一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺及其运用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及生物菌领域，具体为一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺 及其运用。
【背景技术】
[0002] 双歧杆菌是人体内存在的一种生理性细菌，是人体有益菌中最值得重视和研究的 一种，它与人体的健康密不可分。可以说是大自然赐予人类的健康法宝。
[0003] 双歧杆菌是人体和动物体肠道中最重要的正常菌群之一，能在肠道黏膜上生长形 成一道膜菌群，构成一道生物学屏障，从而使入侵的致病菌在肠道内失去生长繁殖的落脚 点，双歧杆菌在肠道内生长繁殖代谢产生的乙酸、乳酸、醋酸等。既能使肠道环境变酸，而不 利于有害菌在肠道内生长，又能促使肠道蠕动有利于排便和排出有害细菌。双歧杆菌可以 持续产生，维生素8132、86、812及丙氨酸，天冬氨酸和苏氨酸等人体必要的营养物质，同时 产生短链脂肪酸，抗氧化剂，修复胃肠黏膜，促使胃肠溃疡恢复。
[0004] 双歧杆菌能抑制硝酸盐的还原，降低血液中的氨和游离酚含量的作用，增强人体 免疫力和降低体内胆固醇，保持低血脂状态。
[0005] 长期服用双歧杆菌能够降低胃肠细胞的受损，有助于防止胃肠器官的癌变，降低 胃肠内致癌物质，减低血液中的毒性，减轻肝脏压力，平衡胃肠道菌群，清除胃肠道内的腐 败菌，将粪便中的亚硝酸盐等诱发癌症的物质分解，从而阻止致癌物质的形成，为人体免疫 系统提供营养，抑制癌细胞繁殖，产生抑制肿瘤细胞的化合物，降低细胞化学诱变的机会， 对腹泻、便秘有双向调节的明显作用。
[0006] 科学研究已证实，世界上不少长寿地区的长寿老人，其肠道内的双歧杆菌仍保持 着青春壮年水平。
[0007] 微生态学的现代化崛起和医学技术的进展，使双歧杆菌研究的重要性越来越被认 识，由于双歧杆菌制品在世界范围内得以广泛应用，大众已认识到其重要性，这也为双歧杆 菌制品的研究开发奠定了发展基础。
[0008] 双歧杆菌是一种严格厌氧菌，它对生存环境的要求非常苛刻，对营养条件要求较 高，易受氧、水分、光线，保护基质等条件的影响，保质期较短，服用后又被胃酸、胆汁酸等的 灭活，能安全进入肠道的微乎其微，加上生产工艺，配方的不合理缺陷，发酵过程中未能在 很大程度上使双歧杆菌产生更多对人体有益的有效物质，所以服用双歧杆菌制品后的效果 就会下降或不明显。
[0009] 双歧杆菌的多种生物学功能，已被科学发现并应用于各个领域，双歧杆菌要求厌 氧及营养要求条件较高且生长缓慢，因此双歧杆菌的生产关键问题是筛选耐氧、耐酸、粘附 力强，产量高的菌株，寻求该菌株必要的生长促进物，并选择该菌株在非厌氧条件或兼性厌 氧条件下的最佳生产工艺，配方等技术。多年来国内外科学家对双歧杆菌菌株的筛选、驯 化、诱变等做了一系列实验，据资料显示，到目前为止，非厌氧或兼性厌氧双歧杆菌的生产 及产品在常温下的保存技术仍在实验室阶段，因此，提高双歧杆菌活菌产量及先进的生产 工艺及配方这一问题显得越来越重要。
[0010] 双歧杆菌活菌及其发酵代谢产物对人体健康起到重要作用，但现阶段双歧杆菌的 生产方法，主要是厌氧发酵法，但该方法生产周期长，设备投资大，设备利用率和产菌收率 低，有效物质单一，产品使用效果不显著，适用范围小，因产品对氧和温度极为敏感，对酸的 抵抗力较差，活菌保持较为困难，货架期短，不能有效发挥治疗、保健作用。
[0011] 针对现有技术所存在的技术问题，山东环亿生物科技有限公司，经多年的深入研 究开发，经过人体、动物、植物的多方面试验，成功的开发出一整套齐全的配方、酶解、诱导、 发酵法生产双歧杆菌及其代谢产物的方法，该方法的优点在于具有生产配方简单、易操作、 发酵周期短、产品收率高、原材料易得、活菌收率高、代谢产物丰富，生产成本更加低廉，使 用效果更加明显广泛，产品货架期长，并突破了常温下可保存的难点。
【发明内容】
[0012] 为了解决以上的技术问题，本发明提供了一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法 制备工艺，对菌种进行了较为全面的分离筛选，规定了特殊的配方及发酵工艺，使双歧杆菌 产品达到了耐氧、耐酸、耐常温下储存。干粉在常温下能保持12个月不变，有效物质短链脂 肪酸、乙酸、乳酸，经测定比一般生产方法及配方活菌分别提高了 10倍、15倍，应用效果明 显，发酵液中的活菌量由原来的6-8亿个/毫升，提高到了现在的16-20亿个活菌/毫升，以 下是具体技术方案： 一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，步骤包括:制备扩大菌种液和一级 种子培养液得到一级菌种液，再将一级菌种液与种子培养基在种子罐混合培养得到种子罐 菌种，再将所述的种子罐菌种与发酵罐培养基混合培养并通过诱导液进行发酵得到发酵 液，当发酵完毕后，进行发酵液离心，得到湿菌泥，其中湿菌泥即为双歧杆菌乳酸菌的混合 发酵菌泥，再将湿菌泥的冷冻干燥，其中冷冻干燥还包括悬菌液的制备和真空干燥，其中悬 菌液的制备包括取湿菌泥并加入无菌蒸馏水加热至60~65°C，并搅拌并加入麦芽糊精，溶化 后再加入水、脱脂奶粉、乳糖、甘油，在30~40°C的条件下搅拌1~2小时，得到悬菌液，然后将 悬菌液放入恒温室中恒温60分钟进行预冻，其中真空干燥步骤为将预冻好的料盘放入真空 干燥室进行抽真空干燥，并且干燥条件为真空度为10~15pa，温度为-50°C，干燥室温度为32 °C，干燥时间为55小时，冻干完毕后收集冻干料;其中扩大菌种液制备包括酶解法制备试管 培养基和接种两部分;其中一级种子培养液制备包括酶解法制备一级种子培养液;所述的 种子培养基的制备包括酶解法制备种子培养基;所述的发酵罐培养基的制备包括酶解法制 备发酵罐培养基。
[0013] 其中，所述的扩大菌种液的制备包括酶解法制备试管培养基:将10g核桃仁、10g花 生仁、5克酪蛋白酸钠、0.1克无水氯化钙不分前后顺序投入到300ml水中进行研磨并打成浆 状过滤得到浆液，再在浆液中加入700ml水并进行加热至53°C~57°C并进行搅拌，在搅拌中 加入脂肪酶进行酶解，酶解后再加入无花果酶进行酶解得到酶解液，然后向酶解液中加入 3gL-精氨酸、3g番前粉、6g牛肉膏、2g酵母浸粉、5g蛋白胨、0. lg梓檬酸铵、0.6g丝氨酸、3g氯 化钠、5g乳糖、8g葡萄糖、8g乙酸钠、3.2g磷酸氢二钾进行搅拌溶解后分装于试管中，每支试 管中分装20ml。将所述多个试管放入医用消毒器中，采用0.1~0.14Mpa灭菌20分钟后得到试 管培养基； 4、接种：在无菌条件下，打开冻干管菌种，其中冻干管菌种包括：双歧杆菌（菌号： CGTMCC-1.2212，中国普通微生物菌种保藏管理中心），短双歧杆菌（菌号：CGTMCC- 1.2213,中国普通微生物菌种保藏管理中心），婴儿双岐杆菌(菌号:CGTMCC-1.2202,中国 普通微生物菌种保藏管理中心），鼠李糖乳杆菌(菌号:CICC一6065，中国工业微生物菌种保 藏管理中心），将所述的4株菌种内分别加入以上灭菌的试管培养基lml，摇动溶化后得到冻 干管菌悬液备用，再将所述的4支冻干管菌悬液分别各取lml加入至4支试管培养基中在31-37°C的温度下，采用150-210转/分钟的转速，在摇瓶机中摇动24~30小时制得扩大菌种液。
[0014] 其中，一级种子培养基培养中各组分为：核桃仁20克、花生仁20克、酪蛋白酸钠10 克、L一精氨酸5克、番茄粉6克、牛肉膏8克、酵母浸粉3克、蛋白胨3克、柠檬酸胺0.15克、丝氨 酸0.8克、葡萄糖酸0.4克、氯化钠3克、乳糖10克、葡萄糖15克、乙酸钠6克、无水氯化钙0.1 克、磷酸氢二钾2克、50万单位脂肪酶10克、10万单位无花果酶10克、自来水1000毫升，PH自 然;将一级种子培养基中的核桃仁、花生仁、酪蛋白酸奶、无水氯化钙加入所述600毫升的水 中进行研磨至浆状，过滤后得到浆液，然后再所得浆液中加入400毫升水并加热到53°057 °C并进行搅拌，在搅拌下加入脂肪酶进行酶解，酶解后再加入无花果酶进行酶解得到酶解 液，然后向酶解液中加入其他原料，进行搅拌熔化得到一级种子培养液;将一级种子培养液 量取所用量加入到三角瓶中封口后灭菌，将装有经过灭菌的培养液的三角瓶放超净工作台 中降温，当温度降到31°C~37°C，在无菌条件下将所述培养好的扩大菌种液接到三角瓶中， 即100ml -级种子培养液接入的扩大菌种液为4ml，在31-37°C的温度下，采用摇瓶机在 150-210转/每分钟的转速下，摇动12-28小时得到一级菌种液。
[0015] 其中，种子罐培养步骤:将种子罐及发酵罐进行空罐灭菌处理;其中种子罐培养基 中各组分的重量比为:核桃仁1.5%、花生仁1.5%、酪蛋白酸钠0.2%、L一精氨酸0.3%、番茄 粉0.2%、牛肉膏0.4%、蛋白胨0.2%、丁酸钙0.5%、柠檬酸胺0.02%、丝氨酸0.04%、葡萄糖酸 0.5%、氯化钠0.3%、乳糖0.5%、葡萄糖1%、乙酸钠0.3%、无水氯化钙0.03%、可溶性淀粉0.3%、 50万单位脂肪酶1%、10万单位无花果酶1%、磷酸氢二钾0.2%、聚醚消泡剂0.01%、自来水90%， PH自然;将种子罐培养基配方中的核桃仁、花生仁、酪蛋白酸钠、无水氯化钙加入20公斤的 水中进行研磨至浆状，过滤后得到浆液，然后将浆液加热到53°C~57°C进行搅拌，在搅拌中 加入脂肪酶进行酶解，再加入无花果酶进行酶解得到酶解液，将所述的酶解液、剩余量的水 和原料不分先后顺序的投入种子罐并进行搅拌，然后经过高温灭菌及降温处理后，将所述 培养好的一级菌种液在无菌条件下接种到经灭菌处理的种子罐中，接种量分别是