一种低温生防菌剂及其固态发酵方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物肥料领域，具体是一种低温生防菌剂及其固态发酵方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 植物病害是影响农业生产的自然灾害之一，对植物病害的防治有三种途径:化学 防治、物理防治、生物防治。三种方法各有其优缺点，化学防治见效快、杀菌广、成本低，可长 期使用会导致土壤、大气等环境污染，而且存在食品安全问题，一些化学杀菌剂在许多发达 国家和地区已被严格限制使用;物理防治安全环保，可效率低、成本高、费时费工;生物防治 作为一种高效且无毒、无害、无污染、不产生抗药性的植物病害防治方法，不仅符合人们对 绿色食品的需求，而且为农业可持续发展提供了保障。因此，生防菌剂越来越受到科研人员 以及广大种植者的重视。
[0003] 生物防治是指利用有益微生物或微生物代谢产物对植物病害进行有效防治的技 术与方法，其实质是利用微生物中间或种内的抗生、竞争、重寄生、溶菌作用，或者通过微生 物代谢产物诱导植物抗病等，来抑制某些病原物的存活或活动。目前，有许多有益微生物产 品已在农业种植中得到运用，如苏云金芽胞杆菌菌剂、枯草芽胞杆菌菌剂、多菌灵、克线灵 等。生防菌剂在实际应用中会受到诸多外界因素影响或制约，如光照、温度、湿度、土壤pH值 等，从而导致不能起到很明显的防治病虫害的作用。
[0004] 在我国北方地区或南方冬季温度低下，一般微生物生长代谢活动明显受到温度的 抑制，具备生物防治功能的菌剂此刻因受到温度的影响而不能发挥生物防治的功能。开发 和生产低温生防菌剂可避免菌剂的应用受到天气温度的制约，扩大生物防治的应用范围， 具有十分重要的现实意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对现状，提供一种低温生防菌剂及其固态发酵方法和应用。
[0006] 本发明提供的一种低温生防菌剂，其有效成分为假单胞菌VT-B5,有效活菌素为 1.0X101Qcfu/g及以上。
[0007] 本发明所述假单胞菌VT_B5(Pseudomonas sp)可从北京沃土天地生物科技股份有 限公司购买得到。
[0008] 本发明还提供制备所述低温生防菌剂的固态发酵方法，包括如下步骤：
[0009] 1)菌种活化；
[0010] 2) -级种子液制备:将假单胞菌VT-B5接种至液体培养基进行一级种子液制备；
[0011] 3)二级种子液制备：以糖蜜培养基进行假单胞菌VT-B5二级种子液制备；
[0012] 4)固态发酵:利用以麦麸、豆柏和谷壳为主要原料的固态发酵培养基，接种假单胞 菌VT-B5二级种子液进行固态发酵，制备低温微生物菌剂；
[0013] 5)发酵产物经干燥处理后添加稳定剂和助剂，粉碎、包装，得到低温生防菌剂。
[0014]其中，所述以麦麸、豆柏和谷壳为主要原料的固态发酵培养基，由如下重量份的原 料混合而成:豆柏400份、麦麸300份、谷壳100份、葡萄糖50份、磷酸二氢钾5份、硫酸铵10份、 甘油10份、水750~850份。
[0015]其中，所述糖蜜培养基，由如下重量份的原料制成:糖蜜30.0份、玉米浆粉20.0份、 磷酸二氢钾〇. 5份、氯化钠4.0份、七水硫酸镁0.2份、硫酸锰0.05份，水1000.0份。
[0016]本发明制备所述低温生防菌剂的固态发酵方法，具体步骤为：
[0017] 1)菌种活化:将假单胞菌VT-B5接种至NA固体培养基斜面，于20~25°C条件下培养 1~2天；
[0018] 2)-级种子液制备:将步骤1)培养得到的单菌落接种于50mL/250mL NA液体培养 基，20 °C~25 °C、120~170r/min培养至0D6QQ值3 · 0-4 · 0，制得一级种子液；
[0019] 3)二级种子液制备:将一级种子液按体积质量比2.0%~3.0%的接种量接种至糖 蜜培养基中，20 °C~25 °C、150~200r/min，通气量1 · 2~1 · 5VVM培养至0D6QQ值3 · 0-4 · 0，制得 二级种子液；
[0020] 4)固态发酵:将二级种子液按3.0 %~4.0 %的体积质量比接种到以麦麸、豆柏和 谷壳为主要原料的固态发酵培养基上，于20 °C~25 °C、相对湿度为60 %~80 %条件下，静态 培养2~3天，得到固态低温菌产物；
[0021] 5)后处理:将固态低温菌产物低温干燥后粉碎，粉碎同时添加稳定剂和助剂，混 匀，包装，得到低温生防菌剂。
[0022]其中，所述NA固体培养基，由如下重量份的原料制成：蛋白胨10.0份、牛肉膏5.0 份、氯化钠5.0份，水1000.0份。
[0023]其中，所述NA液体培养基，由如下重量份的原料制成：蛋白胨10.0份、牛肉膏5.0 份、氯化钠5.0份、琼脂15~20份，水1000.0份。
[0024] 其中，所述NA固体培养基和NA液体培养基的pH值范围均为7.0-7.4。
[0025] 其中，所述稳定剂和助剂为微生物菌剂常用稳定剂和助剂，例如:甘油、甘露醇、聚 乙烯醇、山梨醇中的一种或多种。稳定剂和助剂的添加量为常规添加量，一般为质量百分含 量 0.5% ~3%〇
[0026] 其中，步骤2)、步骤3)所述培养的时间均为1~2天。
[0027] 其中，步骤3)所用糖蜜培养基，先在115°C~125°C高温高压灭菌20~30min，冷却 后使用。
[0028]其中，步骤4)所用固态发酵培养基，初始质量百分含水量为50%~55%，初始pH为 6.5~7.0,经115 °C~125 °C高温高压灭菌40~60min，冷却后使用。
[0029] 其中，步骤5)所述低温干燥为40°C~50°C低温干燥至质量百分含水量10%。
[0030] 本发明还提供所述低温生防菌剂在作为在作物种植过程中与基肥同用(沟施或穴 施或撒施)或作追肥使用。用量为5~10kg/亩，可根据不同的作物和土壤肥力，酌情增减。物 种植中的应用。
[0031] 所述应用具体
[0032] 本发明还提供所述制备低温生防菌剂的固态发酵方法在微生物菌剂生产中的应 用。
[0033]本发明的优点在于：
[0034]本发明所述的低温生防菌剂固态发酵生产工艺稳定，环境友好，产品有效活菌数 高。该低温生防菌剂可在南方冬季或北方全年作物种植时使用，能在低温条件下繁殖及生 长代谢，定植于作物根际，通过产生多种抗生素作用于其他微生物，调节植物根圈环境中的 微生物区系，改善微生态环境，减少病害的发生，促进植物生长，提高作物抗逆性，增产保 收。
【具体实施方式】
[0035]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0036]实施例1低温生防菌剂的固态发酵生产 [0037]按如下配方配制各种培养基：
[0038] NA固体培养基:蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、氯化钠5.0g，纯水1.0L，pH值7.0-7.4。 [0039] NA液体培养基：蛋白胨lO.Og、牛肉膏5.0g、氯化钠5 · 0g、琼脂15~20g，纯水1 · 0L， pH{t7.0-7.4〇
[0040]糖蜜培养基:糖蜜30.0g、玉米浆粉20.0g、磷酸二氢钾0.5g、氯化钠4.0g、七水硫酸 镁0 · 2g、硫酸锰0· 05g，纯水1 · 0L。
[00411固态发酵培养基:豆柏400g、麦麸300g、谷壳100g、葡萄糖50g、磷酸二氢钾5g、硫酸 铵10g、甘油10g、水0.750~0.850L，混合均匀。
[0042] 1)菌种活化:无菌条件下，将假单胞菌VT-B5接种至NA培养基斜面，于22°C条件下 培养2天；
[0043] 2)-级种子液制备:将步骤1)培养的菌种于无菌条件下分别挑取菌落形态优良的 单菌落接种于50mL/250mL NA液体培养基，放置22°C、160r/min恒温振荡摇床中培养2天。菌 种液体培养〇D6〇〇值