专利名称：一种防治植物真菌病害的生防菌及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物农药技术领域。
背景技术：
21世纪人类面临着许多挑战，而主要问题之一是人口与粮食问题。我国人口占世界总人口的四分之一，但耕地只有世界耕地的6.8％，这个问题在我国尤其突出。因此，提高粮食产量是我国关系民生的战略任务。但据调查，世界主要粮食作物和经济作物每年因病害损失20％(Oerke et al，1994.Crop Protection andCrop Production.Elsevier，Amsterdam，808pp)。我国粮食作物因病害而损失至少10-15％，如果完全不使用杀菌剂，正常年份的黄瓜损失约为55％～75％、萝卜为40％、甘篮为25％、苹果为30％，甜菜为24％[陈万义，1998.植物保护24(5)33-36]。由此可见杀菌剂在粮食作物和经济作物中的重要地位。事实上，如果没有杀菌剂的使用，世界上的作物将有一半在现有条件下不能栽种。
目前农业生产上应用的杀菌剂多为化学合成物。化学合成杀菌剂虽具有防效较高和应用方便的优势，但存在如下缺点①抗性问题严重特别是植物病原真菌对内吸性杀菌剂的抗性产生的速度快、抗性水平高。一般应用3年左右，植物病原真菌就可对其产生抗性。据报道已有46种病原真菌对苯菌灵产生了较高的抗性(Gullino et al，2000.Crop Protection 191-11)。②研制新品种杀菌剂的费用昂贵由于对杀菌剂的要求越来越严格，新品种杀菌剂的研制费用也越来越大。在美国每研究开发成功一个新品种的杀菌剂需要研究20000多个化合物，花费约0.8～1亿美元(Leroux，1996，Pestic.Sci.47191-197)。③环境污染虽然化学合成杀菌剂较化学合成杀虫剂对人蓄的危害要小一些，但化学合成杀菌剂也有致癌作用，对野生和非靶标生物有毒等缺点，环境相容性差。因此，在推行的无公害农药和可持续农业生产的今天，开发和研制不易产生抗性的、较少引起污染的环境友好型生物杀菌剂已成为农药发展的必然趋势。
相对于化学合成杀菌剂，生物防治和天然产物的使用具有更加诱人的前景，特别是微生物杀菌剂，一方面微生物是地球上最庞大的生物类群，它不仅具有广泛的生物多样性，而且还可通过菌种选育、代谢调控、规模发酵以及其它现代生物工程技术大幅度提高目标物质的产量，易于实现工业化生产；另一方面，微生物杀菌剂(活的微生物及其代谢产物)较化学农药更加安全，易降解，合成成本较低。
内生菌(endophytes)是指生长在寄主体内不引起发病的一类特殊微生物，大量的研究证明内生菌通过产生次生代谢物质调节并增强宿主植物的环境适应能力，如固氮，抗旱、抗虫和抗病等(Chanway，1996.Can.J.Bot.75331-332；Wilsonet al.，1994.Mycologia 86635-647)。Fisher等(Fisher et al.，1984.Bot.Helv.94249-253)在进行内生菌生物活性检测时发现30％的内生菌都能产生抗真菌和/或细菌的物质；尤其是当美国的Stierle等(Stierle et al.，1993.Science 260214-216)从太平洋浆果紫杉中发现两株能够产生紫杉醇及其类似物的内生真菌后，使从内生菌次生产物中分离新型抑菌或杀菌先导化合物更有据可依[Petrini etal.1992，Sydowia，44282-293]。本发明将报道一株内生细菌——鲍曼氏不动杆菌LCH0606菌株的发现及其防病作用。
鲍曼氏不动杆菌是一种分布比较普遍的一种植物内生细菌，但对该菌的生物学功能研究甚少。有报道称该菌能够降解除草剂和石油污染，具有一定的环保作用(Roque et al.，2000.Scientia Agricola 57(4)723-728；Sarma et al.，2004.Can.J.Microbiol.50(6)405-414)。近年来发现该菌可用于柑桔溃疡病的防治(谭小艳等，2006，微生物学报46(2)292-296)。该发明从樟树茎干中分离到一株鲍曼氏不动杆菌菌株具有广谱的抗真菌活性。这些研究结果表明鲍曼氏不动杆菌具有丰富的种内多样性和广泛的生物活性，是一种很有开发潜力的生物农药，用于植物病害的防治。
发明内容
本发明的目的旨在探寻生物农药的新来源，利用植物内生菌资源而开发一种可以用于植物真菌病害防治的广谱、高效、可产业化生产的生防菌菌株。提供鲍曼氏不动杆菌LCH0606菌株以及该菌株的筛选、鉴定方法；提供该菌株产品鲍曼菌液和鲍曼菌素及其制备工艺；提供鲍曼菌液和鲍曼菌素防治植物病害以及促进水稻种子萌芽的使用方法。
本发明的具体技术方案如下本发明采用的细菌是鲍曼氏不动杆菌LCH0606菌株(Acinetobacterbaumannii LCH0606)(以下简称为LCH0606菌株)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2006年7月6日，保藏号为CGMCCNo.1752。
本发明的生产菌株LCH0606菌株分自我国江苏省紫金山地区的樟树茎干，经菌落和形态的显微观察、染色反应、常规生理生化特性实验以及16s rDNA序列分析，该菌株鉴定为鲍曼氏不动杆菌(A.baumannii)的一个新菌株(LCH0606)，具有以下特征①菌落规则圆形、边缘光滑、中部突起，不透明灰白色，菌落干燥；②菌体为短杆状或球杆状、革兰氏染色阴性、无芽孢和鞭毛；③生理生化反应表现为接触酶试验、精氨酸双水解酶试验、丙二酸盐利用试验、硝酸盐和亚硝酸盐还原试验均为阳性；氧化酶试验、明胶液化试验、尿素酶试验、苯丙氨酸脱氨酶试验均为阴性；能利用葡萄糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、木糖和鼠李糖，但不能利用蔗糖、麦芽糖、甘露醇和果糖；④16s rDNA序列分析结果在GenBank中进行最大同源性比较，发现16s rDNA测序结果与不动杆菌属16s rDNA序列同源性达到100％。
本发明的生防制剂为鲍曼菌液和鲍曼菌素，它们对多种重要植物真菌病害具有显著的防治作用，如大豆炭疽病、辣椒疫霉病、番茄灰霉病、小麦赤霉病及水稻纹枯病等，同时具备了工业化生产的基本性状。
本发明按照常规方法制备。即从樟树植株中分离筛选抑菌活性菌株LCH0606；通过液体发酵和离心处理制备生物杀菌剂——鲍曼菌液；鲍曼菌液经大孔树脂吸附、乙醇洗脱和减压浓缩处理制备高效生物杀菌剂——鲍曼菌素；鲍曼菌液或鲍曼菌素对大豆炭疽病、辣椒疫霉病、番茄灰霉病、小麦赤霉病及水稻纹枯病等致病菌的抑制作用通过平皿实验测定；鲍曼菌液或鲍曼菌素防治水稻纹枯病的活性通过盆栽实验证明；鲍曼菌液或鲍曼菌素对水稻种子萌芽的促进作用按常规方法进行；鲍曼菌液或鲍曼菌素抗菌成分的测定是通过硅胶柱层析和Sephadex LH-20反复层析所得，并经NMR、HSQC、DEPT、LC/MS等现代波谱技术鉴定为脂肽类物质IturinA2、A3、A6。
本发明的优点及效果本发明具有稳定的天然原料来源，菌种来源于樟树茎干，筛选方法简单；发酵过程中所用原料主要有马铃薯和蔗糖，成本较低；鲍曼菌液和鲍曼菌素的制备简单，鲍曼菌素经大孔树脂处理获得，处理量大，操作方便，适合大规模工业化生产。产品质量稳定，对光、热、酸碱均有良好的稳定性。本产品低毒，对人畜无毒害、对农作物无药害，绿色环保，且防治植物病害效果显著。
四
图1鲍曼菌液对植物病原真菌生长的抑制作用。测试菌种分别为1、C.parasitica；2、G.glycines；3、P.capsici；4、F.oxysporum；5、B.cinerea；6、F.graminearum；7、R.solani。图中A代表鲍曼菌液(浓度0.1ml/ml)，B代表鲍曼菌素(浓度0.1mg/ml)，C代表阴性对照，无菌水处理，D代表75％达克宁可湿性粉剂(浓度0.1mg/ml)，E代表含15％粉锈宁的三唑酮可湿性粉剂(浓度1mg/ml)，培养温度30℃，观察时间40h。
图2鲍曼菌素对水稻纹枯病的防治作用。水稻种子30℃催芽至根长1cm，于近根基部接种直径6mm的丝核菌丝菌饼，同时喷洒2ml不同溶液于接种部位，30℃保温保湿24h，然后移去菌饼，继续培养24h，观察不同处理褐根或黑根长度，评价对水稻纹枯病的控制效果。图中A为商用杀菌剂达克宁(阳性对照)，浓度为1mg/ml，B为灭菌水(阴性对照)，C为鲍曼菌液，D为鲍曼菌素，浓度为1mg/ml。
五具体实施例方式
下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一LCH0606菌株的分离、鉴定新鲜樟树茎干采自江苏南京紫金山，自来水洗净晾干后切成1cm左右的小段。依次浸入75％乙醇和40％甲醛溶液表面消毒各3min，然后用无菌水清洗3次，以除去表面污染杂菌，再用无菌剪刀将茎干纵向切开，切面朝下放于马铃薯蔗糖琼脂平板上，每平板5个茎段，共5块平板。30℃培养，逐天观察新菌落的出现，共7天，挑取单菌落，划线纯化。另外，在相同的马铃薯蔗糖培养基平板中放入2～3块未剪碎的茎或叶片作对照，检测表面灭菌是否彻底。所得菌株采用甘油保藏法于-80℃冰箱保藏备用。
将分离到的10株樟树茎干内生细菌分别接种于含4mL马铃薯蔗糖培养基的15mL试管中，37℃、100rpm摇床培养48h；培养液过滤除菌后取1mL与9mL溶化的马铃薯蔗糖培养基混匀，倒入直径为9cm的培养皿中，制成含发酵液10％的马铃薯蔗糖培养基平板，冷却后放入直径为7mm的新鲜植物病原真菌菌饼，菌面向下，于30℃培养箱中培养40h后测量菌落直径，并以同样体积的培养基代替发酵液作空白对照，计算发酵液对测试真菌生长的抑制率，重复三次。其中，抑制率(％)＝[(对照组菌落平均直径-样品组菌落平均直径)/(对照组菌落平均直径-原始菌片直径)]×100％，菌落直径单位厘米(cm)。
根据发酵液对植物病原真菌炭疽菌、疫霉菌、灰霉菌、镰刀菌及丝核菌的抑制活性，筛选到一株广谱、高效抗真菌活性菌株，经形态、染色、生理生化和16S rDNA序列分析，鉴定为鲍曼氏不动杆菌LCH0606菌株。
实施例二鲍曼菌液的制备方法种子培养基为马铃薯蔗糖培养基，挑取活化的LCH0606单菌落接种到4mL马铃薯蔗糖培养基(15mL试管)培养，37℃、100rpm摇床培养12h。接种1％的种子液于400mL马铃薯蔗糖培养基摇瓶(1L)中，37℃、100rpm摇床培养48-60h，所得菌液经5000-6000rpm离心除菌体后，即为鲍曼菌液。
实施例三鲍曼菌素的制备方法实施例二中所述的鲍曼菌液经大孔树脂X-5吸附、80％乙醇洗脱、减压旋转蒸发干燥，即为鲍曼菌素。大孔树脂用量为鲍曼菌液的1％，上样和洗脱流速为4mL/min。鲍曼菌素得率为568mg/L。
实施例四鲍曼菌液和鲍曼菌素皿内抑菌活性实验1mL实施例二中所述的鲍曼菌液与9mL已溶化的马铃薯蔗糖培养基混匀后，倒入直径为9cm的培养皿中，制成含鲍曼菌液10％的培养平板，然后放入直径为7mm的各种新鲜植物病原真菌菌饼，菌面向下，于30℃培养箱中培养40h后测量菌落直径，并以同样体积的培养基代替上清液作空白对照，计算上清液对各种测试真菌生长的抑制率，重复三次。
抑制率(％)＝[(对照组菌落平均直径-样品组菌落平均直径)/(对照组菌落平均直径-原始菌片直径)]×100％，菌落直径单位厘米(cm)。
用同样的方法测定实施例三中所述鲍曼菌素的抑菌作用，使用浓度为0.1mg/mL；1mg/mL的三唑酮(15％粉锈宁可湿性粉剂)为阳性对照。结果显示鲍曼菌液和鲍曼菌素对各供试植物病原真菌生长的抑制作用与阳性对照三唑酮相当，无显著差异(表1，图1-2)。
表一 鲍曼菌液和鲍曼菌素对植物病原真菌生长的抑制作用(％)
实施例五活性物质的分析实施例三中所述的鲍曼菌素6.85g经硅胶柱层析、氯仿-甲醇梯度洗脱，所得组分进行皿内抑菌实验，根据抑菌结果合并活性组分，减压浓缩至干，得到280mg棕色浸膏。该浸膏用甲醇溶解后用Sephadex LH-20反复纯化，得到白色粉末活性成分40mg。经质谱与核磁共振检测分析，该抗菌化合物为脂肽类化合物，分别为Iturin A2、A3和A6。质谱仪型号VG-ZAB-HS，核磁共振仪型号Bruker AM500FT-NMR，层析硅胶为200-300目。
实施例六鲍曼菌液和鲍曼菌素防治水稻纹枯病害实验(1)皿内实验50粒水稻种子30℃催芽至根长1cm，于近根基部接种直径6mm的丝核菌丝菌饼，同时喷洒2ml不同溶液于接种部位，30℃保温保湿24h，然后移去菌饼，继续培养24h，观察不同处理褐根或黑根长度，评价对水稻纹枯病的控制效果。结果显示鲍曼菌液或鲍曼菌素(1mg/ml)对水稻纹枯病的防治效果与商用杀菌剂达克宁(阳性对照，浓度1mg/ml)相当(图3)。
(2)盆栽实验取萌发后根长2cm左右的水稻幼苗，在根部接种土传真菌病害水稻纹枯病菌，然后分别用实施例二中所述的鲍曼菌液以及实施例三中所述鲍曼菌素溶液(0.1mg/mL)喷淋水稻幼苗根部，以无菌水处理为对照，每组50粒种子，30C培养72h后调查记录纹枯病害侵染情况，按照5级分类标准(0级无病害症状；1级浅灰色病斑，长度小于0.5cm；2级病害褐色病斑，长度0.5cm-1cm；3级别黑色病斑，长度1cm以上，根部受害严重)，计算各组水稻平均病情指数，平均病情指数＝∑[(各级病株数×相对病情级数)]/调查总株数。结果表明鲍曼菌液对水稻纹枯病具有良好的防治作用，浓度为0.1mg/mL的鲍曼菌素溶液对水稻纹枯病也有一定的防治作用(表二)，鲍曼菌液的防效为82％，鲍曼菌素(0.1mg/mL)的防效为48％。
表二、鲍曼菌液和鲍曼菌素对水稻纹枯病菌侵染的防效
实施例七鲍曼菌液对水稻种子萌发的影响挑选健康水稻种子粒，37℃预催芽24h，然后分别用实施例二中所述的鲍曼菌液以及实施例三中所述的鲍曼菌素溶液(0.1mg/mL)30℃浸种12h，以无菌水浸种为空白对照，每组50粒种子。再将处理后的种子置于培养皿中，皿底铺有无菌水润湿的滤纸，30℃培养3d，检测各组处理种子的发芽率、主根长、根毛数和茎长。结果显示鲍曼菌液和鲍曼菌素对水稻种子萌芽没有显著影响，但对根长、根毛数和茎长有一定的促进作用(表三)。
表三、鲍曼菌液和鲍曼菌素对水稻种子萌发的影响
权利要求
1.一种抑制多种植物致病真菌的微生物制剂，其特征在于该生物制剂为鲍曼菌液和鲍曼菌素，生产菌株为鲍曼氏不动杆菌LCH0606菌株(Acinetobacterbaumannii LCH0606)，该菌株已于2006年7月6日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述鲍曼氏不动杆菌LCH0606菌株的制备方法，其特征是从樟树茎干中分离到内生细菌，具体步骤为将植物茎干切成1cm左右的小段，依次浸入75％乙醇和40％甲醛溶液表面消毒各3min，然后用无菌水清洗3次，以除去表面污染杂菌，再用无菌剪刀将茎干沿纵向切开，切面朝下放于马铃薯蔗糖琼脂平板上，每平板5块茎段，共5块平板，30℃培养，逐天观察新菌落的出现，共7天，挑取单菌落，划线纯化，所得菌株经拮抗实验，获得对植物病原真菌炭疽菌、疫霉菌、灰霉菌、镰刀菌及丝核菌有显著抑制活性的菌株——鲍曼氏不动杆菌LCH0606菌株，于-80℃冰箱保藏。
3.根据权利要求1所述的鲍曼氏不动杆菌LCH0606菌株所产生的鲍曼菌液，其特征是鲍曼氏不动杆菌LCH0606菌株的混合发酵液，经5000-6000rmp离心30min后所得的无菌上清液。
4.根据权利要求3所述的鲍曼氏不动杆菌LCH0606菌株所产生的鲍曼菌液的制备方法，其特征是对鲍曼氏不动杆菌LCH0606菌株进行发酵，发酵工艺包括种子液的制备和1L摇瓶发酵，种子液的制备为在15mL试管中加入4mL马铃薯蔗糖培养基，接种后于37℃、100rpm摇床培养12h，然后按1％的种子液接种到400ml的马铃薯蔗糖培养基中，37℃、100rpm摇瓶发酵48h，发酵液经5000-6000rmp离心30min后，所得无菌上清液即为鲍曼菌液。
5.根据权利要求1所述的鲍曼氏不动杆菌LCH0606菌株所产生的鲍曼菌素，其特征是鲍曼菌液经大孔树脂吸附浓缩后所得的浸膏。
6.根据权利要求5所述的鲍曼氏不动杆菌LCH0606菌株所产生的鲍曼菌素的制备方法，其特征是使用大孔树脂吸附浓缩，大孔树脂颗粒大小为100-400，与发酵液体积比为1∶100，流速为4mL/min；洗脱溶剂为80％乙醇，流速为4mL/min，洗脱液用旋转蒸发仪减压浓缩至干，即为鲍曼菌素。
7.根据权利要求1所述的鲍曼氏不动杆菌LCH0606菌株所产生的抗真菌活性物质，其特征是脂肽类物质，经鉴定为Iturin A2，A3和A6。
8.根据权利要求1所述的鲍曼氏不动杆菌LCH0606菌株所产生的鲍曼菌液和鲍曼菌素在防治大豆炭疽病、辣椒疫霉病、番茄灰霉病、小麦赤霉病及水稻纹枯病多种植物病害的应用。
9.根据权利要求1所述的鲍曼氏不动杆菌所产生的鲍曼菌液和鲍曼菌素在促进水稻种子生根、萌芽中的应用。
全文摘要
本发明属于生物农药技术领域。内容包括四个方面(1)鲍曼氏不动杆菌LCH0606菌株(Acinetobacter baumannii LCH0606)的分离与鉴定；(2)鲍曼菌液的制备及其防治植物病害的应用；(3)鲍曼菌素的制备及防病应用；(4)鲍曼菌素有效成分的分析。鲍曼菌液或鲍曼菌素的抗菌活性成分主要为Iturin A，具有杀菌谱广、效果持久、病害不易产生抗药性、植物不会产生药害、生物安全和环境友好等特点，对土壤及叶部真菌，特别是炭疽菌、疫霉菌、灰霉菌、镰刀菌及丝核菌等有显著的防治效果；此外，鲍曼菌液或鲍曼菌素对水稻种子萌发有一定的促生作用。
文档编号A01P1/00GK1973631SQ200610088339
公开日2007年6月6日 申请日期2006年7月12日 优先权日2006年7月12日
发明者刘常宏, 陈欣, 顾玉诚, 王艳艳, 幸颖, 汤城 申请人:南京大学