专利名称：一种双歧杆菌深层冷冻直投发酵剂及其复合冷冻保护剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种双歧杆菌深层冷冻直投发酵剂及其复合冷冻保护剂。
背景技术：
作为一种经典的益生菌，双歧杆菌的益生功能已得到了普遍的认识，在功能食品中的应用也得到了广 泛的关注，其中在乳制品中的应用最具有代表性。但是双歧杆菌在发酵性能与生产性能上具有种种弊端。 首先，双歧杆菌对于外界环境极度敏感，在发酵剂的制备过程中经历低温，干燥，等逆境刺激存活率较低; 其次，双歧杆菌是专性厌氧菌，对发酵条件要求较高，有氧发酵产酸速度低，并且风味较差；在混合菌种 直投发酵剂的制备中菌种比率较难控制，最终产品中的活菌数不稳定。将双歧杆菌制备成直投发酵剂，作 为辅助发酵剂与传统的乳酸菌直投发酵剂混合使用，既能保证产品中益生菌的数量，又能保证酸奶的质地 和口味，控制凝乳时间，在功能乳制品中具有广泛的应用前景。
双歧杆菌有效应用于乳品发酵主要依赖于发酵剂的制备和保藏技术。目前双歧杆菌发酵剂的开发主要 集中在冷冻干燥和喷雾干燥领域，但是这些技术会引起一系列副作用首先干燥过程中存活率仅为 30%-40%左右，由于双歧杆菌对营养和生长条件要求较高，菌体生产成本较高，提高发酵剂制备过程中的 存活率对于生产应用具有重大意义；其次发酵剂制备和保藏过程中持续的低水分活度会引起细胞壁，细胞 膜，DNA等的损伤，很多存活的细胞会失去其生理功能，从而失去益生菌的价值；第三，由于细胞损伤， 菌体耐受逆境的能力以及耐受产品和肠道中氧，酸，胆盐等的能力也会下降，从而使得达到肠道和在肠道 中定殖的菌数不能保证，这也是双歧杆菌应用过程中的瓶颈。
深层冷冻技术通常用于组织，细胞，菌种等的保藏，对于生物活性的保持具有良好的效果，保藏时间 长保藏效果好。利用有效保护剂，深层冷冻技术用于发酵剂的制备存活率可接近100%，对于降低双歧杆 菌的培养成本具有重要作用。常用的深冷保护剂包括二甲基亚砜，聚乙二醇，血清等价格昂贵，且不适宜 用于食品，限制了其在发酵剂生产中的应用。本发明涉及一种食源性的双歧杆菌深层冷冻发酵剂，用于双 歧杆菌直投发酵剂的制备，以保证双歧杆菌在产品中菌数和功能特性。
根据保护剂作用机理的不同，可将保护剂分为渗透性保护剂，半渗透性保护剂和非渗透性保护剂。渗 透性保护剂能渗透到细胞内部，在细胞内充分水和，防止细胞过度脱水，可以降低高盐对细胞的毒性，也 可以防止细胞内冰晶的形成。半渗透性保护剂可以防止冷冻前细胞的质壁分离，可以集中在细胞壁和细胞 质之间作为一个缓冲层防止冰晶的生长，对细胞膜起到化学保护作用。非渗透性保护剂吸附在微生物细胞 的表面形成一个黏度较高的保护层通过增加溶液的粘度来阻止冰晶的生长，在细胞附近形成无定形结构。各种机理的冷冻保护剂联合使用对于活菌数和菌株功能的保持有显著的作用，是制备高效深冷双歧杆菌发 酵剂的关键。
脱脂乳是一种很好的缓冲体系，本身含有大量的蛋白质、糖类等是一种理想的保护介质，可以通过保 护细胞膜的稳定性来阻止细胞损伤，其中的蛋白质也可以作为被膜而对细胞起到保护作用，在脱脂乳中添 加不同的保护剂也可以不同程度的增强其保护效果。
糖类作为半渗透保护剂其作用在于，在冷冻过程中通过形成高粘度的玻璃态物质而对蛋白质起到保护 作用；与蛋白结合作为水的替代物防止蛋白质的变性。除了保护蛋白质的结构和功能外，海藻糖和其它碳 水化合物还可以通过取代脂质的亲水头部来降低细胞膜的相变温度，从而可以防止细胞膜的相变和由此引 起的细胞膜的破漏。
谷氨酸的冷冻保护作用是保护剂的氨基和微生物蛋白质的羧基结合从而起到对蛋白质的稳定作用，并 且谷氨酸还可能提高细胞中的固定水分。
双歧杆菌是严格厌氧菌发酵剂，制备过程中氧的胁迫会影响菌体的存活和活力，在发酵剂的组成中添 加抗氧化剂对双歧杆菌的菌数和活力保持会有显著效果。
发明内容
本发明的目的是制备一种双歧杆菌深层冷冻发酵剂及其有效冷冻保护剂。解决常规双歧杆菌发酵剂 制备过程中存活率低，菌株活力下降的问题。
本发明用于双歧杆菌深层冷冻直投发酵剂的保护剂重量分组成为脱脂乳6%-16%;海藻糖 2.5%-7.5%;果糖2.5°/0-7.5%;甘油1%-40/0; Vc0.01%-0.1%; L-Glu0.01%-0.1%。
所述双歧杆菌深层冷冻直投发酵剂，优选由下述重量分组成脱脂乳8%;海藻糖5%;果糖5%; 甘油3%; VcO.05%; L-Glu0.05%。
本发明制备的双歧杆菌深层冷冻直投发酵剂，是双歧杆菌菌体加入上述保护剂后，经-80'C深层冷冻 后得到。
上述保护剂按照双歧杆原菌液体积的20/1-1/5加入充分混合迅速于-8(TC冷冻。
所述双歧杆菌菌体使用玉米浆干粉培养基或NPNL培养基或MRS培养基于37°C ， p恥.5-PH7. 0恒pH 厌氧培养15-24h培养得到。
所述菌体通过4000rpra-8000rpm, 8-20min离心得到。
所述玉米浆干粉培养基由下述组分制成玉米浆干粉55g/L,葡萄糖10g/L， L半胱氨酸盐酸盐0.05g/L, A液10mL/L， B液5ml/L。
所述A液由下述组分组成KH2P04 100g/L， K2HP04 100g/L。
所述B液由下述组分组成MgS04.7H20 2g/L,， FeS04.7H20 2g/L， Nacl 2g/L， MnS041.3g/L。 所述NPNL培养基由下述组分组成牛肉浸汁粉3g/L，蛋白胨10g/L，胰蛋白胨5g/L，植胨3g/L，
酵母浸出汁5g/L，牛肝浸粉10g/L，葡萄糖10g/L，可溶性淀粉0.5g/L,溶液A 10ml/L，溶液B 5ml/L，
吐温80 lg/L，盐酸半胱氨酸盐0.5g/L。
所述A液由下述组分组成KH2P04 100g/L， K2HP04 100g/L。
所述B液由下述组分组成MgS04.7H20 2g/L,， FeS04.7H20 2g/L,， NaCl 2g/L， MnS04'1.3g/L。
所述MRS培养基由下述组分组成蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L,酵母粉5 g/L，葡萄糖20 g/L 醋酸钠5g/L,柠檬酸二铵2 g/L， KH2P04 2g/，吐温80 lg/L,硫酸镁0. 58g/L，硫酸锰0. 28g/L,盐酸 半胱氨酸盐0.5g/L。
实验表明双歧杆菌在本发明的保护剂作用下制备深层冷冻保护剂，冷冻后菌数保持稳定，滴定酸度 测定菌株活力保持良好，贮藏期间稳定性良好，用于酸奶发酵产品活菌数达到107cfu/mL以上，达到直投 发酵剂要求。
图1:酸奶发酵与贮藏过程中双歧杆菌BBMN68活菌对数值变化。 . 图2:酸奶发酵与IC藏过程中双歧杆菌BBMN23活菌对数值变化。 图3:酸奶发酵与贮藏过程中双歧杆菌BBMN01活菌对数值变化。
具体实施方式
实施例1-24
(1)菌株培养将保藏的长双歧杆菌BBMN68 (保藏于中国农业大学)传代两次恢复活力，镜检 培养液菌株形态，将活化菌株以107cfli/mL接种于玉米浆干粉培养基'恒pH7. 0厌氧培养24h。
玉米浆干粉培养基由下述组分制成玉米浆干粉55g/L，葡萄糖10g/L, L半胱氨酸盐酸盐0. 05g/L, A液10mL/L, B液5ml/i:。
所述A液由下述组分组成KIWU lOOg/L, K2HP04 100g/L。
所述B液由下述组分组成MgS04.7H20 2g/L， FeS04 .7H20 2g/L， Nacl 2g/L ， MnS041.3g/L。(2) 收集菌体将(1)得到菌液4000rpm， 10min离心得到菌体，收集菌泥。
(3) 添加保护剂-双歧杆菌深层冷冻保护剂组成为
表l
保护剂组成
——卖愈MT 实施例2
实施例3 实施例4 实施例5 实施例6 实施例7 实施例8 实施例9 实施例10 实施例11 实施例12 实施例13 实施例14 实施例15 实施例16 实施例17 实施例18 实施例19 实施例20 实施例21 实施例22 实施例23 实施例24
脱脂乳w/w海藻糖w/w —6%2.5% —
10%
6%
10%
6%
10%
6%
10%
6%
10%
6%
10%6%.
腦
6%
10%
4% 12%
8%
8%
8%
8%
8%'
8%
2.5% 7.5% 7.5% 2.5% 2.5% 7.5% 7.5% 2.5% 2.5% 7.5% 7.5% 2.5% 2.5% 7.5% 7.5%
5% 5%
10%
5%
5%
5%
5%
5%
果糖w/w —.—2 0 2.5% 2.5% 2.5% 7.5% 7.5% 7.5% 7.5% 2.5% 2.5% 2.5% 2.5% 7.5% 7.5% 7.5% 7.5%
5% 5%
5%
10%
5%
5%
5%
5%
甘油w/w 2% 2% 2% 2% 2% 2% 2% 2% 4% 4% 4% 4% 4% 4% 4% 4%
3% 3%
3%
3%
1%
5%
3%
3%
0.075% 0.025% 0.025% 0.075% 0.075% 0.025% 0.025% 0.075% 0.075% 0.025% 0.025% 0.075% 0.075% 0.025% 0.025% 0.075%
0.05% 0.05%
0.05%
0.05%
0.05%
0.05%
0.1%
0.05%
L-Gluw/w冷冻后活力(°T) '0.075化—49.—4厂—一
0.075% 0.075% 0.075% 0.025% 0.025% 0.025% 0.025% 0.025% 0.025% 0.025% 0.025% 0.075% 0.075% 0.075% 0.075%
0.05% 0.05%
0.05%
0.05%
0.05%
0.05%
0.05%
0.05%
43.03 52.56
51.82
52.83 49.97 48.9 46.28 51.09 39.34 46.05
42.91 47.16 49.22 50.09 48.3
47.33 43.32
50.73
49.92 46.92 51.03 42.63 51.73将收集的菌体，加入1/10原菌液体积的表1所述述保护剂，搅拌混匀，得到浓缩菌体悬浮液，迅速 与-8(TC冷冻保藏。
(4)菌株活力测定
冷冻浓缩物接种于12%脱脂乳中，接种量1% (V/V), 37t培养7h，测定滴定酸度(。T)。
所述滴定酸度测定方法为取10mL上述发酵乳，用20mL蒸馏水稀释，加2滴1%酚酞，用0. lmol/LNaOH 滴定，所消耗NaOH毫升数乘以10，即为中和100mL发酵乳所需的0. lmol/LNaOH毫升数，消耗lmL为1°T。 可以反映菌株的活力。
上述表l所列结果表明，保护剂作用下冷冻后菌株活力保持良好，最优结果为质量分数为8%的脱脂 乳；质量分数为5%的辟藻糖；质量分数为5%的果糖；体积分数为3%的甘油；质量分数为0.05%的Vc; 质量分数为0.05%的L-Glu。
实施例25双歧杆菌深层冷冻发酵剂的制备及应用
(1)菌株培养将保藏的长双歧杆菌BBMN68 (保藏于中国农业大学)传代两次恢复活力，镜检 培养液菌株形态，将活化菌株以107cfu/mL接种于玉米浆干粉培养基，恒pH7. 0厌氧培养24h。
玉米浆干粉培养基由下述组分制成玉米浆干粉55g/L，葡萄糖10g/L， L半胱氨酸盐酸盐0. 05g/L， A液10mL/L, B液5ml/L。
所述A液由下述组分组成KH2P04 100g/L， K2HP04 100g/L。
所述B液由下述组分组成MgS04.7H20 2g/L，， FeS04 .7H20 2g/L,， Nacl 2g/L ， MnS041.3g/L。
(2) 收集菌体将(1)得到菌液4000rpm， lOmin离心得到菌体，收集菌泥。
(3) 添加保护剂.-
双歧杆菌深层冷冻保护剂组成为实施例24所述。
将收集的菌体，加入1/10原菌液体积的上述保护剂，搅拌混匀，得到浓縮菌体悬浮液，迅速与-8(TC 冷冻保藏。 .
(4) 发酵剂用于酸奶发酵
上述制得的发酵剂与传统发酵剂同时接种12%的脱脂乳，42"C发酵至酸奶凝固，4'C保藏，测定保藏期间双歧杆菌菌数。图1为酸奶贮藏期间活菌数变化。
上述酸奶中双歧杆菌活菌计数使用双歧杆菌选择性计数培养基。 ' 双歧杆菌选择性计数培养基组成为牛肉浸汁粉3g/L，蛋白胨10g/L，胰蛋白胨5g/L,植胨3g/L，
酵母浸出汁5g/L，牛肝浸粉10g/L，葡萄糖10g/L,可溶性淀粉0.5g/L,溶液A 10ml/L，溶液B 5ml/L，
C液40ml/L,吐温80 1g/L，盐酸半胱氨酸盐0.5/L,琼脂15g/L。
所述A液由下述组分组成KH2P04 100g/L， K2HP04 100g/L。
所述B液由下述组分组成MgS04.7H20 2g/L，， FeS04 .7H20 2g/L，， Nacl2g/L ， MnS041.3g/L。 所述溶液C组成为硫酸巴龙霉素lOOmg,硫酸新霉素400mg ，丙酸钠15g ，氯化锂3g，置于40ml 无菌水，0.45um微孔滤膜过滤，现配现用。
实施例26双歧杆菌深层冷冻发酵剂的制备及应用
(1) 菌株培养将保藏的青春双歧杆菌BBMN23 (保藏于中国农业大学)传代两次恢复活力，镜 检培养液菌株形态，将活化菌株以107cfu/mL接种于MRS培养基，恒p朋.5厌氧培养18。
MRS培养基由下述组分组成蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L,酵母粉5g/L，葡萄糖20 g/L醋酸 钠5g/L，柠檬酸二铵2 g/L, KHaPOJg/,吐温80 lg/L,硫酸镁0. 58g/L,硫酸锰0. 28g/L,盐酸半胱氨 酸盐0.5g/L。
(2) 收集菌体-将(1)得到菌液4500rpra， 8min离心得到菌体，收集菌泥。
(3) 添加保护剂
双歧杆菌深层冷冻保护剂组成为实施例io所述。
将收集的菌体，加入1/20原菌液体积的上述保护剂，搅拌混匀，得到浓縮菌体悬浮液，迅速与-80"C 冷冻保藏。
(4) 发酵剂用于酸奶发酵
上述制得的发酵剂与传统发酵剂同时接种12%的脱脂乳，42'C发酵至酸奶凝固，4'C保藏，测定保藏期 间双歧杆菌菌数。图2为酸奶贮藏期间活菌数变化。
上述酸奶中双歧杆菌活菌计数使用双歧杆菌选择性计数培养基。
双歧杆菌选择性计数培养基组成为..牛肉浸汁粉3g/L,蛋白胨10g/L,胰蛋白胨5g/L，植胨3g/L， 酵母浸出汁5g/L，牛肝浸粉10g/L，葡萄糖10g/L，可溶性淀粉0.5g/L，溶液A !Om/L，溶液B 5m/L， C液40ml/L，吐温80 1g/L,盐酸半胱氨酸盐0.5/L,琼脂15g/L。所述A液由下述组分組成KH2P04 100g/L, K2HP04 100g/L。
所述B液由下述组分组成MgS04.7H20 2g/L,， FeS04 .7H20 2g/L,， Nac， 2g/L ， MnS041.3g/L。 所述溶液C组成为硫酸巴龙霉素lOOmg，硫酸新霉素400mg ，丙酸钠15g ，氯化锂3g,置于40ml 无菌水，0.Mum微孔雄膜过滤，现配现用。
实施例27双歧杆菌深层冷冻发酵剂的制备及应用
(1) 菌株培养将保藏的动物双歧杆菌BBMN01 (保藏于中国农业大学)传代两次恢复活力，镜 检培养液菌株形态，将活化菌株以107cfu/mL接种于NPNL培养基，恒p朋.8厌氧培养12。
所述NPNL培养基由下述组分组成牛肉浸汁粉3g/L,蛋白胨10g/L,胰蛋白胨5g/L，植胨3g/L， 酵母浸出汁5g/L,牛肝浸粉10g/L，葡萄糖10g/L，可溶性淀粉0.5g/L,溶液A 10ml/L,溶液B 5ml/L， 吐温80 lg/L,盐酸半胱氨酸盐0.5g/L。
所述A液由下述組分组成KH2P04 100g/L， K2HP04 100g/L。
所述B液由T述组分组成MgS04.7H20 2g/L， FeS04.7H20 2g/L, Nacl 2g/L MnS04l. g/L。
(2) 收集菌体将(1)得到菌液5000rpm， 15min离心得到菌体，收集菌泥。
(3) 添加保护剂 双歧杆菌深层冷冻保护剂组成为实施例18所述。
将收集的菌体，加入1/5原菌液体积的上述保护剂，搅拌混匀，得到浓縮菌体悬浮液，迅速与-8(TC 冷冻保藏。
(4) 发酵剂用亍酸奶发酵
上述制得的发酵剂与传统发酵剂同时接种12%的脱脂乳，42'C发酵至酸奶凝固，4'C保藏，测定保藏期
间双歧杆菌菌数。图3为酸奶n藏期间活菌数变化。
上述酸奶中双歧杆菌活菌计数使用双歧杆菌选择性计数培养基。
双歧杆菌选择性计数培养基组成为牛肉浸汁粉3g/L，蛋白胨10g/L，胰蛋白胨5g/L，植胨3g/L, 酵母浸出汁5g/L,牛肝浸粉10g/L，葡萄糖10g/L,可溶性淀粉0.5g/L，溶液A 10ml/L，溶液B 5ml/L, C液40ml/L,吐温80 1g/L，盐酸半胱氨酸盐0.5/L，琼脂15g/L。
所述A液由下述组分组成KH2P04 100g/L， K2HP04 100g/L。
9所述B液由下述组分组成MgS04.7H20 2g/L,， FeS04 .7H20 2g/L,， Nacl 2g/L ， MnS041.3g/L。 所述溶液C组成为硫酸巴龙霉素100mg，硫酸新霉素400mg ，丙酸钠15g ，氯化锂3g，置于40ml 无菌水，0.45um微孔滤膜过滤，现配现用。
权利要求
1、一种用于制备双歧杆菌深层冷冻发酵剂的复合保护剂，其特征在于该保护剂由下述重量份的组分组成脱脂乳6％-16％；海藻糖2.5％-7.5％；果糖2.5％-7.5％；甘油1％-4％；Vc0.01％-0.1％；L-Glu0.01％-0.1％；其余为水。
2、根据权利要求1所述的用于制备双歧杆菌深层冷冻发酵剂的复合保护剂，其特征在于该保护剂由 下述重量份的组分组成:.脱脂乳8%;海藻糖5%;果糖5%;甘油3%; VcO.05%; L-GluO.05%;其余为水。
3、 一种双歧杆菌深层冷冻直投发酵剂，其特征在于在双歧杆菌菌体中加入如权利要求1-2中任一所述的复合保护剂后，经深层冷冻得到。
4、 根据权利要求3所述的双歧杆菌深层冷冻直投发酵剂，其特征在于，其制备方法为(1)将双歧杆菌接种到玉米浆干粉培养基或NPNL培养基或MRS培养基中，于37'C, p朋.5-PH7. 0下 厌氧培养15-24h，离心，邻00rpm-8000rpm, 8-20min收集菌体；(2)将收集的菌体加入1/20-1/5原菌液体积的上述复合保护剂，搅拌混匀，得到浓缩菌体悬浮液， 迅速于-8(TC下冷冻保藏。
5、 根据权利要求4所述的双歧杆菌深层冷冻直投发酵剂，其特征在于所述玉米浆千粉培养基 由下述组分制成玉米浆干粉55g/L,葡萄糖10g/L， L半胱氨酸盐酸盐0. 05g/L， A液10mL/L, B液5ml/L;所述A液由下述组分组成KH2P04 100g/L， K2HP04 100g/L;所述B液由下述组分组成MgS04.7H20 2g/L,， FeS04 .7H20 2g/L,， Nacl2g/L，， MnS041.3g/L。
6、 根据权利要求4所述的双歧杆菌深层冷冻直投发酵剂，其特征在于所述NPNL培养基由下述组 分组成牛肉浸汁粉3g/L，蛋白胨10g/L，胰蛋白胨5g/L，植胨3g/L，酵母浸出汁5g/L，牛肝浸粉 10g/L,葡萄糖10g/L,可溶性淀粉0.5g/L，溶液A 10ml/L,溶液B 5ml/L，吐温80 lg/L，盐酸半胱氨 酸盐0.5g/L。所述A液由下述组分组成KH2P04 100g/L, K2HP04 100g/L;所述B液由下述组分组成MgS04.7H20 2g/L, FeS04.7H20 2g/L, Nacl 2g/L， MnS041.3g/L。
7、 根据权利要求4所述的双歧杆菌深层冷冻直投发酵剂，其特征在于所述MRS培养基由下述组 分组成蛋白胨10g/L,'牛肉膏10g/L,酵母粉5g/L,葡萄糖20gZL,醋酸钠5g/L，柠檬酸二铵2 g/L， KH2P042g/,吐温80 lg/L，硫酸镁0.58g/L,硫酸锰0. 28g/L,盐酸半胱氨酸盐0.5g/L。 '
8、 如权利要求3-7任一项所述的双歧杆菌深层冷冻直投发酵剂在发酵酸奶中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种双歧杆菌深层冷冻发酵剂及其冷冻保护剂。通过高密度培养得到双歧杆菌菌体，离心收集菌泥，并利用优选复配保护剂重悬菌体，于-80℃深层冷冻保藏，有效的保持了双歧杆菌的菌数和功能特性。本发明的双歧杆菌深层冷冻发酵剂作为一种辅助发酵剂，对于益生菌有效应用于乳品发酵有显著效果。
文档编号A23C9/12GK101606552SQ20091013651
公开日2009年12月23日 申请日期2009年5月6日 优先权日2009年5月6日
发明者任发政, 刘松玲, 刘爱萍, 明 张, 杨海莺, 田寒友, 蒋菁莉, 亮 赵 申请人:任发政