，打开冻干管菌种，其中冻干管菌种包括：双歧杆菌（菌号： CGTMCC-1.2212，中国普通微生物菌种保藏管理中心）， 短双歧杆菌(菌号:CGTMCC- 1.2213，中国普通微生物菌种保藏管理中心），婴儿双岐杆 菌（菌号：CGTMCC -1.2202，中国普通微生物菌种保藏管理中心），鼠李糖乳杆菌（菌号： CICC一6065，中国工业微生物菌种保藏管理中心），将所述的4株菌种内分别加入以上灭菌 的试管培养基lml，摇动溶化后得到冻干管菌悬液备用，再将所述的4支冻干管菌悬液分别 各取lml加入至4支试管培养基中进行密封后放摇瓶机摇动制得扩大菌种液。3. 根据权利要求1所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特征在 于，所述的一级种子培养基培养中各组分为： 核桃仁20克、花生仁20克、酪蛋白酸钠10克、L一精氨酸5克、番茄粉6克、牛肉膏8克、酵 母浸粉3克、蛋白胨3克、柠檬酸胺0.15克、丝氨酸0.8克、葡萄糖酸0.4克、氯化钠3克、乳糖10 克、葡萄糖15克、乙酸钠6克、无水氯化钙0.1克、磷酸氢二钾2克、50万单位脂肪酶10克、10万 单位无花果酶10克、自来水1000毫升，PH自然； 将所述一级种子培养基中的核桃仁、花生仁、酪蛋白酸奶、无水氯化钙加入所述600毫 升的水中进行研磨至浆状，过滤后得到浆液，然后再所得浆液中加入400毫升水并加热到53 °C~57°C并进行搅拌，在搅拌下加入脂肪酶进行酶解，酶解后再加入无花果酶进行酶解得到 酶解液，然后向酶解液中加入其他原料，进行搅拌熔化得到一级种子培养液； 将所述的一级种子培养液量取所用量加入到三角瓶中封口后灭菌，将装有经过灭菌的 培养液的三角瓶放超净工作台中降温，当温度降到31°C~37°C，在无菌条件下将所述培养好 的扩大菌种液接到三角瓶中，即l〇〇ml-级种子培养液接入的扩大菌种液为4ml，完毕后放 摇瓶机中，得到一级菌种液。4. 根据权利要求1所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特征在 于，所述的种子罐培养包括以下步骤： 将种子罐及发酵罐进行空罐灭菌处理； 其中种子罐培养基中各组分的重量比为： 核桃仁1.5%、花生仁1.5%、酪蛋白酸钠0.2%、L一精氨酸0.3%、番茄粉0.2%、牛肉膏 〇. 4%、蛋白胨0.2%、丁酸钙0.5%、柠檬酸胺0.02%、丝氨酸0.04%、葡萄糖酸0.5%、氯化钠0.3%、 乳糖0.5%、葡萄糖1%、乙酸钠0.3%、无水氯化钙0.03%、可溶性淀粉0.3%、50万单位脂肪酶1%、 10万单位无花果酶1%、磷酸氢二钾0.2%、聚醚消泡剂0.01%、自来水90%，PH自然； 将所述的种子罐培养基配方中的核桃仁、花生仁、酪蛋白酸钠、无水氯化钙加入20公斤 的水中进行研磨至浆状，过滤后得到浆液，然后将浆液加热到53°C~57°C进行搅拌，在搅拌 中加入脂肪酶进行酶解，再加入无花果酶进行酶解得到酶解液，将所述的酶解液、剩余量的 水和原料不分先后顺序的投入种子罐并进行搅拌，然后经过高温灭菌及降温处理后，将所 述培养好的一级菌种液在无菌条件下接种到经灭菌处理的种子罐中，接种量分别是罐内 种子培养基的2%，然后盖好罐上的接种帽，通过无菌通风培养制得种子罐菌种液。5. 根据权利要求1所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特征在 于，所述的发酵液制备包括以下步骤： 将发酵设备的管道、无菌空气过滤系统进行灭菌处理； 发酵罐培养： 种子罐培养基配方中各组分的重量百分比为： 核桃仁2.5%、花生仁2.5%、酪蛋白酸钠0.3%、L一精氨酸0.3%、磷酸氢二钾0.2%、番茄粉 0.2%、卷心菜粉0.1%、牛肉膏0.5%、酵母浸粉0.2%、蛋白胨1%、丁酸钙0.5%、快速渗透剂T 0.2%、柠檬酸胺0.2%、丝氨酸0.1%、葡萄糖酸0.6%、氯化钠0.3%、乳糖2%、葡萄糖2%、乙酸钠 0.7%、可溶性淀粉0.2%、无水氯化钙0.1%、50万单位脂肪酶1%、10万单位无花果酶1%、聚醚消 泡剂0 · 1%、自来水83 · 2%，PH自然； 制备发酵罐培养基:首先将所述发酵罐培养基配方中的水投入到经灭菌处理的发酵罐 中，然后开动搅拌机，向搅拌罐中加入核桃仁、花生仁、酪蛋白酸奶和无水氯化钙进行搅拌 并过滤收集浆液，将浆液加热至53°C ~57°C后在搅拌下加入脂肪酶进行酶解后再加入无花 果酶进行酶解得到酶解液，将所述的酶解液和余量的水投入至灭菌的发酵罐并加入余量的 原料进行搅拌，经过高温灭菌及降温处理后，得到发酵罐培养基； 制备诱导液:将丁酸钙、快速渗透剂T、乳糖放至20kg中的自来水中进行搅拌溶化后得 到诱导液； 接种:通过差压法将种子罐菌种送至发酵罐中，将所述发酵罐培养基接入种子罐菌中， 其中接种量是每l〇〇kg发酵罐培养基接入种子罐菌种8kg，并在接种过程中加入诱导液进行 诱导，得到发酵液； 收集湿菌泥:开动管式离心机，调整转速8000转/分钟，以每分钟进料20公斤的进料速 度进行例行，弃上清，收集湿菌泥，然后进行二次离心，转速为13000/分钟，弃上清，收集湿 菌泥。6. 根据权利要求2所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特征在 于，其中所述扩大菌种液是在31_37°C的温度下，采用150-210转/分钟的转速，在摇瓶机中 摇动24~30小时制得。7. 根据权利要求3所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特征在 于，其中所述一级菌种液是在31-37°C的温度下，采用摇瓶机在150-210转/每分钟的转速 下，摇动12 -28小时制得。8. 根据权利要求4所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特征在 于，其中所述通过无菌通风培养制得种子罐菌种液的过程中，无菌空气用量为每100公斤种 子培养基每分钟用无菌空气0.05立方，PH值自然，搅拌速度80-180转/每分钟，罐压0.05兆 帕，温度31 _37°C，培养时间20~24小时。9. 根据权利要求5所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特征在 于，所述的发酵培养的培养条件为:温度31-37°C、80-140转/每分钟，通风量每100公斤培 养液每分钟通入氮气0.1立方米，通入时间为3小时，PH值自然，发酵时间为30-40小时结 束。10. 根据权利要求2或3所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特 征在于，所述的制备试管培养基过程中的酶解液和制备一级种子培养液过程中的酶解液的 制备是通过过滤后的浆液中加入50万单位的脂肪酶10g酶解10~30分钟，再加入10万单位的 无花果酶l〇g酶解20~70分钟得到。11. 根据权利要求4或5所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特 征在于，所述的制备种子培养基过程中酶解液和制备发酵罐培养基过程中酶解液的制备是 通过过滤后浆液中加入50万单位的脂肪1000g，酶解10~40分钟，再加入10万单位的无花果 酶1000g，酶解20~70分钟得到。12. 根据权利要求1所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特征在 于，所述的步骤中还包括湿菌泥的冷冻干燥，其中冷冻干燥还包括悬菌液的制备和真空干 燥，其中悬菌液的制备包括取湿菌泥并加入无菌蒸馏水加热至60~65°C，并搅拌并加入麦芽 糊精，溶化后再加入水、脱脂奶粉、乳糖、甘油，在30~40°C的条件下搅拌1~2小时，得到悬菌 液，然后将悬菌液放入恒温室中恒温60分钟进行预冻； 其中真空干燥步骤为将预冻好的料盘放入真空干燥室进行抽真空干燥，并且干燥条件 为真空度为10~15pa，温度为-50°C，干燥室温度为32°C，干燥时间为55小时，冻干完毕后收 集冻干料。13. 根据权利要求1所述的一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺，其特征在 于，所述的混合发酵菌的形式包括囊剂、粉剂、片剂、膏剂、液体、奶制品，所述的粉剂包括用 无菌粉碎机将冻干料粉碎成细度为80目的粉菌;所述的囊剂的复配包括将冻干料粉碎成细 度为80目的菌粉10g，与代谢物干燥粉15g、微晶纤维素20g、硅胶粉20g、乳糖10g，硬脂酸镁 15g、L-谷氨酰胺10g放入固体搅拌混合机中混合均匀，在无菌条件下分装入胶囊;所述的膏 剂包括粉菌进行低温浓缩后的膏状物。14. 一种利用权利要求1~12的工艺制备的双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌的运用，其特征 在于，所述的双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌可以运用在农作物的培育中，将双歧杆菌乳酸菌 混合发酵菌按1:3000倍稀释后喷施在黄瓜、茄子的开花到收获的生长过程;可将双歧杆菌 乳酸菌混合发酵菌按1:5000倍的稀释后浇灌于果树的根本。
【专利摘要】本发明涉及生物菌领域，具体为一种双歧杆菌乳酸菌混合发酵菌酶解法制备工艺及其运用；步骤包括：制备扩大菌种液和一级种子培养液得到一级菌种液，再将一级菌种液与种子培养基在种子罐混合培养得到种子罐菌种，再将所述的种子罐菌种与发酵罐培养基混合培养并通过诱导液进行发酵得到发酵液，当发酵完毕后，进行发酵液离心，得到湿菌泥，其中湿菌泥即为双歧杆菌乳酸菌的混合发酵菌泥；通过本发明制备出的双歧杆菌混合菌具有菌的活性高，保质期时间长，最大程度的使双歧杆菌产生更多的有效物质，避免了双歧杆菌受到氧气、水分、光线、保护基质等条件的影响。
【IPC分类】C12R1/225, C12N1/20, A01N63/02, A01P3/00, C12R1/01
【公开号】CN105567590
【申请号】CN201511007402
【发明人】张起凡, 曹崇仁, 朱友峰
【申请人】山东环亿生物科技有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年12月30日