ITS1-5.8S rDNA_ITS2构建的系统发育树中(如图3)，菌株ZJLSP07与该属的所有菌种聚为一个分支，支持菌株ZJLSP07为蜡蚧菌属真菌的结论，在置信度95%下，菌株ZJLSPO 7与其亲缘关系最近的Lecanici 11 iumkal imantanense和LecaniciIliumwallacei又分处于两个不同的小的分支中，表明菌株ZJLSP07又有别于腊蚧菌属已知菌种。
[0034].表1菌铢ZJLSKT与--|重属已知科的I &S.DNA和ITSl^SS ,DKA4TS2 ?序？姻瞧.;.職.K
【权利要求】
1.一种对柑橘木虱具致病力的蜡蚧菌属真菌新种，其特征在于该真菌菌株为蜡蚧菌Uecanicillliuni sp.)ZJLSP07，已于2013年6月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC N0.7803。
2.如权利要求1所述的蜡蚧菌属真菌新种，其特征在于制备用于防治柑橘木虱的生物药剂。
【文档编号】C12R1/645GK103468579SQ201310341306
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月7日 优先权日:2013年8月7日
【发明者】鹿连明, 陈国庆, 杜丹超, 蒲占湑, 胡秀荣 申请人:浙江省柑桔研究所