完全不动精子的生育力保存方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种精子生育力保存的方法，尤其是一种完全不动精子的生育力保存方法。
【背景技术】
[0002]目前，精液冷冻保存技术已有200多年的历史。人的精液冷冻保存可以追溯到20世纪40年代末。精液冷冻保存在我国主要应用于人类精子库以及生育能力的保存。国内外研究者通过几十年对精液冷冻程序、冷冻稀释液、解冻液等的筛选，已经建立了较为成熟的精液冷冻保存体系。全国各生殖中心对人精液冷冻保护剂的需求量比较大，而市场上人精液冷冻保存剂几乎全部被国外的生物公司所垄断，国内只有部分科研院所自行配置畜禽精液冷冻保护剂。国内还没有自行开发的人类精液冷冻保护剂应用于临床，并且现有的商品化的人类精液冷冻保存系统适合于人的正常精液，对少弱精的保存效果并不理想。
[0003]精子冷冻是保存男性生育力最有效的方法，已成为人类辅助生殖技术(ART)中必不可少的技术。许多研究表明，来源于射出、附睾穿刺(PESA)和睾丸穿刺(TESA)的精子经冷冻保存及卵胞浆内单精子注射(ICSI)后能获得与新鲜精子相似的临床结局。传统的观点认为，精子冷冻保存的前提需要有运动的精子。但是，对于完全不运动的精子是否有冷冻保存价值尚不清楚。
[0004]ICSI技术是目前治疗严重男性不育的理想手段。有报道，应用不运动精子行ICSI后可获得临床妊娠并生下健康后代，然而，其受精率、胚胎发育潜能明显低于活动精子。进一步研究证实，不运动精子并不表明其已经死亡，其存活的精子仍具有正常的受精能力。这提示，ICSI的基础是需要有存活的精子。那么，如何快速、准确、高效及安全地鉴别完全不动精子中的存活状态以确定是否适合冷冻保存及解冻后如何选择存活精子进行受精是关键。WHO第5版《人类精液检查与处理操作手册》中推荐低渗肿胀试验和伊红染色用于诊断性评估精子的活力。然而，这两种方法存在不足之处，前者操作较繁琐且不适用于冷冻-解冻的精子，后者经染色后即使鉴定为存活精子也无法再用于受精。进一步研究发现，应用激光照射精子尾膜时，存活的精子产生突然的应急反应，精子尾部卷曲，而死精子无这种现象，并且其应用在新鲜和冻融后的完全不动精子均有相似的现象。进一步研究证明，激光照射精子尾部对精子头部DNA并无损伤，并且精子尾部在受精过程中没有实质的意义。这提示，激光可能是一种安全有效地鉴别不动精子存活状态的有效方法。
[0005]传统的观点认为，只有运动的精子适合冷冻保存。然而，有些不育患者精子的活动率极低，甚至所有的精子都完全不运动，多见于精子原纤毛不动症和睾丸手术取精的患者。对于前者，临床上常规的处理是丢弃射出的完全不动精子，择期改行睾丸穿刺取精尝试寻找活动精子。对于后者，如果穿刺出来的是完全不动精子也极有可能被废弃，择期再行睾丸穿刺术。重复穿刺势必增加了患者远期并发症发生的机会和经济负担，因此，如何有效地保存这些患者生育力是值得深思的问题。
[0006]常规的精子冷冻方法使用2ml的冷冻管，精液与冷冻液按I: I比例稀释后经液氮熏蒸后再投入液氮冷冻保存。由于冷冻过程中细胞内冰晶形成等因素会导致一定程度的精子损伤，采用目前传统的冷冻方法冻存稀少精子复苏率及回收率较低，复苏后精子细胞膜损伤严重，导致无法用于后续的辅助生殖治疗。也有一些报道利用人类和小鼠的空透明带冷冻稀少精子，但人卵透明带较难获得，且可能存在污染的问题，难以推广应用。冷冻环也有被应用于稀少精子冷冻，但精子加载难度较大。临床上，往往有些患者获取的精子活力甚微，甚至完全不动。因此，需迫切寻求一种稳定、高效的冷冻完全不动精子症患者生育力的方法。
[0007]理论基础:
[0008]精子膜完整性与精子代谢、顶体反应、精子获能及精卵融合密切相关。此外，精子膜功能完整性还与受精卵着床、胚胎植入密切相关。精子尾部细胞膜属于半透膜，具有自动调节膜内外渗透压平衡的能力。激光具有热效应，当低能量激光射击活动精子尾部时，由于局部温度升高很可能发生蛋白质变性而导致精子尾部细胞膜的流动性、通透性改变。当激光照射精子尾膜时，热效应使精子尾膜内外的渗透压不平衡，活精子的细胞膜处于完整的状态，具备调节细胞膜内外渗透压平衡的能力，水分子可由膜外进入膜内；而死精子尾膜的通透性发生改变，丧失调节膜内外渗透压的能力，水分子无法进入膜内。激光的这一特性为胚胎学家从完全不动精子中鉴别有活力精子用于ICSI提供了新思路。
[0009]人类精子在冷冻过程中需经过与冷冻保护剂混合、冷冻预降温、超低温储存以及解冻复温等过程。这期间经历的理化效应直接作用于精子影响精子的复苏率。影响精子冷冻和复苏的主要原因:一是细胞内冰晶的形成，二是溶质性损伤。-5°C?-80°C是细胞内冰晶形成的危险温区，冰晶的形成损伤精子细胞膜和细胞器，甚至导致细胞死亡。细胞外结冰可导致细胞内外呈高渗状态而导致细胞损伤，即溶质性损伤。在冷冻过程中，液体可以形成晶体和玻璃体两种状态。液体在冷冻过程中究竟以何种状态固化，主要由其本身的性质以及冷冻过程中的降温速率决定。玻璃化冷冻中，由于冷冻液体积较小，所以降温十分迅速。在急速冷却过程中，液体的粘度增加，当粘度达到临界值时即发生凝固化，形成不规则的玻璃样固体，呈透明状态，有效避免细胞内外冰晶的形成。要实现玻璃化降温必须要迅速，这就要求冷冻液的体积要尽可能的小，并且冷冻载体的导热性能要好。因此，只需微量冷冻液的玻璃化冷冻方法可以最大限度地减少精子冷冻-解冻过程中的冷冻损伤。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供一种完全不动精子的生育力保存方法。
[0011 ]为解决上述技术问题，本发明的技术方案是:
[0012]这种完全不动精子的生育力保存方法，由以下步骤构成:
[0013]①完全不动精子冷冻方法:
[0014]收集完全不动精子后，取小部分出来，用激光鉴定如有存活的精子即判为可冷冻保存，若无存活精子，则废弃;将剩余精液吸至100?200yL(微升)，放入专用微量精子冷冻管内，直接用低转速的离心机离心；离心后去除上清液，然后再加入与精子沉淀1:1体积的精子冷冻液，混匀，使最终悬液的总体积为1yL;将装有精子悬液的冷冻管置于距液氮面2-3cm处，熏蒸3?5min，然后直接投入液氮中冷冻保存;解冻时，直接将冷冻管投入到预热好的37°C的水浴中，放置1min;最后将精子悬液吸出，放置于培养皿中，加入少许培养液稀释后备ICSI即卵胞浆内单精子注射；
[0015]②完全不动精子冷冻前、后精子存活状态的评估:
[0016]将获取的不动精子加入到Quinn’s-1020即受精液操作皿中，在视野下选择形态较好的精子，在精子尾部靠近尾巴尖端处，用1.48μπι(微米)的二极管激光束照射精子尾部中下段，照射时间为2ms(毫秒)，如果激光射击后，精子尾部立即出现明显的卷尾现象，则判定为存活精子，对激光射击无反应不发生卷尾的为死精子;冷冻前和复苏后分别计算不动精子的存活率，以冷冻后的存活指数，来评价完全不活动精子的冷冻效果；
[0017]对完全不动精子的微量冷冻，其最终精子冷冻悬液的总体积仅为1yL;
[0018]上述的对完全不动精子冷冻前、冷冻后的存活情况应用激光进行鉴定。
[0019]存活指数是冷冻后的存活率/冷冻前的精子存活率。
[0020]有益效果:
[0021]本发明首次证明完全不运动精子是可以冷冻保存的，冷冻后这些精子具有正常的体外受精能力；同时，建立了高效冷冻保存这部分特殊群体生育力的方法，这为完全不动精子症患者生育力保存提供新视野。
[0022]应用本发明所述的方法，收集射出和睾丸穿刺获取的完全不动精子经冷冻复苏后仍获得较高的存活率，总体的精子存活指数为0.83ο用激光筛选存活但完全不动的冷冻精子进行卵胞浆内单精子注射后能获得与新鲜不动