果，CK为稻瘟病菌；B为菌株JN005的代谢产物对稻瘟病菌菌丝生长抑制效果，CK为稻瘟病 菌。
【具体实施方式】
[0023] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0024] 实施例1枯草芽孢杆菌JN005的分离获得
[0025] 从湖南省桃江县大栗港镇牌形上村（N28° 3P 49. 02"，Ε11Γ 5V 24. 86") 感稻瘟病水稻品种湘早籼24号的病丛中选取健康稻株，共分尚出871株菌株，米用与稻瘟 病菌平板对峙法筛选出1株对稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae)菌丝抑制率达84%的诘抗 菌 JN005。
[0026] 通过在NA固体培养基（蛋白胨5g/L，牛肉浸膏3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂17g/L， pH 7. 0,蒸馏水配制）平板上培养菌株JN005(图2A和图2B)，对其菌落形态进行观察，对其 菌体的扫描电镜图观察，并结合该菌的生理生化、微生物学检测结果，以及16S rDNA测序结 果（见SEQ ID NO. 1)，最终确定菌株JN005为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)。
[0027] 此外，采用平板对峙培养法发现菌株JN005对多种病原指示菌具有抑制效果（图 3) ，例如禾谷镜刀菌（Fusarium graminearum)、稻曲病菌（Ustiloginoidea virens)、辣椒 炭疽病菌（0〇1161:〇1：1'；[(31111111810608。01'；[0丨(168)的抑菌率分别为70.1%、73.6%和62.5%。
[0028] 实施例2枯草芽孢杆菌JN005在水稻稻瘟病防治中的应用
[0029] 菌株JN005在NA固体培养基平板上活化后，用打孔器打取直径5mm的2个菌饼接 入装有150mL NB液体培养基（蛋白胨5g/L，牛肉浸膏3g/L，葡萄糖20g/L，pH 7. 0,蒸馏水 配制）的250mL三角瓶中，28°C、180r/min条件在摇床中振荡培养6d，用细菌过滤器过滤， 获得枯草芽孢杆菌JN005代谢产物。
[0030] 将菌株JN005代谢产物IOmL和稻瘟病菌（81号菌株）分生孢子液0.1 mL加入灭 菌的三角瓶中，混匀，以无菌水代替拮抗菌培养液为对照，27°C黑暗培养，6h镜检孢子萌发 情况，实验重复3次。结果表明JN005代谢产物对稻瘟病菌孢子萌发抑制率为62. 15%。菌 株JN005采用与稻瘟病菌平板对峙法培养，其对稻瘟病菌81号菌株菌丝抑制率达84% (图 4) 〇
[0031] 温室盆栽试验包括JN005菌株代谢产物和不同浓度活体菌对水稻高感稻瘟病品 种湘晚籼12号的稻瘟病防治效果试验两部分，试验在组培控温光照培养室内进行。
[0032] JN005菌株代谢产物对水稻高感品种湘晚籼12号的稻瘟病防治效果评价：采用水 稻活体接种法接种稻瘟病菌分生孢子悬浮液（浓度为IX IO5个/mL)诱发稻瘟病。具体试 验包括3种处理方式，分别为：A组先喷稻瘟病菌孢子液，第3d喷代谢产物；B组先喷代谢 产物，Id后喷稻瘟病菌孢子液；C组将稻瘟病菌孢子液与代谢产物按1:1体积比混匀喷施。 设置清水和杀菌剂40%稻瘟灵EC(X500倍液）为对照，每种处理方式3钵，每钵30株。接 种后IOd对稻瘟病抗性进行分级调查和防治效果评价。
[0033] JN005活体菌对水稻高感品种湘晚籼12号的稻瘟病防治效果：采用喷雾法接种 稻瘟病菌（分生孢子浓度为IX IO5个/mL)诱发稻瘟病。将JN005活菌浓度梯度设计为： 5. 5X109cfu/mL、5. 5X108cfu/mL、5. 5X107cfu/mL、5. 5X106cfu/mL 共 4 个浓度梯度。试 验包括3种处理方式，分别为：A组接种稻瘟病菌孢子悬浮液前Id分别喷4个浓度梯度的 JN005菌株活菌液；B组接种稻瘟病菌孢子液前3d先分别喷4个浓度梯度的JN005菌株活 菌液；C组接种稻瘟病菌孢子液前5d先分别喷4个浓度梯度的JN005菌株活菌液；设置清 水和40%稻瘟灵EC(X500倍液）为对照，每种处理方式3钵，每钵30株。接种后IOd对稻 瘟病抗性进行分级调查和防治稻瘟病效果评价。
[0034] 温室盆栽试验结果：JN005菌株代谢产物对水稻高感品种湘晚籼12号的稻瘟病防 治效果见表1，JN005活体菌对水稻高感品种湘晚籼12号的稻瘟病防治效果见表2。
[0035] 表1 JN005菌株代谢产物对湘晚籼12号的稻瘟病防治效果
[0036]
[0037] 注：以上数据均为3次重复结果。
[0038] 表2 JN005活体菌对湘晚籼12号的稻瘟病防治效果
[0039]
[0040] 注：以上数据均为3次重复结果。
[0041] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)JN005,其保藏编号为 CCTCC No :M2015228。2. 由权利要求1所述枯草芽孢杆菌JN005制备的菌剂。3. 权利要求1所述枯草芽孢杆菌JN005或权利要求2所述菌剂在防治水稻稻瘟病中的 应用。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，其包括将如权利要求1所述的枯草芽孢杆 菌JN005或如权利要求2所述的菌剂施用于水稻作物。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述菌剂中枯草芽孢杆菌JN005的活菌浓 度彡 5. 5 X IO6CfVmL06. -种防治水稻稻瘟病的方法，其特征在于，其包括将如权利要求1所述的枯草芽孢 杆菌JN005的培养液进行离心，所得上清液施用于水稻作物，或将枯草芽孢杆菌JN005的活 体菌配制菌悬液施用于水稻作物。
【专利摘要】本发明公开了一株枯草芽孢杆菌JN005及其在防治水稻稻瘟病中的应用，菌株JN005的保藏编号为CCTCC No：M2015228。利用菌株JN005对水稻稻瘟病进行防治，避免了化学防治对环境和稻米安全的潜在不良影响及抗病品种利用的感病化风险。菌株JN005活体菌及其代谢产物对稻瘟病均有较好的防效，保护和治疗作用兼具，可将其作为活体菌剂和代谢产物的剂型加工开发。此外，菌株JN005对多种病原指示菌具有抑制效果。CCTCC NO:M201522820150414
【IPC分类】C12N1/20, A01N63/00, A01P3/00, C12R1/125, A01N63/02
【公开号】CN104974965
【申请号】CN201510426569
【发明人】刘二明, 任佐华, 管玲莉, 刘敏捷, 周鑫钰
【申请人】湖南农业大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年7月20日