0、10.0、11.0、12.0、13.0，2(TC下作用24h。
[0049] c)盐浓度稳定性:取20mL上清液，用NaCl分别调盐浓度在0、10、30、50、70、90、110、 150、200、300、500、70(^/1，20。(：下作用2411。
[0050]试验结果:如图4所示，由图4-(a)可知，温度增加对该菌所产表面活性物质的排油 活性影响不大。在20~120°C之间，不同温度处理发酵液的排油圈直径、乳化指数及表面张 力值波动幅度不大，说明该菌所产表面活性物质具有良好的温度稳定性；由图4-(b)可知， 当pH值为6.0~13.0时，不同pH处理发酵液的排油圈直径、乳化指数及表面张力值变化不 大，相对稳定；当pH值在6.0以下时，由于表面活性物质沉淀，排油圈直径及乳化指数均减 小，表面张力增加，表明供试菌株所产表面活性物质在碱性条件下较酸性条件下有更高的 稳定性。由图4-(c)可知，当盐浓度小于130g/L时，发酵液的乳化指数及表面张力值相对稳 定，排油圈直径略有下降；盐浓度130~300g/L时，发酵液的排油圈直径及乳化指数快速下 降，表面张力值增加；当盐浓度为大于300g/L时，发酵液仍具有一定的排油活性，但其乳化 性消失。
[0051]实施例4菌种的应用 [0052] (1)对原油的降解
[0053]试验方法：向100mL细口玻璃瓶中分别加入2.000g原油，再加入30mL萎缩芽孢杆菌 5_2a发酵液，以加30mL蒸馏水为对照，加橡胶瓶塞密封并用胶带加固，以防瓶内压力增大冲 开瓶塞。40°C静置反应96h，每4小时摇动1次。反应结束后，测定经过萎缩芽孢杆菌5-2a降解 后，原油中饱和烃、芳香烃、胶质以及沥青质含量变化。
[0054] 试验结果：如表1所示，由表可知，芽孢杆菌5_2a对原油中饱和烃、芳香烃、胶质及 沥青质的降解率分别为12.5%、37.8%、21.7%及53.1 %，萎缩芽孢杆菌5-2a降解处理原油 与对照原油中4种组分的差异均达到显著水平(P<0.05)。
[0055]表1萎缩芽孢杆菌5_2a对原油族组成的影响
[0056]
[0057] (2)对原油黏度及固体石蜡的溶解
[0058]萎缩芽孢杆菌5_2a对原油黏度及固体石蜡的溶解情况如表2所示，由表可知，30°C 时，经萎缩芽孢杆菌5-2a降解处理后，原油黏度较对照组原油黏度降低24.7% ;40°C时，较 对照组降低25.6%。固体石蜡经萎缩芽孢杆菌5-2a降解后，在正己烷中的溶解性发生显著 变化，其溶解效果如图5所示，可溶解石蜡量已达到石蜡总量的68.6%，不溶解的结晶石蜡 量占石蜡总量25.3%，与对照组差异均达到显著水平(P<0.05)。该结果表明，萎缩芽孢杆 菌5-2a能大幅度减小原油粘度，并能提高石蜡在正己烷中的溶解能力，增加正己烷可溶的 小分子石蜡量。
[0059]表2萎缩芽孢杆菌5_2a对原油黏度与固态石蜡溶解性的影响 [00601
[0061] (3)对原油与固体石蜡降解的产气量及气体成分
[0062]萎缩芽孢杆菌5_2a对原油与固体石蜡降解的产气量如表3所示，由表可知，萎缩芽 孢杆菌5_2a降解原油与固体石蜡过程中有气体产生，经气相色谱分析所产气体主要为H2和 C02。从表3看出，降解过程中总产气量达到55.5~63.7mL/瓶，其中，H2为36.0~41.5mL/瓶， C02的产量为19.5~22.2mL/瓶，产气率为64.9%~212.3%。
[0063]表3萎缩芽孢杆菌5_2a降解原油与固态石蜡过程中产气种类及产气量 [00641
[0065] (4)对原油与固体石蜡降解的产酸量及酸成分
[0066] 萎缩芽孢杆菌5_2a对原油与固体石蜡降解的产酸量如表4所示，由表可知，经萎缩 芽孢杆菌5-2a降解后，反应液pH较对照下降26.5%~27.1 %，总酸量为22.9~23.5mmol/L， 酸值达到1374~1410mg/L。经有机酸色谱分析，产生的短链有机酸主要是草酸和丙酸。
[0067] 表4萎缩芽孢杆菌5_2a降解原油与固体石蜡时的培养液pH及产酸量
[0068]
[0069] (5)发酵液排油活性及对原油的脱附性
[0070]试验方法：
[0071 ] A发酵液排油活性:取口径为24cm的塑料盆，加水近满，在水面上滴加2滴液体石 蜡，待石蜡在水面上自由扩散形成1层液体石蜡膜，在蜡膜中心加1滴待测发酵液，待石蜡膜 向周围扩散形成圆形排油圈后，用直尺测定排油圈直径(D)』值与发酵液中的生物表面活 性成分含量及其排油活性呈正相关，以滴加蒸馏水处理为对照(CK)。
[0072] B对原油的脱附性：①以滤纸为吸附载体时的原油脱附率：将已称重的6. OcmX 6.Ocm定性滤纸浸入原油中，待滤纸吸足原油后称重;将吸附原油的滤纸置于装有80mL细菌 发酵液的1 OOmL广口组培瓶中，以加80mL蒸馏水为对照，40 °C静置培养48h，取出滤纸自然风 干后称重，观察记录原油在滤纸上的附着性并拍照，计算表发酵液对原油的脱附率。②称取 粒径0.25~0.50mm细沙90.0 g加入到600mL广口组培瓶中，随后加入10.0 g原油，拌均匀后， 室温放置48h。加入100mL待测菌株发酵液，以加100mL蒸馏水处理为对照，40°C静置培养 24h。反应结束后沙粒表面附着的部分原油脱离沙粒聚集在水相表面形成油层;将组培瓶放 置4°C冰箱中静置，待原油凝固后取出组培瓶，将瓶中水相上层的凝固态原油取出，用自来 水清洗凝固态原油表面附着的无细胞发酵液，用吸水纸吸干残留水分称重，根据从沙粒上 脱落的原油质量计算发酵液对原油的脱附率。
[0073]试验结果:如表5所示，由表可知，该萎缩芽孢杆菌5_2a发酵液具有较强的表面活 性，其排油圈直径为19.0cm，为对照的63.3倍;该发酵液对细沙、滤纸上附着的原油均具有 良好的脱附作用，其对滤纸、细沙吸附原油的脱附效果图分别如图6_(a)、图6-(b)，在以细 沙为吸附介质的脱附试验处理中，90.0%的原油从细沙上脱落下来，脱落量为对照的9.7 倍;在以滤纸为吸附介质的脱附试验处理中，93.1%的原油从滤纸上脱落下来，脱落量为对 照组的7.3倍。
[0074]表5萎缩芽孢杆菌5_2a发酵液排油圈直径及对原油脱附率的影响
[0075]
[0076] (6)清蜡率与防蜡率
[0077]试验方法：
[0078] A清蜡率:采用挂片法。以载玻片为原油吸附载体，测定细菌发酵液的清蜡率。将已 称重的26mm X 76mm载玻片浸入原油中，使原油覆满载玻片下端5.3cm长度内面积，保留载 玻片上端2.3cm高度为无油区，待原油凝固后用天平称重精确至O.OOlg;将涂有原油的载玻 片置于装有l〇〇mL发酵液的600mL广口组培瓶中，以加100mL蒸馏水为对照，30°C静置培养 96h;取出载玻片，用清水漂洗净载玻片上附着的菌体及杂质，称重。发酵液作用前后载玻片 的质量差为残存的来源于原油的石蜡，计算清蜡率（％ )。
[0079] B防蜡率:采用静态法。准确称取2.000g含蜡原油分别装入100mL医用盐水瓶中，而 后分别加入30mL细菌发酵液，30 °C恒温培养48h，培养结束后将发酵液与原油的混合物倒入 50mL小烧杯中，将用清洗剂及去离子水清洗并干燥的载玻片，垂直悬挂于含原油的发酵液 中，在lh内将原油温度由60°C降至25°C，静置30min后取出载玻片，用异丙醇洗去原油，然后 称量。以加入30mL蒸馏水为空白对照。计算细菌防蜡率（％ )。
[0080] 试验结果：如表6所示，由表可知，该萎缩芽孢杆菌5-2a具有很好的清蜡、防蜡作 用。其中，防蜡率达98.1 %，清蜡率达89.3 %。
[0081] 表6萎缩芽孢杆菌5_2a室内模拟清防蜡率
[0082]
[0083]综合以上实施例可知，本发明筛选的萎缩芽孢杆菌5_2a具有以下多种驱油功能： ①降解作用：可大幅度降解原油及固体石蜡中的烷烃、芳香烃、胶质及沥青，使原油及石蜡 中的重质组分分解为轻质组分，降低原油黏度，减少可沉积的石蜡量，进而有效改善原油的 流动性及石蜡的蜡晶形态。②产气:菌株在降解原油及石蜡过程中产生大量出和(》 2,这些气 体能够增加油层内部压力；气体溶入原油会降低原油黏度，改善原油流动性。③产酸:在降 解原油及石蜡过程中产生大量草酸、丙酸等有机酸，可有效溶解储油岩层孔隙中的碳酸盐， 增加油层的孔隙度和渗透率，同时还能降低油水之间的界面张力，形成油水乳浊液，从而提 高原油采收率。④产生表面活性物质:该菌株能够以尿素为氮源合成脂肽类表面活性物质， 该表面活性物质能够耐受高温、高盐，具有较广泛的pH适应性，且对滤纸、细沙吸附原油均 具有良好的脱附作用，有助于原油脱附，同时对原油中的石蜡组分具有一定的乳化、分散作 用，使蜡晶颗粒变细变小而随采出液流出油井，改善防蜡清蜡效果，进而提高原油采收率。
[0084] 由以上各作用推知，该多功能驱油芽孢菌对提高原油采收率、清蜡与防蜡的作用 将优于具有单一功能的活性物质产生菌或降解菌，在原油开采业及管道运输中具有广阔的 应用潜力。
[0085] 虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。 因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范
【主权项】
1. 萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)5-2a，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏 号为CCTCC Μ 2014673。2. 根据权利要求1所述的萎缩芽孢杆菌5-2a，其特征在于，所述萎缩芽孢杆菌5-2a的 16S rDNA序列如SEQ ID No.l所示。3. 根据权利要求1所述的萎缩芽孢杆菌5-2a，其特征在于，所述萎缩芽孢杆菌5-2a能产 表面活性物质;所述表面活性物质为脂肽类表面活性物质。4. 根据权利要求3所述的萎缩芽孢杆菌5-2a，其特征在于，所述萎缩芽孢杆菌5-2a能以 尿素为氮源合成脂肽类表面活性物质。5. 权利要求1或2所述的萎缩芽孢杆菌5-2a在原油降解中的应用。6. 权利要求1或2所述的萎缩芽孢杆菌5-2a在固体石蜡降解中的应用。
【专利摘要】本发明属于利用微生物及其代谢产物提高原油采收率的三次采油技术领域，公开了一株萎缩芽孢杆菌5-2a，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC？M？2014673；本发明的萎缩芽孢杆菌5-2a能以尿素为氮源合成可耐受高温、高盐，具有较广泛的pH适应性的脂肽类表面活性物质，对滤纸及细沙上附着的原油均具有良好的脱附作用；本发明还公开了萎缩芽孢杆菌5-2a在原油降解或固体石蜡降解中的应用，对原油及固体石蜡具有降解能力强，降黏幅度大及产气产酸能力强的特点，作用效果显著。CCTCC M 201467320141228
【IPC分类】C09K8/582, C12R1/07, C12N1/20
【公开号】CN105567595
【申请号】CN201610012328
【发明人】张俊会, 薛泉宏, 高卉, 来航线, 王平
【申请人】陕西博秦生物工程有限公司, 西北农林科技大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年1月8日