利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法
【专利摘要】发明提供了利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，将重组人第七凝血因子的cDNA导入或整合至家兔的染色体基因中，获得的转基因兔在乳腺反应器内表达重组人第七凝血因子蛋白。转基因兔在乳腺反应器具有较高的重组人第七凝血因子蛋白表达水平、并且蛋白活性好，进而降低生产成本。
【专利说明】利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于非人哺乳动物制备重组蛋白药物领域，具体涉及利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法。
【背景技术】
[0002]血友病是人类最常见的一种出血性疾病，具有终身性，反复性和致命性，约每5000-10000个男性中就有一个是血友病患者。血友病是由于血液中某些功能性凝血因子的缺失而造成的，其最有效的治疗方法是直接注射凝血因子进行治疗。现在最常见的治疗用凝血因子为第八、九凝血因子，然而，经过频繁的外源性凝血因子八、九的治疗后，病人体内产生了对这些凝血因子的抗性，或产生了中和性的抗体，从而增加对凝血因子治疗的风险，导致病人的关节变形，肌肉萎缩，假瘤和过早死亡。
[0003]第七凝血因子rhF VII是治疗因第八，第九凝血因子rhF珊、rhF IX产生抗性的遗传性血友病患者的首选替代药物。它也可广泛用于治疗创伤性出血，如车祸创伤、手术性出血、颅内出血，如脑溢血等常见的血液疾病，其临床研究显示出强大的潜力。目前市场上的第七凝血因子的重组蛋白产品使用仓鼠幼体肾脏细胞(CHO)的培养系统进行蛋白表达，蛋白表达水平低，导致生产成本极高。有鉴于此，`有必要提供一种高效制备重组人第七凝血因子的方法。
【发明内容】
[0004]针对上述问题，本发明提供了利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其具有较高的蛋白表达水平，进而降低生产成本。
[0005]其技术方案是这样的，利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于:将重组人第七凝血因子的cDNA导入或整合至家兔的染色体基因中，获得的转基因兔在乳腺反应器内表达重组人第七凝血因子；其包括以下步骤:⑴将外接信号基因的重组人第七凝血因子的cDNA (rhF YD cDNA)插入表达载体中形成第七凝血因子的乳腺表达载体(pBCl- rhFVD,所述表达载体包括调控元件；(2)将乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因中，获得转基因兔；⑶获得的转基因兔的当代或者后代母兔在泌乳期的乳汁中产生重组人第七凝血因子。
[0006]其进一步特征在于:
所述表达载体为pBCl质粒载体；
所述调控元件包括鸡β球蛋白绝缘子，山羊酪蛋白启动子，TATA盒，β-酪蛋白外显子1，酪蛋白内含子1，酪蛋白外显子2，β-酪蛋白外显子7，8，9，β-酪蛋白内含子7，8，β-酪蛋白基因组片段；
所述重组人第七凝血因子的cDNA在限制性内切酶Xho I多克隆位点插入pBCl质粒载体，所述限制性内切酶Xho I多克隆位点位于酪蛋白外显子2和β-酪蛋白外显子7，8，9之间；其更进一步特征在于:
将乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因之前，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分，形成乳腺表达构件，所述乳腺表达构件包括所述调控元件和rhF W cDNA ；
步骤⑵中将乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因并获得转基因兔的具体操作为:首先，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分，形成所述乳腺表达构件；其次，将所述乳腺表达构件通过显微注射直接注入家兔受精卵中；然后，将家兔受精卵放入FBS M199培养液、并在38.5°C>5% CO2的培养箱中培养；最后，将家兔胚胎移植到受体家兔的输卵管中，经过妊娠，获得转基因兔；
步骤⑵中将乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因并获得转基因兔的具体操作为:首先，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分，形成所述乳腺表达构件；其次，将所述乳腺表达构件转染至家兔供体细胞中，然后，将经过乳腺表达构件转染的阳性细胞核通过显微操作移到去除染色体遗传物质的卵母细胞的细胞质中，构成克隆胚胎；最后，将发育的克隆胚胎进行胚胎移植，到同步发情的受体兔中妊娠，获得转基因兔；所述重组人第七凝血因子cDNA为人全序列第七凝血因子cDNA ；
所述外接信号基因为β -酪蛋白信号肽和hF VII原有的分泌信号肽；
所述泌乳期包括人工诱导泌乳期和自然分泌的泌乳期；
所述泌乳期包括泌乳前期、泌乳中期和泌乳后期。
[0007]采用本发明的方法后，其有益效果在于:家兔作为转基因药物生产的载体，其优点是可以方便地进行GMP工厂的生产，转基因兔能够在高度清洁(SPF级)的环境中培育，具有培育周期短，效益好，安全性`强，成本低等优势，同时，转基因兔乳汁中第七凝血因子蛋白表达量高、活性好，使得使第七凝血因子的价格降低30-50%，可实现该产品的国产化；pBCl质粒载体更加适用于构建乳腺表达载体；调控元件的设置能实现rhF W cDNA在转基因兔体内表达，并优化表达效果；外接的β_酪蛋白信号肽能使rhF YD cDNA选择性的在乳汁中表达；乳腺表达载体在显微注射直接注入家兔受精卵之前，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分，可消除细菌DNA对rhF W cDNA表达的干扰；泌乳期包括人工诱导泌乳期和自然分泌的泌乳期，同时，泌乳期包括泌乳前期、泌乳中期和泌乳后期，转基因家兔的整个泌乳期阶段都具有分泌rhF VII的能力，蛋白表达量高，并且通过对泌乳期的人工诱导以及自然选择，能进一步提高转基因兔的rhF VII蛋白的表达量；采用显微注射乳腺表达构建进入家兔受精卵的方式获得转基因兔，具有较高的转基因率。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1为人重组第七凝血因子rhF YD cDNA基因的结构图；其中，引物pBClhF YD-f/pBClhF VD -r 和 pBClhF W -f2/pBClhF W ~r, S 为外接信号基因。
[0009]图2 PCR方法扩增人重组第七凝血因子rhF W cDNA产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中，M:1 kb DNA ladder, rhF W cDNA 为 1.4kb。
[0010]图3为人重组第七凝血因子乳腺表达载体pBCl-rhF νπ的基因结构图；其中，鸡β球蛋白绝缘子(Chicken beta-globin insulator),山羊β -酪蛋白启动子(Goatbeta-casein promoter), TATA 盒(TATA box), β-酪蛋白外显子 I (beta-casein exonI)，β_ 酪蛋白内含子 I (beta-casein intron I), 酪蛋白外显子 2 (beta-caseinexon 2),重组人第七凝血因子cDNA (hF W ss), β _酪蛋白外显子7,8,9 (beta-caseinexon 7,8,9), β-酪蛋白内含子7,8 (beta-casein intron 7,8), β-酪蛋白基因组片段(beta-casein -genomic fragment),质粒DNA的细菌起始片段(EcolEl),氨节抗性基因启动子Amp prom,氨节抗性基因AmpR, SalI> Not 1、XhoI为酶切位点。
[0011]图4为人重组第七凝血因子hFVD cDNA感染Zero Blunt TOPO细菌的阳性克隆筛选。
[0012]图5为人重组第七凝血因子乳腺表达载体pBCl-rhF YD转化大肠杆菌DH5 α的阳性克隆筛选。
[0013]图6为pBCl-rhF YD表达载体酶切片段的电泳检测结果。
[0014]图7为pBCl-rhF YD基因构件转染乳腺上皮细胞MCF W的RT-PCR检测结果；其中，+RT表示有反转录酶反应后(RT)的PCR反应，-RT表示没有反转录酶反应后(RT)的PCR反应，作为RT的对照组。313 bp的RT-PCR的产物表明扩增的DNA是从mRNA中反转录成cDNA产生的，即pBCl-rhF YD的mRNA表达。
[0015]图8为乳腺上皮细胞MCF VII中第七凝血因子的Western blot检测结果；其中，Day3 Non-transfected control为经过3天培养的未转染pBCl-rhF VII基因的阴性乳腺上皮细胞MCF VII的蛋白检测泳道，Day 3 transfected medium经过3天培养的转染pBCl-rhF W基因的阳性乳腺上皮细胞MCF VII的蛋白检测泳道。
[0016]图9为显微操作-转基因兔卵基因注射。
[0017]图10为七个转基因兔的兔耳组织DNA的Southern blot检测结果；其中，cDNA是pBCl-rhF YD阳性对照，Α449是正常兔阴性对照，H2O是水阴性对照，1-7是检测的7个转基因阳性兔的DNA。
[0018]图1lA为转基因兔的兔奶中重组人第七凝血因子蛋白的Western Blot检测结果；其中，一抗:小鼠抗人F VL 二抗:羊抗鼠。
[0019]图1lB为图11 A的对照实验检测结果；其中，单抗:羊抗鼠。
【具体实施方式】
[0020]实施例1
⑴第七凝血因子乳腺表达载体的制备:
a、第七凝血因子rhF W cDNA扩增:重组第七凝血因子rhF W cDNA结构如图1所示，包括轻链(light chain)和重链(heavy chain),轻链的端部外接有信号肽S,信号肽S包括第七凝血因子hF VII原有的分泌信号肽(19个氨基酸多肽)与β -酪蛋白信号肽(19个氨基酸多肽)，同时，rhF VII cDNA外接bGH ployA (图中未示出)，bGH ployA,可增加蛋白质翻译水平，优化表达效果。从人cDNA文库中扩增出hFVD的片段，准备两组引物，一组是卩8(:11^'/114^^(:11^'/11-1'，另一组是口8(:11^'/1142^^(:11^'/11-1.。图1 所示箭头为 PCR 引物的扩增方向，从pBClhF W -f/pBClhF W _r扩增的片段，包括hF VII原有的分泌信号肽(19个氨基酸多肽)与β -酪蛋白信号肽(19个氨基酸多肽)，从pBClhF W -f2/pBClhF W _r的扩增片段包含有hF VII原有的分泌信号肽(19个氨基酸多肽)。
[0021]引物的碱基序列为:
pBClhF VI1-f:aactcgagatggtgatgaaggtcctcatccttgcctgtctggtggctctggccattgcaagagagatggtctcccaggccct
pBClhF YD -f2:aactcgaggccgccaccatggtgatggtctcccaggccct
pBClhF YD ~r:aactcgagctagggaaatggggctcgcaggagga
引物 pBClhF W -f/pBClhF VD _r 和 pBClhF W -f2/pBClhF W _r 是根据 pBCl 和 hF VD核苷酸序列设计并人工合成的。
[0022]使用引物pBClhF W -f/pBClhF W _r 经过 PCR 可以扩增出 L 4kb 的 rhF W cDNA,如图 2 所示，M 为 I kb DNA ladder (I kb DNA 阶梯对照，来源:NEB, Cat.N3232S)。
[0023]将人工合成的hFVD 00嫩的1.4 kb的片段感染到Zero Blunt TOPO细菌的感受态细胞中(来源Invitrogen，Cat:K2800 20)，将细菌克隆抽提质粒DNA，并电泳测定，测得结果如图4所示，其中的克隆#17，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28为ZeroBlunt TOPO vector (3.5kb)的部分，为阴性细菌克隆；#1，14，15，16，18，具备 ZeroBlunt TOPO vector + 插入的rhFVII 片段(3.5 kb +1.4kb = 4.9kb)，为阳性细菌克隆。
[0024]b、pBCl-rhF YD乳腺表达载体的制备、扩增及筛选。
[0025]pBCl-rhF YD表达载体的结构如图3所示，pBCl质粒(来源，Invitrogen商用质粒)连接鸡β球蛋白绝缘子、山羊酪蛋白启动子、TATA盒、β-酪蛋白外显子1、β-酪蛋白内含子1、β_酪蛋白外显子2，在质粒载体的限制性内切酶Xho I多克隆位点插入外接信号基因的rhF YD cDNA，再连接-酪蛋白外显子7、8、9，β -酪蛋白内含子7、8，在:T端加载β-酪蛋白基因组片段，形成第七凝血因子的乳腺表达载体pBCl- rhFVII，基因序列长23020 bp。pBCl质粒DNA还包含细菌(EolEl)起始片段，氨苄抗性基因AmpR启动子以及氨苄抗性基因AmpR。
[0026]其中，鸡β球蛋白绝`缘子，山羊酪蛋白启动子，TATA盒，β-酪蛋白外显子1，β-酪蛋白内含子1，酪蛋白外显子2，β-酪蛋白外显子7、8、9，β-酪蛋白内含子7、8，酪蛋白基因组片段为乳腺表达构件的调控元件，实现rhF YD cDNA在家兔体内表达，并优化表达效果。
[0027]将上述步骤a中含rhF YD cDNA的克隆#14和pBCl经过Xho I酶切后，进行酶连接，在PBCl质粒载体的限制性内切酶Xho I多克隆位点插入rhF YD cDNA,进而形成pBCl-rhF YD乳腺表达载体；其中，克隆克隆#14酶切后释放1.4kb片段，即rhF W cDNA。
[0028]使用M13 正向引物(Ml3 Forward (-20))和 M13 反向引物(Ml3 reverse)(来源Invitrogen商用引物)对克隆#14经Xho I酶酶切后得到的1.4kb片段进行DNA序列分析，1.4kb片段的DNA序列(SEQ ID N0.2)为人全序列第七凝血因子cDNA，其推断出的氨基酸序列(SEQ ID N0.3),与天然的hF VII蛋白的氨基酸序列100%匹配。
[0029]引物的碱基序列为:
M13 Forward (-20): gtaaaacgacggcaag
M13 reverse: caggaaacagctatgac
上述pBCl-rhF YD乳腺表达载体转化基因文库效率DH5a competence细菌(来源Invitrogen, cat: 18263-012),或者 One Shot T0P10 化学性 Competent E.coli (来源Invitrogen, cat: 4040-03),获得受体菌增殖，以实现pBCl-rhF VII的扩增。
[0030]获得的细菌克隆采用PCR方法筛选出阳性的克隆。使用在hFVD的:T末端前行引物与载体序列在10070-10045 (313 bp PCR产物)进行PCR扩增。由正向引物为hu7A_5f位于第七因子cDNA的末端:5^atgttctgtgccggctactc-3, (9758-9777)和反向引物pBCl-sr (pBCl-sr与hu7A_5f配对)位于β -酪蛋白内含子7:
5、CATCAGAAGTTAAACAGCACAGTTAG-3\ 10070-10045)，PCR产物为 313 bp。筛选结果如图5所示，从筛选的132个克隆中，细菌克隆#64-79,81-83，86-96为阴性，只有克隆#84和85为阳性，其中，M为100 bp DNA ladder (来源:NEB, Cat.N0467S)。克隆#84的基因序列分析(SEQ ID N0.l),pBCl-rhFVn线性DNA的总长为23020bp，重组人第七凝血因子基因的ATG起始密码子在8666位点处，TGA终止密码子在10000位点处。
[0031]引物PBCl-sr/hu7A-5f是根据pBCl和hF VII核苷酸序列设计并人工合成的。
[0032]⑵pBCl-rhF YD乳腺表达载体在乳腺上皮细胞内的表达
将全长pBCl-rhF VII乳腺表达载体(23020bp)通过电转染的方法感染乳腺上皮细胞MCF VL三天后收集细胞与培养液，检测细胞中表达的mRNA与培养液中rhFVII蛋白质的表达情况。采用RT-PCR的检测方法，使用引物对进行PCR的扩增。使用由正向引物为hu7A-5f和反向引物pBCl-sr (与hu7A-5f配对)进行扩增，PCR产物为313 bp。检测结果如图7所示，pBCl-rhFVD cDNA作为阳性的对照，未转染的细胞作为细胞的阴性对照，+RT表示有反转录酶反应后(RT)的PCR反应，-RT表示没有反转录酶反应后(RT)的PCR反应，在感染的细胞中检测到预期的313 bp的RT-PCR产物，从而证实转入的pBCl-rhF VII基因在MCF VII的细胞中得到了表达。
[0033]MCR-7细胞中的重组第七凝血因子的蛋白表达检测是采用常规的Western Blot完成的。第一抗体是兔抗人第七凝血因子的抗体(来源Renova，1:500稀释)，第二抗体是羊抗兔的抗体(来源Abeam, ab6846, 1:500稀释)。检测结果如图8所示,50 kDa的表达蛋白在转染的MCF VII细胞培养液中显示，其余的着色带型是非特异性的蛋白，确定了经过三天培养的转染的细胞分泌了微量的第七凝血因子。
[0034]由此证明，乳腺表达载体`在乳腺中能够表达，即外源rhF W cDNA能够在乳腺中表达。
[0035]⑶转基因兔的培育
a、pBCl-rhFVD乳腺表达载体的处理:利用SalI限制性内切酶可以将环状DNA切成线性的DNA (23020 bp);利用XhoI限性内切酶可释放21.6 kb的乳腺表达载体和1.4kb的rhFW cDNA片段。利用Sal I和Not I限性内切酶可以释放5.9 kb的细菌质粒部分与
17.1 kb的线性DNA，其中，17.1 kb线性DNA为表达构件、包含调控元件和插入的rhF WCDNA0该表达构件可以用于显微注射到家兔(兰诺生物技术无锡有限公司自繁的兔群)的受精卵，培育第七凝血因子转基因兔的种子，上述酶切片段如图6所示。
[0036]b、原核期胚胎显微注射、培育转基因兔:
运用显微注射的方法将含rhF VII基因的表达构件(17.lkb)，注射到家兔受精卵的原核中，经过短期体外培养后，成活的胚胎将被移植到受体的输卵管中，经过约31天的妊娠，获得基因注射兔。
[0037]性成熟(6月龄以上)的家兔将进行超数排卵处理，连续三天，每天两次按剂量递增的方式(3，3;4，4和5，5mg)实施颈皮下注射FSH (促滤泡激素)，FSH处理完毕后，超排母兔与公兔交配两次，并注射100IU hCG/供体(IU国际单位，hCG人绒毛促性腺激素)。hCG处理后18-20h，从供体兔的输卵管中冲洗出受精卵。受精卵经15000g的条件离心7-8分钟，充分显示雄性与雌性原核，如图9中A、C所示。整个显微注射的过程见图9，在明显确立了原核膨胀后，如图9中B和D所示，注射过的卵子移入10% FBS M199培养液中在38.5° C，5% CO2培养箱中短暂培养，以检查注射胚胎的成活率和分裂的状况。约15-20枚注射胚胎将被移植到经过同期发情处理的受体母兔的输卵管中。结果显示，妊娠率为50%(n=16)，在怀孕的母兔中，大约7.5%的注射卵子会发育成出生幼体，2-8只幼兔在怀孕母兔中诞生，共出生8个阳性的第七凝血因子转基因兔，总转基因效率为24.2% (表1，n=33)。表1为重组人第七凝 血因子转基因兔制作效率。
[0038]表 I
【权利要求】
1.利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于:将重组人第七凝血因子的CDNA导入或整合至家兔的基因组中，获得的转基因兔在乳腺反应器内表达重组人第七凝血因子。
2.根据权利要求1所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于:利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其包括以下步骤:⑴将外接信号基因的重组人第七凝血因子的cDNA插入表达载体中形成第七凝血因子的乳腺表达载体，所述表达载体包括调控元件；⑵将乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因中，获得转基因兔；(3)获得的转基因兔的当代或者后代母兔在泌乳期的乳汁中产生重组人第七凝血因子。
3.根据权利要求2所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于:所述表达载体为PBCl质粒载体，所述重组人第七凝血因子cDNA为人全序列第七凝血因子cDNA。
4.根据权利要求2所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于:所述外接信号基因为β_酪蛋白信号肽和第七凝血因子原有的分泌信号肽。
5.根据权利要求2或3或4所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于:所述调控元件包括鸡β球蛋白绝缘子，山羊β_酪蛋白启动子，TATA盒，酪蛋白外显子1，酪蛋白内含子1，酪蛋白外显子2，β-酪蛋白外显子7，8,9, β-酪蛋白内含子7，8，β-酪蛋白基因组片段。
6.根据权利要求5所述的 利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于:所述重组人第七凝血因子的cDNA在限制性内切酶Xho I多克隆位点插入pBCl载体，所述限制性内切酶Xho I多克隆位点位于酪蛋白外显子2和β-酪蛋白外显子7，8，9之间。
7.根据权利要求6所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于:在将所述乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因之前，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分，形成乳腺表达构件，所述乳腺表达构件包括所述调控元件和第七凝血因子cDNA。
8.根据权利要求7所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于:步骤⑵中将乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因并获得转基因兔的具体操作为:首先，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分，形成所述乳腺表达构件；其次，将所述乳腺表达构件通过显微注射直接注入家兔受精卵中；然后，将家兔受精卵放入FBS M199培养液、并在38.5°C>5% CO2的培养箱中培养；最后，将家兔胚胎移植到受体家兔的输卵管中，经过妊娠，获得转基因兔。
9.根据权利要求7所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于:步骤⑵中将乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因并获得转基因兔的具体操作为:首先，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分，形成所述乳腺表达构件；其次，将所述乳腺表达构件转染至家兔供体细胞中，然后，将经过乳腺表达构件转染的阳性细胞核通过显微操作移到去除染色体遗传物质的卵母细胞的细胞质中，构成克隆胚胎；最后，将发育的克隆胚胎进行胚胎移植，到同步发情的受体兔中妊娠，获得转基因兔。
10.根据权利要求2所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于:所述泌乳期包括人工诱导泌乳期和自然分泌的泌乳期； 所述人工诱导泌乳期和所述自然泌乳期包括泌乳前期、泌乳中期和泌乳后期。
【文档编号】C12N15/85GK103484497SQ201310342562
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年8月8日 优先权日:2013年8月8日
【发明者】杜福良, 杨澜, 薛非, 安礼友 申请人:兰诺生物技术无锡有限公司